JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

Abstract

סוכרת סוג 1 (T1D) מאופיין על ידי החסינות העצמית הספציפית איון המוביל הרס תא ביתא ואובדן מוחלט של ייצור האינסולין. במודל העכבר הספונטני ללא שמנים (נוד), האינסולין הוא היעד העיקרי, ומניפולציה גנטית של בעלי חיים אלה כדי להסיר אפירופה של אינסולין מפתח אחד מונע מחלות. כך, חיסול סלקטיבית של אנטיגן מקצועי הצגת התאים (APCs) הנושאת את האפירופה הפתוגניים הזאת היא גישה לעכב את התגובות בלתי רצויות החיסון האוטואימוניות הספציפי, וסביר להניח שיש פוטנציאל טרנסלטילי גדול יותר.

כימאריק קולטני אנטיגן (מכוניות) יכול לנתב מחדש את תאי T ליעד סלקטיבי מחלות הגורמות אנטיגנים. טכניקה זו היא בסיסית לניסיונות האחרונים להשתמש הנדסה סלולרית לטיפול בתאי המאמצת לטיפול בסוגי סרטן מרובים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים ממוטב וירוס T-cell (RV) התמרה ו בפרוטוקול הרחבה מחוץ לגופית המפיקה מספר גבוה של תאים אנטיגן ספציפי CD8-T הספציפיים המתחילים ממספר נמוך של תאים תמימים. בעבר הפרוטוקולים מרובים תא T שתוארו, אבל בדרך כלל עם יעילות התמרה נמוכה יחסית ואת הכדאיות התאים הבאים התמרה. לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו מספק עד 90% יעילות התמרה, ואת התאים שנוצר יכול לשרוד יותר משבועיים בvivo ולעכב באופן משמעותי את התפרצות המחלה בעקבות אינפוזיה אחת. אנו מספקים תיאור מפורט של תחזוקת התא ופרוטוקול התמרה, כך שהשלבים הקריטיים ניתן לעקוב בקלות. ההליך כולו מבידוד התא הראשי לביטוי רכב ניתן לבצע בתוך 14 ימים. ניתן להחיל את השיטה הכללית על כל מודל מחלת העכבר שבו היעד ידוע. באופן דומה, היישום הספציפי (המיקוד של מורכבות מסוג פפטיד/MHC class II) חל על כל מודל אחר של מחלות אוטואימוניות שעבורן זוהתה מתחם מפתח.

Introduction

בהינתן סיכון מופחת סביר של תופעות לא רצויות מחוץ ליעד, אנטיגן ספציפי טיפולים חיסוניים (ASI) מבטיחים טיפולים למחלות אוטואימוניות כגון T1D. צבירת ראיות עולה כי תגובות החיסון (prepro) אינסולין עשוי להיות חשוב במיוחד ב T1D1. בעשור האחרון, מחקרים מקבוצות מרובות, כולל שלנו, מציעים בחריפות כי הצגת אפירופה המכיל את חומצות אמינו שרשרת אינסולין B 9 עד 23 על ידי מולקולות ספציפיות mhc class II (ב: 9-23/mhcii), ממלא תפקיד חשוב בפיתוח T1D ב . עכברים ואנשים2,3,4,5 כדי באופן סלקטיבי למקד את B: 9-23/MHCII קומפלקס, יצרנו נוגדן חד שבטיים, בשם mAb287, כי אין לו לחצות את ההורמון אינסולין או מכלולי מתחמים המכילים פפטידים אחרים6. MAb287 חוסם אנטיגן מצגת בתחום החוץ, והמינהל השבועי של mAb287 כדי לקדם סוכרת עכברים הנהון הפיתוח של T1D ב 35% העכברים שטופלו6. כדי לחסום את המצגת אנטיגן ב vivo, זריקות תכופות נדרשים בדרך כלל כדי לשמור על ריכוז במחזור גבוה. אנו שיערו כי אנחנו יכולים להתגבר על הקושי הזה על ידי ניצול של הספציפיות של Ab287 כדי לתכנת מראש את התאים T, ובכך לספק טיפול משופר אנטיגן תא T עבור T1D7.

