توليف أوليغوساكاريد ذو الوعاء الواحد الهرمي والقابل للبرمجة

Summary

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام برنامج Auto-CHO للتوليف الهرمي والقابل للبرمجة وعاء واحد من oligosaccharides. كما يصف الإجراء العام لتجارب تحديد RRV وغليكوزيل وعاء واحد من SSEA-4.

Abstract

تقدم هذه المقالة بروتوكول تجريبي عام لتوليف oligosaccharide وعاء واحد للبرمجة ويوضح كيفية استخدام برنامج Auto-CHO لتوليد الحلول الاصطناعية المحتملة. تم تصميم نهج التوليف oligosaccharide وعاء واحد للبرمجة لتمكين توليف oligosaccharide سريع من كميات كبيرة باستخدام كتل البناء ثيوغليكوزيد (BBLs) مع الترتيب التسلسلي المناسب لقيم التفاعل النسبي (RRVs). Auto-CHO هو برنامج عبر منصة مع واجهة المستخدم الرسومية التي توفر الحلول الاصطناعية الممكنة للبرمجة واحد وعاء oligosaccharide التوليف عن طريق البحث في مكتبة BBL (تحتوي على حوالي 150 التحقق من صحة و > 50،000 BBLs الظاهري) مع توقع بدقة RRVs من خلال دعم الانحدار ناقلات. تم تنفيذ خوارزمية التوليف الهرمي وعاء واحد في Auto-CHO ويستخدم الشظايا التي تم إنشاؤها بواسطة ردود الفعل وعاء واحد كBBLs جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح Auto-CHO للمستخدمين بإعطاء ملاحظات لBBLs الظاهري للحفاظ على تلك القيمة لمزيد من الاستخدام. ويتجلى في هذا العمل تركيب وعاء واحد للمستضد الجنيني الخاص بالمرحلة 4 (SSEA-4)، وهو علامة متعددة القوى للخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

Introduction

الكربوهيدرات هي في كل مكان في الطبيعة^1،2، ولكن وجودها وطريقة العمل لا تزال منطقة مجهولة ، ويرجع ذلك أساسا إلى صعوبة الوصول إلى هذه الفئة من الجزيئات³. على عكس التوليف الآلي للoligopeptides وoligonucleotides، لا يزال تطوير التوليف الآلي للoligosaccharides مهمة هائلة، وكان التقدم بطيئا نسبيا.

لمعالجة هذه المشكلة، وضعت وونغ وآخرون أول طريقة آلية لتركيب oligosaccharides باستخدام برنامج برنامج للبرمجة يسمى Optimer⁴، والذي يوجه اختيار BBLs من مكتبة من ~ 50 BBLs لتسلسل وعاء واحد ردود الفعل. تم تصميم كل BBL وتوليفها مع التفاعل محددة جيدا ضبطها من قبل مختلف مجموعات الحماية. وباستخدام هذا النهج، يمكن التقليل إلى أدنى حد من تعقيدات حماية التلاعب والتنقية الوسيطة أثناء التوليف، التي اعتبرت أصعب المسائل التي ينبغي التغلب عليها في تطوير التوليف الآلي. على الرغم من هذا التقدم، لا تزال الطريقة مقيدة جدا، كما أن عدد BBLs صغيرة جدا وبرنامج Optimer يمكن فقط التعامل مع بعض oligosaccharides الصغيرة. لمزيد من القلة المعقدة التي تتطلب المزيد من BBLs ويمر متعددة من ردود الفعل وعاء واحد وتكاثف جزء، وقد تم تطوير نسخة مطورة من البرنامج، لصناعة السيارات في CHO^5،.

في Auto-CHO، تمت إضافة أكثر من 50,000 BBLs مع تفاعل محدد إلى مكتبة BBL، بما في ذلك 154 الاصطناعية و 50,000 منها الظاهري. تم تصميم هذه BBLs من قبل التعلم الآلي على أساس الخصائص الأساسية، والتحولات الكيميائية NMR المحسوبة^6،7،والواصفات الجزيئية^8،والتي تؤثر على هيكل وتفاعل BBLs. مع هذا البرنامج ترقية ومجموعة جديدة من BBLs المتاحة، يتم توسيع القدرة التوليفية، وكما هو مبين، يمكن إعداد العديد من oligosaccharides من الفائدة بسرعة. ويعتقد أن هذا التطور الجديد سوف يسهل تركيب oligosaccharides لدراسة أدوارهم في مختلف العمليات البيولوجية وآثارها على هياكل ووظائف البروتينات السكرية والدهون السكرية. ويعتقد أيضا أن هذا العمل سيعود بالفائدة على مجتمع العلوم السكرية بشكل كبير، بالنظر إلى أن هذه الطريقة متاحة لمجتمع البحوث مجانا. يتم تخليق علامة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الأساسية، SSEA-4⁵، في هذا العمل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. لصناعة السيارات في CHO التلاعب البرمجيات