תאים T ציטוטוקסיים דיווחו להיות מסוגלים להרוג את היעד שלהם אם אפילו עותק אחד של קנצוני שלהם ליגנד מבוטא8,9,10. לפיכך, B: 9-23/MHCII CD8 T ספציפי תאים צפויים להיות יעילות גבוהה יותר ביטול מצגת אנטיגן לא רצויות מאשר הנוגדן ההורה, אשר ככל הנראה צריך לאגד מתחמים מרובים על הנגמ אותו כדי להפעיל את השפעתו. תאי T מכונית שימשו לטיפול בסרטן אנושי מרובים11,12,13, וייתכן גם יעיל בחסינות עצמית14. עם זאת, מכונית-T תאים עם ספציפיות עבור מכלולי פפטיד-MHC הפתוגניים לא עד כה שימשו כדי לשנות את ההתקדמות של T1D. באמצעות טכניקת התמרה ממוטבת של CD8 T המתוארים להלן, הדגמנו לאחרונה הוכחת העיקרון שזה אכן מייצג גישה בת7.

בפרוטוקול זה אנו מתווה התמרה ושיטת התרחבות יעילה ומפושטת. הפרוטוקול שלנו חל על מחקרים אחרים הדורשים את הדור של העכבר CD8 T תאים עם יעילות גבוהה.

Protocol

עכברים שמרו בתנאים מסוימים ללא פתוגן במתקן העכבר הטרנסגניים, וכל ניסויי בעלי החיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המכללה האקדמית לרפואה של ביילור לטיפול בבעלי חיים וועדת השימוש.

הערה: הניסוי דורש הכנת הווירוס ואת התאים T במקביל. טבלה 1 מסכמת את הפרוטוקול. הריאגנטים והמאגרים העיקריים רשומים בטבלת החומרים. אנו מתמקדים בדור והתרחבות של תאי רכב-T מיקוד אוכלוסיות ספציפיות של APCs בפרוטוקול זה.

1. הדור והאימות של הנוגדן הFab שרשרת יחיד (scFab)-מכוניות.

הערה: מכוניות מכילות בדרך כלל 3 תחומים קריטיים — קבוצת מחשבים לפילוח אנטיגן, תחום מרווח/ממברנה ותחום איתות cytoplasmic. העיצוב המדויק של כל רכב תלוי במטרה המיועדת, ולכן, מלבד התכונות המרכזיות של המבנה הרלוונטי לדור הרטרווירוס, לא יתואר בפרוטרוט בפרוטוקול זה. העיצוב הכולל של המכוניות המשמשות למחקרים המתוארים להלן מוצג באיור 1. בקיצור, תחום המיקוד כולל את שרשרת האור והמשתנה ואת התחום CH1 של השרשרת הכבדה של נוגדן מונובטיים ההורה מקושר על ידי מקשר חצי נוקשה. תחום החלל/הטרנסג הוא מהעכבר CD28, והתחום האיתות הוא היתוך המכיל אלמנטים מהעכבר CD28, CD137 (4-1BB) וCD247 (CD3ζ). אלמנטים אלה מורכבים על ידי הליכים מולקולריים סטנדרטיים כגון אחוי חפיפה תגובת שרשרת פולימראז (PCR), או סינתזה של "לחסום גנים" מתאים. פרטי הדור של mAB287 CAR כלולים בז ואח '7. את רצפי ה-Dna ניתן להשיג מן המחברים על פי דרישה.

  1. הרכבת מבנה רכב
    1. לסנתז את המטרה המכוונת שרשרת יחידה בודדת (scFab) ומשולב מרחב/איתות תחומים בנפרד, ולהשתמש "3 נקודה" בטכניקת הרכב15 להרכיב את המבנה הסופי (איור 1).
      הערה: הדרישה המפתח להכנסת הרכב היא שהיא צריכה להכיל אתרים הגבלת הגבלה האזורים המאפשרים להתיר לתוך הביטוי הretroviral יעיל וקטור pMSCV-IRES-gfp Ii (pmig ii),או נגזרת נגזרים קשורה גם מתאים.
  2. ואלידציה של ביטוי משטח הרכב
    1. שינוי התאים היפידים באמצעות החלקיקים הנגזרים מסוג pMIG II שנוצרו על ידי פרוטוקול סטנדרטי (לדוגמה, הולסט ואח '16).
    2. הפעל את הניתוח cy, לנסות לזהות את הביטוי של GFP מתוך וקטור רכב17.
    3. כתם משטח הביטוי של המכונית של התמרה hybridomas באמצעות נוגדנים מתויג נגד שרשרת κ העכבר (g., שיבוט RMK-45)17.
      הערה: 18.
  3. ואלידציה של מכונית ספציפיות
    1. לעורר את התאים יפידים ed עם לוחית מתאים או אנטיגנים סלולריים. אחרי שיתוף תרבות לילה לאסוף את הסופרנטנים וציטוקינים מופרש, והוא מקבל על ידי האנזים מקושר אנזימים מקושרים (אליסה)7.
      הערה: באופן אידיאלי, כל מכונית צריכה להיות מאומתת באופן עצמאי לפני השימוש התמרה. בשלב זה, הניסוי עשוי להיות מושהה ומופעל מחדש מאוחר יותר.

2. העברה של תאי מפיק ויראלי (יום-4 עד יום 3)

הערה: רטרו וירוס מופק באמצעות הפניקס-ECO תאים (לראות את הטבלה של חומרים)19,20. השתמש באמצעי זהירות מתאימים עבור הדור של סוכנים שעלולים להיות מדבקים (רצוי כולל ארון BSL-2 ייעודי ומאינקובטור נפרד לתאים בעלי מדידה/התמרה).

  1. התאגף הפניקס תאים (יום-4)
    1. הפשרת 2 x 106 תאים פיניקס-אקו. לשנות את מספר תאי הפניקס אם התמרה מרובים מתוכננים.
    2. לוחית אותם בצלחת 10 ס מ רקמת העור עם 10 מ ל של בינונית (מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS)).
  2. מעבר הפניקס תאים (יום-3)
    1. להסיר בינוני, ולשטוף עם 5 מ ל של מלוחים באגירה פוספט של Dulbecco (DPBS).
    2. הוסף 3 מ ל של 0.25% טריפסין ו דגירה ב 37 ° צ' תחת 10% CO2 אווירה עבור 3 דקות.
    3. לקצור את התאים ולאחר מכן הגלולה על ידי צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 200 x g. לוחית מחדש תאים עם 10 מ"ל מדיום טרי ו-מודטה ב 37 ° c.
  3. הקרנה של תאי הפניקס (יום-אחד אחר הצהריים)
    1. כדי למזער את חלוקת התא הנוסף, לאסוף את התאים הפניקס כפי שמתואר בשלב 2.2, השעיה מחדש ב 5 מ ל של בינוני, ו גמא מקרין תאים על קרח (1000 rad).
      הערה: יש להשתמש בזהירות לעבודה רדיואקטיבית כדי למנוע חשיפה לכוח אדם.
    2. צנטריפוגה את התאים לקרינה, להשעות מחדש בינוני טרי, צלחת ב 2 x 106 תאים (ב 10 מ ל בינוני)/plate/CAR, ו דגירה.
  4. מעבר החצייה (יום 0-בוקר)
    1. מפחית את הסופרנטנט מתאי הפניקס, לשטוף עם 5 מ ל של מלוחים באגירה פוספט (PBS), ובזהירות להוסיף 7 מ ל של סרום מופחת בינוני (למשל, Opti-מזכור) dropwise לקיר צדדי של הצלחת כדי למנוע הפרעה המונאולייר. . להעביר תאים בחזרה לאינקובטור
    2. קח 2 14 mL בסיבוב התחתון צינורות פוליפרופילן, ולהוסיף 1.5 mL של מדיום סרום מופחת לכל. לצינור אחד, הוסף 40 μL של מגיב החצייה (עיין בטבלת החומרים).
    3. לצינור השני, להוסיף 15 μg של Ab-CAR-פלמיד (שנוצר בשלב 1) ו 5 μg של מעטפה ואריזה פלמיד (5 μg pCL-Eco). מודקון צינורות בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
    4. מוסיפים את התערובת הכימית משלב 2.4.2 dropwise לצינור השני מבלי ליצור קשר עם הצדדים הצינור, ולערבב ידי ליטוף את הפתרון למעלה ולמטה בעדינות 3 פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר לפחות 20 דקות.
    5. הוסיפו 3 מ ל של התערובת לתאי הפניקס, והניחו בחממה לתרבית רקמות.
    6. לאחר 4 – 5 שעות הוסף 1 מ ל של FCS. תאי תרבות ללילה ב-37 ° c.
  5. שינוי בינוני (יום 1)
    1. הסר את הסופרנטנט המכיל את התסביכים המניידית הפלסטיות והיפטר מהם בהתאם לנהלים מוסדיים לטיפול בחומרים מדבקים. הוסף 4 מ ל של מדיום טרי, טרום מחומם בינוני לתאים.
  6. וירוס קציר לצורך התמרה (יום 2)
    1. לאסוף את בינוני המכיל את הווירוס מתאי הפניקס עם מזרק סטרילי, מסנן (0.45 μm) כדי להסיר פסולת תא שיורית, ולאסוף בצינור חדש.
    2. הוסף מלאי rhIL-2 לריכוז סופי של 200 IU/mL. השתמש בווירוס מיד לצורך התמרה (שלב 5.3). הוסף 4 מ ל של בינוני טרי לתאי הפניקס ומקום בחממה.
  7. אוסף וירוס חוזר (יום 3)
    1. חזור על השלב 2.6, אבל להיפטר התאים הפניקס כפסולת זיהומיות במקום להוסיף מדיום טרי. הסופרנטאנט הזה משמש בשלב 5.4.