1. تثبيت بيئة وقت تشغيل Java: تأكد من تثبيت بيئة وقت تشغيل Java (JRE) في الجهاز. إذا تم تثبيت JRE، انتقل إلى الخطوة التالية، "تهيئة البرامج"؛ خلاف ذلك، تحميل وتثبيت JRE وفقا لنظام التشغيل المستخدم وجدت في: .
2. تهيئة البرامج: انتقل إلى موقع Auto-CHO على الويب على العنوان التالي: https://sites.google.com/view/auto-cho/home> وحمّل البرنامج وفقًا لنظام التشغيل. حاليا، يدعم Auto-CHO ويندوز، ماك، وأوبونتو. يتم توفير أحدث دليل مستخدم PDF على موقع Auto-CHO.
   1. لمستخدمي Windows، قم بفك ضغط Auto-CHO_Windows.zip وانقر نقراً مزدوجاً فوق Auto-CHO.jar في المجلد Auto-CHO_Windows لبدء تشغيل البرنامج.
      ملاحظة: يحتاج المستخدم إلى تثبيت برنامج فك الضغط، مثل 7-Zip، وجدت في ، لفك تعبئة الملف البريدي. قد يستخدم المستخدم أيضاً الأمر java-jar Auto-CHO.jar لبدء تشغيل البرنامج بواسطة موجه أوامر Windows.
   2. لمستخدمي macOS، انقر بزر الماوس الأيمن على Auto-CHO.jar واختر فتح لبدء تشغيل البرنامج.
   3. لمستخدمي أوبونتو:
      1. قم بتثبيت libcanberra-gtk باستخدام الأمر التالي:
         $ سودو عرضة الحصول على تثبيت libcanberra-GTK *
      2. تغيير إذن الوصول من Auto-CHO_Ubuntu.sh:
         $ chmod 755 السيارات CHO_Ubuntu.sh
      3. تشغيل برنامج Auto-CHO:
         $ ./Auto-CHO_Ubuntu.sh
3. إدخال هيكل الجليكون المطلوب. اختر رسم بنية غليكان أو قراءة ملف بنية موجود.
   1. الإدخال عن طريق الرسم:
      1. انقر على تحرير غليكان من قبل غليكانبانيب^9,10 (الشكل 1, btn1; الشكل 2 ألف) أو منطقة انقر هنا لتحرير الهدف الاصطناعية لرسم وتحرير بنية الاستعلام من قبل GlycanBuilder. ولا ينبغي تجاهل المعلومات المتعلقة بالربط والزقزقة. انقر على أزرار Globo-Hأو SSEA-4أو OligoLacNAc (الشكل 1، أمثلة) لعرض الأمثلة.
      2. اختر ملف | تصدير إلى تنسيقات التسلسل | تصدير إلى GlycoCT مكثف لحفظ هيكل تحريرها (اختياري).
      3. أغلق مربع الحوار GlycanBuilder لإكمال التحرير.
   2. الإدخال عن طريق قراءة ملف:
      1. انقر على تحرير غليكان من قبل غليكانبانيد (الشكل 1، btn1؛ الشكل 2 ألف) أو منطقة انقر هنا تحرير الهدف الاصطناعية تحرير بنية الاستعلام.
      2. اختر ملف | قم بالاستيراد من تنسيقات التسلسل لاختيار ملف بنية الاستعلام بالتنسيق المقابل.
4. إعدادات معلمة البحث (اختياري).
   1. حدد معلمات البحث في علامة التبويب"إعدادات المعلمة"(الشكل 1، tab2) للحصول على نتائج بحث معقولة.
      ملاحظه:
      يجب أن تكون عتبة RRV من الدرجة العالية رقم حقيقي و ≥ 0.
      يجب أن تكون عتبة RRV من الفئة المتوسطة رقمًا حقيقيًا و≥0.
      يجب أن تكون عتبة RRV من الدرجة العالية >عتبة RRV من الفئة المتوسطة.
      يجب أن يكون الحد الأقصى لرقم الجزء عدد صحيح و ≥ 1.
      الحد الأدنى لـ BBL رقم في جزء يجب أن يكون عدد صحيح و بين 1 و 3.
      يجب أن يكون الحد الأقصى لرقم BBL في جزء عدد صحيح وبين 1 و 3.
      يجب أن يكون الحد الأقصى لعدد BBL في جزء ≥ الحدالأدنى عدد BBL في جزء.
      الحد الأدنى للمتبرع/مقبول RRV الفرق يجب أن يكون رقما ً حقيقياً إيجابياً.
      الحد الأدنى للمتبرعين/المقبولين يجب أن تكون نسبة RRV عددًا حقيقيًا موجبًا.
      يجب أن تكون نسبة الحد الأقصى للمتبرعين/المقبولين RRV رقمًا حقيقيًا موجبًا.