3. בידוד תא CD8 T ראשי והפעלה (יום -1 עד יום 0)

הערה: בעבר, לאסוף תאים CD8 T מן הנשי עכברים נוד ב 4 – 5 שבועות, נקודת זמן לפני דלקת איון מתחיל21,22. לטפל בכל העכברים הבאים הפרוטוקולים המאושרים של IACUC. תאי T CD8 מועשרים מטחול באמצעות ערכת בחירה שלילית מסחרית.

  1. לוחות ציפוי עם CD3/CD28 נוגדנים (Day-1)
    1. הוסף 1 מ ל של תערובת של אנטי עכבר CD3 ו CD28 נוגדנים (שניהם ב-1 μg/mL ב-PBS) לכל טוב של צלחת 24-הבאר, ו דגירה ב 4 ° c בלילה.
    2. למחרת, לשטוף את הצלחות עם 1 mL של PBS סטרילי 3 פעמים לפני הוספת תאים CD8 T murine (שלב 4.1).
      הערה: מספר הבארות להיות מצופה ישתנה לכל ניסוי, בהתאם למספר הכולל של התאים הפעילים CD8 T הנדרשים.
  2. גביית טחול (יום 0)
    1. המתת חסד שתי עכברים נקבה הנהון בגילאי 4 – 5 שבועות באמצעות שאיפת CO2 ואחריו עריפת ראש. לקצור את טחולים ולשים אותם על מסננת תא לספוג 10 מ ל PBS בצלחת תרבות התא על הקרח.
    2. במכסה של תרבות התא, חותכים כל טחול לתוך 3-5 חתיכות, לחץ על רקמות עם בוכנה סטרילית של 3 או 5 מ ל מזרק כדי לכפות שברי הטחול לגזרים ולאפשר לתאים לעבור דרך רשת התיל.
    3. בעדינות להסיר את כדוריות הדם האדומות על ידי השעיית הטחול בשנת 1:4 מדולל לפירוק התא האדום מאגר (1 mL של מאגר הליזה ב 3 מ ל של PBS עבור טחול אחד), ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. לאחר מכן, לדלל 10 μL של הבולם התא עם טרימין כחול פתרון הצבע עבור ספירת תאים עם הומוציטומטר, ואת הגלולה שאר התאים על ידי צנטריפוגה ב 350 x g עבור 7 דקות.
  3. העשרת תאי CD8 T (יום 0)
    1. העשרת תאים CD8 T על-ידי בחירה שלילית באמצעות העכבר CD8 T ערכת בידוד תא, בעקבות הוראות היצרן.
      הערה: כדי להבטיח שטוהר גבוהה תמיד לעגל את מספרי התאים בעת חישוב הנפח של הנוגדן biotinylated להתווסף (למשל, השתמש בנפח של ריאגנטים הציע עבור 108 תאים עבור מחושב 9.1 x 107 תאים).
    2. להשעות את כדורי התא ב-400 μL של מאגר ו 100 μL של ביוטין-הנוגדן קוקטייל לכל 1 x 108 תאים, מערבבים היטב ומארג עבור 5 דקות במקרר (4 ° c) כדי לאפשר כריכת נוגדנים.
    3. הוסף 300 μL של מאגר תיוג ו 200 μL של anti-biotin מיקרו חרוזים לכל 1 x 108 תאים, מערבבים היטב ו-דגירה עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    4. בעת המתנה לאיגוד המיקרו-חרוז, הגדר את עמודת ההפרדה על המפריד. שטוף עמודה על-ידי שטיפה עם 3 מ ל של מאגר תיוג.
    5. לעבור 1000 μl של התערובת חרוז/תא דרך מסננת תא 40 יקרומטר לפני טעינת על עמודת ההפרדה כדי להסיר אגרגטים תאים. לאסוף את העמודה זרימה-דרך לתוך צינור מקורר 15 מ"ל.
    6. לשטוף את הטור כפי שהורו היצרן, איסוף כל הקולחים לתוך אותה צינורית. לקבוע את מספר התא (זהה לשלב 3.2.4) ולאסוף על ידי צנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות. לשטוף את התאים על ידי השעיית מחדש 2 מ ל של בינונית תא T מלאה (RPMI-1640 המכיל fcs, 2-mercaptoethanol, rhil-2 (200 U/ml), מיל -7 (0.5 ng/ , HEPES ו פניצילין-סטרפטומיצין) ו תפרידו ב 350 x g עבור 5 דקות.
    7. השהה מחדש את התאים מראש מחומם (37 ° c) להשלים תא T בינונית בריכוז של 0.25 – 0.5 x 106/Ml.