      يجب أن تكون نسبة الحد الأقصى للمتبرعين/المقبولين RRV >الحد الأدنى من نسبة المتبرعين/المقبولين RRV.
   2. انقر على الزر موافق لتمكين الإعدادات الجديدة.
5. حدد مكتبة كتل الإنشاء(الشكل 1، علامة التبويب5). الإعداد الافتراضي هو البحث في المكتبة التجريبية فقط. إذا كان من المطلوب البحث في كل من المكتبات التجريبية والظاهرية، تحقق من الخطوات التالية.
   1. حدد علامة التبويب مكتبة كتلة الإنشاء الظاهرية (الشكل 2C، tab5). يمكن لبنات البناء التجريبية والافتراضية العمل معا لتعزيز القدرة على البحث من السيارات CHO. حاليا، يوفر Auto-CHO أكثر من 50،000 كتل البناء الافتراضية مع RRVs المتوقعة في المكتبة.
   2. حدد استخدام المكتبات التجريبية والظاهرية وتطبيق التصفية لعرض كتل الإنشاء الظاهرية بمعايير معينة. انقر على الزر إظهار BBL(s) الظاهري المحدد (الشكل 2C,btn5) لإظهار كتلة (كتل) الإنشاء الظاهرية المحددة فقط.
   3. انقر على الزر إظهار BBL(s) الظاهري المفلتر (الشكل 2C,btn6) لإظهار كتل الإنشاء الظاهرية فقط مع معايير معينة محددة من قبل المستخدم.
   4. انقر على زر إظهار جميع BBL (ق الظاهري) (الشكل 2C،btn7) لإظهار جميع كتل الإنشاء الظاهرية المتاحة وإعادة تعيين عامل التصفية.
   5. تحقق من واحد أو عدة كتل الإنشاء الظاهريالمطلوب ة التي يرغب المستخدم في استخدامها للبحث.
6. حدد علامة التبويب بنية الاستعلام (الشكل 1، tab1) وانقر على زر مكتبة كتلة الإنشاء البحث (الشكل 1، btn2) للعثور على الحلول الاصطناعية وعاء واحد لبنية الاستعلام. ثم قم بتأكيد إعدادات المعلمة.
7. ابحث في عارض النتائج.
   ملاحظة: يتم عرض نتيجة البحث في علامة التبويب "تصور النتائج" (الشكل 1، tab6). يتم عرض قبولات نهاية تقليل أرقام المخلفات المختلفة في العمود تقليل نهاية القبول (الشكل 1،viewer1).
   1. حدد مقبول نهاية الحد، ويتم عرض الحلول في قائمة الحلول الاصطناعية (الشكل 1، viewer2). تظهر الأجزاء في قائمة الأجزاء (الشكل 1، viewer3) لاقتراح عدد الأجزاء التي يجب استخدامها في التوليف.
      ملاحظة: يوفر النظام معلومات مفصلة عن كل جزء، بما في ذلك RRV للجزء، والعائد الحسابي وكذلك المجموعة الحامية التي يجب أن تكون محمية للاستخدام اللاحق للجزء في رد فعل وعاء واحد. تظهر كتل الإنشاء المستخدمة لتجميع الجزء المحدد في العارض4 من الشكل 1. يعرض العارض5 من الشكل 1 أيضاً معلومات اتصال الشظية.
   2. عرض والتحقق من الهياكل الكيميائية والمعلومات التفصيلية من لبنات البناء المختارة في مناطق الهيكل الكيميائي لكتل البناء ومتصفح كتلة البناء،على التوالي، لبنات البناء التجريبية(الشكل 1، tab4).
8. إخراج نتيجة البحث إلى نص (اختياري).
   1. حدد علامة التبويب نص النتيجة (الشكل 1، علامة التبويب 7).
   2. انقر على حفظ نص النتيجة (الشكل 2B،btn4) واختر وجهة الملف النصي.
9. ملاحظات لكتل الإنشاء الظاهرية (اختياري).
   ملاحظة: يمكن إعطاء ملاحظات حول كتل الإنشاء الظاهرية من خلال الاستبيان عبر الإنترنت. يمكن أن تساعد التغذية المرتدة المجتمع على الحفاظ على كتل البناء الافتراضية المفيدة وإزالة تلك غير الفعالة.
   1. حدد علامة التبويب كتلة الإنشاء الظاهرية (الشكل 1، علامة التبويب 5).
   2. انقر على الرابط لمعدل كتلة الإنشاء الظاهرية التي من المطلوب أن تقيم أو تعلق في العمود ردود الفعل.
   3. املأ نموذج الملاحظات بعد أن يفتح النظام صفحة ويب وإرساله.
      ملاحظة: لا تقم بتغيير معرف BBL الظاهري.