4. T הפעלת תא (היום 0 כדי 2)

  1. הוסף 2 מ ל של ההשעיה התא (0.25 – 0.5 x 106/mL) כל הבאר מצופה היטב CD3/CD28 נוגדן מצופה צלחת 24-באר משלב 3.1.2. השתמש בתנועה מתערבל כדי לוותר על התאים באופן שווה.
    הערה: הוסף את התאים באמצעות תנועה מתערבל כדי להפיץ אותם באופן שווה ולמזער את אפקטי הקצוות. אם התאים מצרר לאורך קצה הבארות, הן שיעור התמרה והכדאיות של התא יופחתו.
  2. כפקד, צלחת מספר זהה של תאים CD8 T לתוך הבאר אחת ללא מצופה של הצלחת. דגירה את התאים ב 37 ° צ' באמצעות 10% CO2 חממה מתודלק עבור 48 h.
    הערה: לאחר 48 h, ניתן לאשר הפעלה באמצעות מיקרוסקופ; התאים הפעילים יהיו גדולים יותר מאשר התאים שאינם נתקלים בנוגדנים anti-CD3/CD28.

[מקום דמות 2 כאן]

5. התמרה הCD8 של תאי T מופעלים (ימים 1 עד 3)

הערה: פרוטוקול זה משתמש בשיטת התמרה-טווח. צנטריפוגה עם הרוטור החוצה הנדנדה לוחית הלוח מתאמי העור כי הוא מסוגל לשמור על טמפרטורה פנימית של 37 ° c נדרש. כדי להבטיח יעילות מירבית, ביום התמרה מראש לחמם את הצנטריפוגה עד 37 ° צ' לפני איסוף הווירוס.