2. تجارب تحديد RRV

1. في قارورة مستديرة القاع 10 مل، الجمع بين اثنين من المانحين ثيوغليكوزيسيد (0.02 مليمول من كل: D_ص4 هو المانح المرجعي مع RRV المعروفة. D_x1 هو جزيء المتبرع من RRV غير معروف)، الميثانول المطلق (0.10 مليمول)، ودريريت في ثنائي كلورو الميثان (DCM، 1.0 مل)، ثم يحرك في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
2. تناول عليكوت من هذا الخليط (30 درجة مئوية) وحقن الخليط في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) في ثلاث حقن منفصلة (10 ميكرولتر لكل حقن). قياس المعامل(أ)بين الامتصاص ( أ ) وتركيز جزيء المتبرع [D] في ظل شروط فصل خط الأساس (خلات الأثير /ن-هيكسان = 20/80).
3. إضافة حل من 0.5 M N-Iodosuccinimide (NIS) في acetonitrile (40 μL, 0.02 ملمول) في خليط التفاعل, تليها إضافة 0.1 M حمض ثلاثي فلوروميثانسولفونيك (TfOH) الحل (20 € L, 0.002 مليمول), وتحريك الخليط في RT لمدة 2 ح.
4. تخفيف خليط التفاعل مع DCM (4.0 مل)، فلتر، وغسل مع ثيوسلفات الصوديوم الغازية المشبعة التي تحتوي على 10٪ كربونات الهيدروجين الصوديوم (2X مع حجم 5 مل لكل منهما). استخراج طبقة مائية مع DCM (3X مع 5 مل). الجمع بين جميع الطبقة العضوية، وغسلها مع 5 مل من محلول ملحي، وتجفيفها مع ما يقرب من 200 ملغ من كبريتات المغنيسيوم اللامائية.
5. يهز الخليط قليلا لمدة 30 ق، وتصفية من خلال قمع مع ورقة مرشح مخدد من أجل إزالة كبريتات المغنيسيوم، ثم جمع فيلترات في قارورة 25 مل جولة القاع. إزالة المذيب باستخدام المبخر الدوارة.
6. إذابة بقايا في DCM (1.0 مل). تناول aliquot من هذا الخليط (30 درجة مئوية) وحقنه في HPLC في ثلاث حقن منفصلة (10 ميكرولتر لكل حقن). قياس تركيزات المتبرعين المتبقيين ([D_x] و [D_ref])بواسطة HPLC في ظل نفس شروط الفصل (خلات الأثير/الهكان = 20/80)_{(المرجع)t} = 24417.0، (A_x)t = 23546.3.
7. قياس التفاعل النسبي بين D_x1 مقابل D_r4، k_x1/k_r4 = 0.0932. استناداً إلى قيمة التفاعل النسبي D_r4، قيمة التفاعل النسبي لـ D_x1 هي 3.
   ملاحظة: a = A/[D]،_(مرجع)0 = 74530.1 ، (A_x)₀ = 26143.0. (ك) _x/k_ref = (in[D_x]t - in [D_x]_0)/(in[D_ref]t - in[D_ref]0)= (in[A _x]t - in [A_x]0)/(in [a_ref]t - in [a_ref]0)= 0.0932.