  1. הכנה של הצלחות הציפוי האנושי (יום 1 עד יום 2)
    1. ביום 1, להוסיף 0.5 mL של fibronectin (50 μg/mL ב-PBS) אל הבארות של צלחת 24-באר, ו מודלת לילה ב 4 ° c.
      הערה: בדרך כלל, שתי בארות מצופות fibronectin נדרשות לכל צלחת של תאי פיניקס מזוהמים.
    2. ביום 2 להסיר את הפתרון fibronectin, ולהחליף עם 1 mL של 2% בסרום שור (BSA) ב PBS. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות "לחסום" אתרי איגוד לא ספציפיים.
    3. שוטפים את הבארות שטופלו עם 1 מ ל של הערוץ הסטרילי. לאחר הסרת פתרון השטיפה, הצלחת מוכנה לשימוש; או, ניתן לחתום ולאחסן ב-4 ° צ' עד שבוע אחד.
  2. אוסף של תאים CD8 T שהופעלו (יום 2)
    1. לקצור את התאים CD8 T המופעל, לספור ולחשב את הכדאיות התאים באמצעות טריאו כחול או מכשיר אוטומטי מתאים.
    2. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ולהשעות מחדש 5 x 106 תאים קיימא/mL עבור התמרה. לשמור על סדרת מחלקים קטן של תאים בתרבות במדיום התא המלא T ב החממה CO2 כדי לספק שליטה לאחר הפעלת זריחה מיון התא של התאים התמרה (שלב 6).
      הערה: לאחר ההפעלה עבור 48 h, מספר התאים הכולל היה צריך לגדול על ידי כ 1.5 לקפל, ויש להם יכולת גדולה יותר 95%.
  3. התמרה חושית (יום 2)
    1. הוסף 100 μL של השעיית תא CD8 מופעל לכל טוב (0.5 x 106 תאים) לצלחת מצופה fibronectin. ואז להוסיף 1.5 – 2 מ ל של וירוס המכיל בינוני (משלב 2.6) לכל טוב. מערבבים באמצעות תנועה מתערבל כדי לוותר על התאים בצורה שווה (איור 2).
    2. הניחו את הצלחת בשקית ניילון-lock (zip) ובאטם (כדי לספק בלימה משנית). צנטריפוגה ב 2000 x g עבור 90 דקות ב 37 ° c.
    3. . תסיר את הצלחת מהצנטריפוגה בביטחון הביולוגי, הקבינט להסיר בזהירות את השקית פלסטיק ולהבטיח כי החלק החיצוני של הצלחת אינו מזוהם עם כל מדיום.
    4. ואז להעביר את הצלחת לחממה ייעודי 37 ° c2 . לאחר 4 שעות, להסיר 1 mL של המדיום מכל באר ולהחליף עם 1 מ ל של מדיום מראש להשלים תא T. החליפו את הלוחית בחממה של CO2 .
      הערה: טפל בכל המדיה מתוך התאים המתמרים כפסולת זיהומית.
  4. התמרה שנייה (יום 3)
    1. בארון הבטיחות הביולוגי המסור, שיפוע הצלחת המכילה את התאים מתתמרים על ידי מנוחה על המכסה ובזהירות להסיר את רוב המדיום (עוזב 100-200 μL) לוודא שלא ליצור קשר עם התאים בתחתית הבאר.
    2. הוסף את המדיום המכיל את הווירוס שנאסף בשלב 2.7, וחזור על שלבים 5.3.2 – 5.3.4.
      הערה: בניסיון שלנו, התמרה שלישית לעתים רחוקות משפרת את היעילות הכוללת. בנוסף, הכדאיות בתאים עלולה לרדת באופן משמעותי אם נעשה שימוש בהצללה שלישית. אם התאים מצופים בריכוז גבוה יותר מ-0.5 x 10ו-ובכן, תאי T יכולים להגיע למפגש אחרי הדגירה לילה לאחר שלב התמרה השני. במקרה זה, לפצל את התאים לאחר 4 h הדגירה ביום 3.
  5. שטוף תאים (יום 4)
    1. הסר 1 מ ל של בינוני מכל באר, השהה מחדש את התאים באמצעי הנותר והעבר לשפופרת של 15 מ ל. לשטוף את הבארות עם 1 מ ל של בינונית תא T מלאה ולהוסיף את הצינור המכיל את התאים במאגר מכל התמרה.
    2. צנטריפוגה ב 350 x g עבור 7 דקות, לאחר מכן לשטוף פעמיים על ידי השעיית מחדש 2 מ ל של מדיום תא T מלאה ומכשיר. לבסוף להשעות מחדש 2 מ ל של בינוני ולקבוע את מספר התא.
      הערה: אם 1 x 106 תאים הותמרה במקור, התשואה בשלב זה צריכה להיות ~ 3 x 106.
  6. עברת
    1. העברת שורות של 0.5 – 1 x 106 תאים ב 2 מ ל של בינונית תא T להשלים את הבארות של צלחת 24-באר חדש ו מודטה ב 37 ° c. כ-48-72 שעות לאחר התמרה התאים מוכנים לניתוח ביטוי רכב ומיון תאים.
      הערה: מספר הרכב-T בתאי בדרך כלל מכפיל כל 24 h בשלב זה. זה קריטי לא לתת להם לגדול יותר מדי. פצל את התאים מיד אם הצפיפות גבוהה מ-2 x 106/mL (או אם המדיום אי פעם הופך לצהוב בהיר). בניסיון שלנו התאים רכב-T מתרבים יותר מכבש ב 24-ובכן ו 12-צלחות לוחות מאשר אם הועברו כלי גדול יותר.

6. טיהור תאים שעברו התמרה על-ידי תא מיון (FACS) (יום 5 או יום 6)

  1. לאסוף את התאים.
    1. להשעות את התאים על ידי ליטוף למעלה ולמטה פעמים מרובות (לקיחת לטפל לא לגרום frothing), העברה 15 צינורות mL ו צנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות.
    2. השהה מחדש במאגר המיון (2% BSA בערוץ PBS סטרילי המכיל gentamicin) ב-1 x 106 תאים/mL. גם לקצור את השליטה (לא התמרה) תאים CD8 T משלב 5.2).
      הערה: מ-1 x 106 תאים ביום 2, תשואה של ~ 2 x 107 התמרה תאים צפוי בשלב זה זמן.
  2. לשטוף את התאים פעם אחת עם מיון מאגר על ידי תפרידו ב 350 x g עבור 5 דקות, ולהשעות מחדש ב 1 x 107 תאים/mL במאגר מיון. הסר סדרת מחלקים קטן עבור בקרת פיצוי Foxp3gfp (כדי לשמש בשלב 6.4.1), ולהכתים את השארית עם מתויג אנטי עכבר CD8 (שיבוט 53-6.7; 0.2 μg של נוגדן/5 x 106 תאים) על ידי דגירה של 20 דקות ב 4 ° c.
    1. באופן דומה, כתם סדרת מחלקים של תאים CD8 T שאינם מתתמרים כדי לספק בקרת פיצוי עבור fluorophore תיוג הנוגדן anti-CD8.
      הערה: הימנע הוספת נתרן אזיד לכל מאגר, כמו זה רעיל לתאים.
  3. שטוף את התאים המסומנים פעמיים עם מאגר מיון, השהה מחדש במאגר מיון קר ב-1 x 107 תאים/mL.
  4. . מיין את התאים
    1. מיין CD8 GFP+ תאים חיוביים לתוך מקורר לחלוטין תא T בינונית להשלים (איור 3b). קח משלוח קטן לניתוח שלאחר המיון כדי לקבוע את הטוהר.
      הערה: כדי למקסם את טוהר התאים ממוינים השערים צר יש להשתמש. השתמש בזרבובית 100 יקרומטר כדי להבטיח קיום תאים גבוה. מזער את משך הזמן שבו התאים הממוינים נשמרים בקרח. תאי T שנשמרו על קרח יותר מ 3 שעות לוקח הרבה יותר זמן להתאושש מאשר תאים מקורר עבור פחות מ 2 h. לפיכך, אם שלוש קווי מעבר התמרה צריך להיות מיון, לאסוף ולתייג את הקו השני בזמן שהראשון ממוין וכך הלאה ולא באמצעות הקווים השני והשלישי לבלות זמן ממושך ב 0 ° c. ביטוי של סמני תא T אחרים כגון CD28 ו-CD3 יכולים גם להיות תחת פיקוח (איור 3C) אך אינו חיוני למטרות מיון.
    2. (אסטרטגיית מיון אלטרנטיבית) לפני הצביעת אוכלוסיית הצובר, יש לנתח את הביטוי CD8 של אוכלוסיה קטנה של תאי T המותמרים. אם הטוהר הוא > 99% אז האוכלוסיה בצובר ניתן למיין בבטחה רק על בסיס של ביטוי GFP.

7. הרחבת מיון מכונית-T (יום 5 עד 10)

  1. רכב-T הרחבה תא
    1. לשטוף את התאים רכב-T ממוין פעם אחת, ואז להשעות מחדש בינונית טרום חמם מלאה של התא ב 2.5 – 5 x 105 תאים/ml, ולוחית 2 mL לוחיות בצלחות 24-טוב.
    2. לספור ולפצל את התאים כל 1 – 2 ימים. בדרך כלל מספר התא מכפיל כל יום עד ~ יום 10, עם כדאיות שנותרה מעל 95%.
      הערה: ללא גירוי מחדש, התאים CAR-T יפסיקו להתרבות סביב יום 10 ובסופו של דבר למות. לפיכך, תא T פונקציונלי והעברות המאמצת צריך להיות מתוזמן בהתאם.
  2. אסטרטגיית הרחבה אלטרנטיבית
    1. לאחר מיון, התרבות של התאים CAR-T בינונית תא T מלאה המכילה rhIL-2 ב 100 U/mL ולא 200 U/mL.
      הערה: מכונית-T תאים מתרבים בקצב איטי מעט במדיום זה. עם זאת, הם לעתים קרובות ממשיכים להתרבות עד ימים 11 עד 13 ללא גירוי מחדש. כך, למרות אסטרטגיית הרחבה חלופית זו אינה מפיקה מספר גבוה יותר של תאים הוא מספק חלון זמן מעט ארוך יותר עבור במורד הזרם אומר להתבצע.

8. אימות הספציפיות של אנטיגן ותפקודיות של תאי רכב T.

הערה: ניתן לאמת את האיגודים המחייבים של תאי מכונית T המכוונת על מכלולי פפטיד/mhc באמצעות צביעת הטטרמר7,23. באופן דומה, הפונקציונליות שלהם יכולה להיות מאושרת על ידי מדידת הפרשת ציטוקין או הרעלת ציטוזה בעקבות גירוי על ידי ליגניות הקנצוני שלהם. מתקן הליבה NIH טטרמר (TCF) באוניברסיטת אמורי הוא מקור מומלץ של "טטרמרס" ופרוטוקולי הצביעת הרלוונטיים.