3. وعاء واحد غليكوزيل من SSEA-4

1. وضع قارورة 10 مل جولة القاع تحت فراغ، لهب الجافة، والسماح للقارورة لتبرد إلى RT في حين لا يزال تحت فراغ. إزالة الحاجز المطاطي لإضافة خليط من disaccharide 1 المانح (38 ملغ، 1.1 مكافئ، 0.057 مليمول)، والقبول الأول 2 (40 ملغ، 1.0 مكافئ، 0.053 مليمول) وقضيب التحريك المغناطيسي المغلفة تفلون في قارورة.
2. نقل 100 ملغ من غربال الجزيئية مسحوق 4 Å في قارورة 5 مل جولة القاع. إبقاء هذه القارورة تحت فراغ، لهب الجافة، والسماح للقارورة لتبرد إلى RT في حين لا يزال تحت فراغ. نقل المجففة الطازجة 4 Å المنخل الجزيئي في قارورة الأولى التي تحتوي على المواد البداية.
3. نقل 1 مل من DCM المجففة حديثا في قارورة. يُحرّك خليط التفاعل لمدّة 1 ساعة في RT ثم ّ يُوضع تحت درجة حرارة -40 درجة مئوية. نقل NIS (13 ملغ، 1.1 مكافئ، 0.057 مليمول) في قارورة.
4. حقن TfOH (34 ميكرولتر، 0.3 مكافئ، 0.017 مليمول، 0.5 ملي في الأثير) في القارورة من خلال الحاجز باستخدام حقنة صغيرة الحجم في -40 درجة مئوية. استمر في التحريك عند -40 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
5. بعد أن يتم استهلاك أول مقبل 2 تقريبا، حقن الحل من مقبول 3 في DCM في قارورة من خلال الحاجز.
6. قم بتسخين خليط التفاعل حتى -20 درجة مئوية ونقل NIS (19 ملغ، 1.6 مكافئ، 0.083 مليمول) في القارورة. حقن TfOH (34 ميكرولتر، 0.3 مكافئ، 0.017 مليمول، 0.5 ملي في الأثير) في القارورة من خلال الحاجز عند -20 درجة مئوية. استمر في التحريك عند -20 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
7. بعد استهلاك ناتج رد فعل الخطوة الأولى، وإرواء التفاعل عن طريق حقن اثنين من مكافئات الأمين ثلاثي إيثيل. إزالة المنخل الجزيئي من خلال قمع فلتر معبأة مع Celite، وجمع filtrate في قارورة 25 مل جولة القاع ومزيد من غسل مرشح مع 10 مل من DCM.
8. نقل فيلترات في قمع فاصل وغسله مع ثيوسلفات الصوديوم الغازية المشبعة التي تحتوي على 10٪ NaHCO₃ (2X مع 10 مل لكل منهما). استخراج طبقة مائية مع DCM (3X مع 10 مل). الجمع بين الطبقات العضوية وغسل الخليط مع محلول ملحي (10 مل) وتجفيفه عن طريق إضافة اللامائية MgSO_4. تصفية ذلك وجمع filtrate في قارورة 100 مل جولة القاع.
9. إزالة المذيب باستخدام المبخر الدوارة. إذابة الخليط الخام مع ما يقرب من 1 مل من DCM وتحميلها على رأس السرير السيليكا. قم بخلط المنتج بخليط من خلات الإيثيل والتولوين (EtOAc/toluene، 1/4 إلى 1/2) وجمع الكسور.
10. إزالة المذيب باستخدام المبخر الدوارة. تجفيف بقايا تحت ضغط منخفض لإعطاء محمية تماما SSEA-4 مشتق 4 (74 ملغ، 50٪ على أساس مقبول 2)كما رغوة بيضاء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تشير نتيجة البحث Auto-CHO استنادًا إلى إعدادات المعلمة الافتراضية إلى أن SSEA-4 يمكن توليفها بواسطة رد فعل [2 + 1 + 3] بوعاء واحد. يظهر الشكل 3 لقطة البرنامج من نتيجة البحث SSEA-4. عندما يتم تحديد trisaccharide الحد من نهاية مقبول(الشكل 3،التسمية 1)، يظهر البرنا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تم تطوير برنامج Auto-CHO لمساعدة الكيميائيين على المضي قدما في توليف وعاء واحد هرمية وقابلة للبرمجة من oligosaccharides⁵. تم بناء السيارات CHO من قبل لغة البرمجة جافا. بل هو برنامج واجهة المستخدم الرسومية وعبر منصة، والتي تدعم حاليا ويندوز، ماك، وأوبونتو. ويمكن تحميل البرنامج مجانا لموقع ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	75-05-8
Anhydrous magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Cerium ammonium molybdate	TCI	C1794
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	75-09-2
Drierite	Sigma-Aldrich	7778-18-9
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	141-78-6
Methanol	Sigma-Aldrich	67-56-1
Molecular sieves 4 Å	Sigma-Aldrich
n-Hexane	Sigma-Aldrich	110-54-3
N-Iodosuccinimide	Sigma-Aldrich	516-12-1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	144-55-8
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich	10102-17-7
Toluene	Sigma-Aldrich	108-88-3
Trifluoromethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	1493-13-6