  1. פפטיד-MHC . צביעת טטרמר
    1. התווית ali, של 2 x 105 התמרה מכונית-T תאים ב-100 μl של מיון מאגר על ידי הדגירה עם ~ 0.6 μg של פלואור התווית באמצעות אנטיגן ספציפי ושליטה הטטרמרס ב 37 ° צ' עבור 2 h.
    2. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g, ולאחר מכן לשטוף פעמיים על ידי השעיית מחדש ב 0.5 mL של מיון מאגר ו-re-תפרידו. לבסוף, להשעות מחדש את התאים ב-300 μL של מיון מאגר ולנתח על-ידי זרימה cy, מנסה (איור 4).
      הערה: עבור מחקרים אלה, אנחנו בדרך כלל להשתמש BV421-התווית iag7-B:9-23 (RE) (מבחן) ו iag7-הל (בקרת) הטטרמרס. עם זאת, כל שילוב fluorophore/טטרמר המתאים לרכב (s) תחת חקירה ניתן להשתמש במקום. במקרה זה, את הזמן ריכוז ומכתים צריך להיות מותאם עבור כל הטטראמר בשימוש. הן תאים מיון ולא ממוין בתאי T מיון ניתן להשתמש לצביעת טטרמר.
  2. מדידה ספציפיות של ליגציה וגירוי.
    1. דגירה 2 x 105 מיון רכב-t תאים ב 200 μl של cy, חינם תא t בינונית עם לוחיות המתאימות מאוגד או סלולרי ליגנדס.
    2. לאחר 6 – 24 למדוד הפקה cy, על ידי אליסה או תאיים מכתים באמצעות פרוטוקולים של היצרן.
      הערה: ללימודים שלנו של IAg7-b:9-23 הופנה מחדש תאים, אנחנו התרבות התאים בלילה עם M12C3 murine B-cell תאים לימפומה ביטוי IAg7-b:r3 או "ריק" iag724,25, לאחר מכן לאסוף את הסופרנטנים ולמדוד את העכבר המופרש אינטרפרון גמא (IFN-γ) על ידי אליסה26 (איור 5).

תוצאות

בדרך כלל, יעילות התמרה באמצעות פרוטוקול זה היא ~ 60-90%. בניסוי המוצג באיור 3, לפני מיון בקירוב, 70% של התאים CD8 T ביטא שיתוף gfp. הם גם הביע שיתוף CD28 ו CD3 (איור 3C). חשוב מכל, כל "מבחן" GFP+ תאים גם מוכתם עם IAg7-b:r3 טטרמרס, אבל לא עם השליטה הטטרמר (

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להפקת תאים CD8-T ספציפיים אנטיגן על-ידי התמרה ויראלית. יעילות התמרה של הפרוטוקול שלנו היא בדרך כלל גבוהה, וביטוי חזק של המכונית הוא נצפתה בדרך כלל. תאי T רכב מורחב לשמור את התכונות החיוניות של התאים המופעל על-ידי ההורה, וספציפיות נוגדנים, ומתאימים הן בתוך מבחנה והן ?...

Disclosures

MAb287 והנגזרים מוגנים על ידי פטנט אמריקאי שהונפק ב-2014.

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך על ידי JDRF מענקים 1-INO-2015-74-S-B, 2-סרה-2016-238-S-B, והסרה-2-S-2018-648-S-B, החינוך סוכרת הפרס פעולה, ואת החוק קרוליין Wiess למחקר ברפואה מולקולרית ביילור המכללה לרפואה. מיון התא היה נתמך על ידי Cy, ליבת מיון התא ביילור המכללה לרפואה עם מימון NIH (S10RR024574 ו P30CA125123). כל ה-פפטיד-MHC טמרס הושגו ממתקן הליבה של NIH טטרמר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (50mM)Gibco21985-02350 μM
5’ RACE PCRClontech634859
anti-mouse CD28 antibodieseBioscience14-0281-86final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibodyeBioscience145-2C11final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences554410Working concentration at 0.5 µg/ml
BSASigmaA7030
Endo-free Maxi-Prep kitQiagen12362
GentamicinGibco15750-060Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCSHycloneSH30087.03Final 10% FCS
HEPES (100X)Gibco15630-0801X
IAg7-CLIP tetramer-BV421NIH tetramer Facility at Emoryper approvalWorking concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421NIH tetramer Facility at Emoryper approvalWorking concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)ThermoFisher51500056Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Separation BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation KitMiletenyi Biotec Inc130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation KitMiltenyi Biotec130-104-075
Opti-MEM mediumThermoFisher31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)ThermoFisher1507006350 U/ml
Phoenix-ECO cellsATCCCRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco10010-023
pMIG IIAddgene52107
pMSCV-IRES-GFP IIAddgene52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences551216Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis bufferSigmaR7767
RetroNectinTakaraT100AWorking concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)Peprotech200-02Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)R&D407-ML-005Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640Gibco11875-093
Sterile Cell StrainersFisher Scientific22-363-548
TrypleGibco12605-028

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
  2. Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
  3. Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
  4. Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
  5. Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
  6. Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
  7. Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
  8. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
  9. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
  10. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
  11. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  12. Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
  13. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
  14. Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
  15. Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
  16. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
  17. Johnstone, A., Thorpe, R. . Immunochemistry in practice. , (1996).
  18. Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. . Lymphocytes: a practical approach. , (2000).
  19. Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
  20. Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
  21. Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).
  22. Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
  23. Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
  24. Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
  25. Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
  26. Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1501CD8 T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved