Sintesi gerarchica e programmabile di Oligosaccaride

Riepilogo

Questo protocollo dimostra come utilizzare il software Auto-CHO per la sintesi gerarchica e programmabile di oligosaccharides. Descrive anche la procedura generale per gli esperimenti di determinazione RRV e la glicosilazione di SSEA-4.

Abstract

Questo articolo presenta un protocollo sperimentale generale per la sintesi programmabile di oligosaccharide e dimostra come utilizzare il software Auto-CHO per generare potenziali soluzioni sintetiche. L'approccio programmabile di sintesi di oligosaccharide è progettato per potenziare la sintesi rapida di oligosaccharide di grandi quantità utilizzando blocchi costitutivi del tioglicoside (BBL) con l'ordine sequenziale appropriato dei valori di reattività relativi (RRV). Auto-CHO è un software multipiattaforma con un'interfaccia utente grafica che fornisce possibili soluzioni sintetiche per la sintesi programmabile di oligosaccharide monopot ricercando una libreria BBL (contenente circa 150 bbL convalidate e >50.000 BBL virtuali) con RRV stimati con precisione per regressione vettoriale di supporto. L'algoritmo per la sintesi gerarchica di un piatto è stato implementato in Auto-CHO e utilizza frammenti generati da reazioni one-pot come nuovi BBL. Inoltre, Auto-CHO consente agli utenti di fornire feedback per bbL virtuali per mantenere quelli preziosi per un ulteriore utilizzo. In questo lavoro viene dimostrata la sintesi one-pot dell'antigene embrionale 4 (SSEA-4), che è un pennarello flessibile di cellule staminali embrionali umane, in questo lavoro.

Introduzione

I carboidrati sono onnipresenti in natura^1,2, ma la loro presenza e modalità di azione rimangono un territorio inesplorato, principalmente a causa del difficile accesso a questa classe di molecole³. A differenza della sintesi automatizzata di oligopeptidi e oligonucleotidi, lo sviluppo della sintesi automatizzata degli oligosaccaridi rimane un compito formidabile e i progressi sono stati relativamente lenti.

Per affrontare questo problema, Wong et al. ha sviluppato il primo metodo automatizzato per la sintesi di oligosaccarides utilizzando un programma software programmabile chiamato Optimer⁴, che guida la selezione di BBL da una libreria di 50 BBL per un monopiatto sequenziale Reazioni. Ogni BBL è stato progettato e sintetizzato con reattività ben definita sintonizzata da vari gruppi di protezione. Utilizzando questo approccio, le complessità di protezione della manipolazione e della purificazione intermedia possono essere ridotte al minimo durante la sintesi, che sono state considerate le questioni più difficili da superare nello sviluppo della sintesi automatizzata. Nonostante questo progresso, il metodo è ancora abbastanza limitato, come il numero di BBL è troppo piccolo e il programma Optimer in grado di gestire solo alcuni piccoli oligosaccharides. Per oligosaccharides più complessi che richiedono più BBL e passaggi multipli di reazioni one-pot e condensa di frammenti, è stata sviluppata una versione aggiornata del programma software, Auto-CHO⁵.

In Auto-CHO, sono stati aggiunti più di 50.000 BBL con reattività definita nella libreria BBL, tra cui 154 sintetici e 50.000 virtuali. Questi BBL sono stati progettati dall'apprendimento automatico sulla base di proprietà di base, spostamenti chimici NMR calcolati^6,7, e descrittori molecolari⁸, che influenzano la struttura e la reattività dei BBL. Con questo programma aggiornato e un nuovo set di BBL disponibili, la capacità di sintesi viene espansa e, come dimostrato, diversi oligosaccharidi di interesse possono essere rapidamente preparati. Si ritiene che questo nuovo sviluppo faciliterà la sintesi di oligosaccharides per lo studio dei loro ruoli in vari processi biologici e il loro impatto sulle strutture e le funzioni di glicoproteine e glicolididi. Si pensa anche che questo lavoro andrà a beneficio della comunità della glicoscience in modo significativo, dato che questo metodo è a disposizione della comunità di ricerca gratuitamente. La sintesi del marcatore essenziale di cellule staminali embrionali umane, SSEA-4⁵, è dimostrata in questo lavoro.

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Protocollo

1. Manipolazione del software Auto-CHO

1. Installazione di Java Runtime Environment: assicurati che Java Runtime Environment (JRE) sia stato installato nel dispositivo. Se JRE è stato installato, andare al passaggio successivo, "inizializzazione del software"; in caso contrario, scaricare e installare JRE in base al sistema operativo dell'utente disponibile all'indirizzo: .
2. Inizializzazione del software: accedere al sito Web Auto-CHO all'indirizzo e scaricare il software in base al sistema operativo. Attualmente, Auto-CHO supporta Windows, macOS e Ubuntu. L'ultima guida per l'utente PDF è disponibile sul sito Web Auto-CHO.
   1. Per gli utenti di Windows, decomprimere il file Auto-CHO_Windows.zip e fare doppio clic su Auto-CHO.jar nella cartella Auto-CHO_Windows per avviare il programma.
      NOTA: l'utente deve installare il software di decompressione, ad esempio 7-zip, disponibile all'indirizzo , per decomprimere il file zip. L'utente può anche utilizzare il comando java -jar Auto-CHO.jar per avviare il programma dal prompt dei comandi di Windows.
   2. Per gli utenti di macOS, fare clic con il pulsante destro del mouse su Auto-CHO.jar e scegliere Apri per avviare il programma.
   3. Per gli utenti Ubuntu:
      1. Installare libcanberra-gtk utilizzando il seguente comando:
         - sudo apt-get install libcanberra-gtk
      2. Modificare l'autorizzazione di accesso di Auto-CHO_Ubuntu.sh:
         chmod 755 Auto-CHO_Ubuntu.sh
      3. Eseguire il programma Auto-CHO:
         ./Auto-CHO_Ubuntu.sh
3. Immettere la struttura glicana desiderata. Scegliere se disegnare una struttura glicana o leggere un file di struttura esistente.
   1. Input mediante disegno:
      1. Fare clic su Edit Glycan di GlycanBuilder^9,10 (Figura 1, btn1; Figura 2A) o l'area fare clic qui per modificare la destinazione sintetica per disegnare e modificare la struttura della query da GlycanBuilder. Le informazioni di collegamento e chiralità non devono essere ignorate. Fare clic sui pulsanti Globo-H, SSEA-4o OligoLacNAc (Figura 1, esempi) per visualizzare gli esempi.
      2. Selezionare il file Esportazione in formati di sequenza Esportazione in GlycoCT condensata per salvare la struttura modificata (opzionale).
      3. Chiudere la finestra di dialogo GlycanBuilder per completare la modifica.
   2. Inserire leggendo un file:
      1. Fare clic su Edit Glycan di GlycanBuilder (Figura 1, btn1; Figura 2A) o l'area Fare clic qui per modificare la destinazione sintetica per modificare la struttura della query.
      2. Selezionare il file Importa da formati di sequenza per scegliere il file della struttura della query con il formato corrispondente.
4. Impostazioni dei parametri di ricerca (facoltativo).
   1. Definire i parametri di ricerca nella scheda "Impostazioni parametri"(Figura 1, tab2) per ottenere risultati di ricerca ragionevoli.
      nota:
      Soglia di RRV di alta classe deve essere un numero reale e 0.
      Soglia di classe media RRV deve essere un numero reale e 0.
      Soglia di RRV di alta classe deve essere >Soglia di classe media RRV.
      Numero di frammento massimo deve essere un numero intero e 1.
      Numero BBL in un frammento deve essere un numero intero e tra 1 e 3.
      Numero massimo BBL in un frammento deve essere un numero intero e tra 1 e 3.
      Numero massimo BBL in un frammento deve essere numeroMin BBL in un frammento.
      Min Donatore/Accettatore RRV La differenza deve essere un numero reale positivo.
      Min Donor/Acceptor RRV Ratio deve essere un numero reale positivo.
      Max Donor/Acceptor RRV Ratio deve essere un numero reale positivo.
      Max Donor/Acceptor RRV Ratio deve essere >Min Donor/Acceptor RRV Ratio.
   2. Fare clic sul pulsante OK per abilitare le nuove impostazioni.
5. Selezionare la libreria di blocchi predefiniti(Figura 1, tab5). L'impostazione predefinita prevede la ricerca solo nella libreria sperimentale. Se si desidera eseguire la ricerca nelle librerie sperimentali e virtuali, attenersi alla seguente procedura.
   1. Selezionare la scheda Libreria di blocchi predefiniti virtuali (Figura 2C, scheda5). I blocchi di costruzione sperimentali e virtuali possono lavorare insieme per migliorare la capacità di ricerca di Auto-CHO. Attualmente, Auto-CHO fornisce più di 50.000 blocchi predefiniti virtuali con RRV previsti nella libreria.
   2. Selezionare Usa librerie sperimentali e virtuali e applicare il filtro per visualizzare i blocchi predefiniti virtuali con determinati criteri. Fare clic sul pulsante Mostra BBL virtuali selezionati (Figura 2C, btn5) per visualizzare solo i blocchi predefiniti virtuali selezionati.
   3. Fare clic sul pulsante Mostra BBL virtuali filtrati (Figura 2C, btn6) per visualizzare solo i blocchi predefiniti virtuali con determinati criteri definiti dall'utente.
   4. Fare clic sul pulsante Mostra tutti i BBL virtuali (Figura 2C, btn7) per visualizzare tutti i blocchi predefiniti virtuali disponibili e reimpostare il filtro.
   5. Controllare uno o più blocchi predefiniti virtuali desiderati che l'utente desidera utilizzare per la ricerca.
6. Selezionare la scheda Struttura query (Figura 1,scheda1) e fare clic sul pulsante Cerca libreria di blocchi predefiniti (Figura 1, btn2) per trovare le soluzioni sintetiche one-pot per la struttura di query. Quindi, confermare le impostazioni dei parametri.
7. Eseguire ricerche nel visualizzatore di risultati.
   NOTA: il risultato della ricerca viene visualizzato nella scheda Visualizzazione dei risultati ( Figura1, tab6). Gli accettatori finali di riduzione di diversi numeri di residuo vengono visualizzati nella colonna Riduzione end acceptor (Figura 1, visualizzatore1).
   1. Selezionare un accettatore di fascia e ridurre e le soluzioni vengono visualizzate nell'elenco delle soluzioni sintetiche (Figura 1, visualizzatore2). I frammenti sono illustrati nell'elenco dei frammenti (Figura 1, viewer3) per suggerire quanti frammenti devono essere utilizzati nella sintesi.
      NOTA: Il sistema fornisce informazioni dettagliate di ogni frammento, tra cui il RRV del frammento, resa computazionale e quale gruppo di protezione deve essere deprotetto per il successivo uso del frammento nella reazione one-pot. I blocchi predefiniti utilizzati per assemblare il frammento selezionato sono illustrati nel visualizzatore4 della figura 1. Il visualizzatore5 di Figura 1 visualizza anche le informazioni di connessione frammento.
   2. Visualizzare e controllare le strutture chimiche e le informazioni dettagliate dei blocchi predefiniti selezionati nelle regioni rispettivamente della struttura chimica di Building Block e Building Block Browser,per i blocchi di costruzione sperimentali (Figura 1, tab4).
8. Eseguire l'output del risultato della ricerca in testo (facoltativo).
   1. Selezionare la scheda Testo risultato (Figura 1, tab7).
   2. Fare clic su Salva testo risultato (Figura 2B, btn4) e scegliere la destinazione del file di testo.
9. Feedback per i blocchi predefiniti virtuali (facoltativo).
   NOTA: il feedback può essere fornito sui blocchi predefiniti virtuali tramite il questionario online. Il feedback può aiutare la community a mantenere utili blocchi fondamentali virtuali e rimuovere quelli inefficaci.
   1. Selezionare la scheda Blocco predefinito virtuale (Figura 1, tab5).
   2. Fare clic sul collegamento Per valutare il blocco predefinito virtuale di cui si desidera valutare o commentare nella colonna Feedback.
   3. Compila il modulo di feedback dopo che il sistema ha aperto una pagina web e la invia.
      NOTA: non modificare l'ID BBL virtuale.

2. Esperimenti di determinazione RRV

1. In un flaasso rotondo da 10 mL, unire i due donatori tiogilli (0,02 mmol di ciascuno: D_r4 è il donatore di riferimento con NOto RRV; D_x1 è la molecola donatrice di RRV sconosciuto), metanolo assoluto (0,10 mmol) e Drierite in diclorometano (DCM, 1,0 mL), quindi mescolare a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
2. Prendere un'aliquota di questa miscela (30 gradi centigradi) e iniettare la miscela nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) in tre iniezioni separate (10 -L per ogni iniezione). Misurare il coefficiente (a) tra l'assorbimento (A) e la concentrazione della molecola del donatore [D] nelle condizioni di separazione della linea di base (acetato di etere/n-Hexane - 20/80).
3. Aggiungere nella miscela di reazione una soluzione di 0,5 M N-Iodosuccinimide (NIS) in acetonitrile (40 ,L, 0,02 mmol), seguita dall'aggiunta di una soluzione di acido trifluoromethanesulfonico da 0,1 M (TfOH) (20 , 0,002 mmol) e mescolare la miscela a RT per 2 h.
4. Diluire la miscela di reazione con DCM (4,0 mL), filtrare e lavare con thiosulfate di sodio saturo contenente il 10% di carbonato di idrogeno di sodio (2x con volume di 5 mL ciascuno). Estrarre lo strato acquoso con DCM (3x con 5 mL). Unire tutto lo strato organico, lavarlo con 5 mL di salamoia e asciugarlo con circa 200 mg di solfato di magnesio anidro.
5. Agitare leggermente la miscela per 30 s, filtrarla attraverso un imbuto con una carta da filtro scanalata per rimuovere il solfato di magnesio, quindi raccogliere il filtrato in un flacone rotondo-bottom da 25 ml. Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante.
6. Sciogliere il residuo in DCM (1,0 mL). Prendere un'aliquota di questa miscela (30 gradi centigradi) e iniettarla in HPLC in tre iniezioni separate (10 gradi per ogni iniezione). Misurare le concentrazioni dei donatori rimanenti ([D_x] e [D_ref]) mediante HPLC nelle stesse condizioni di separazione (ether acetato/n-Hexane - 20/80) (A_ref)_t - 24417.0, (A_x)_t 23546,3.
7. Misurare la reattività relativa tra D_x1 e D_r4, k_x1/k_r4 , 0,0932. In base al valore di reattività relativo di D_r4, il valore di reattività relativo di D_x1 è 3.
   N.B.: a : A/[D], (A_ref)₀ , 74530.1,_(A)₀ , 26143.0. k _x/k_ref (ln[D_x]_t - ln[D_x]₀)/(ln[D_ref]_t - ln[D_ref]₀) : (ln[A _x]_t - ln[A_x]₀)/(ln[A_ref]_t - ln[A_ref]₀) - 0,0932.

3. Glicosilation one-pot di SSEA-4

1. Mettere una fiaschetta rotonda da 10 mL sotto vuoto, asciugarla a fiamma e lasciare raffreddare il pallone su RT mentre è ancora sotto vuoto. Rimuovere il setto di gomma per aggiungere una miscela di donatore disaccharide 1 (38 mg, 1,1 eq., 0,057 mmol), il primo accettatore 2 (40 mg, 1,0 eq., 0.053 mmol) e una barra magnetica rivestita di Teflon nel pallone.
2. Trasferire 100 mg di setacci molecolari in polvere 4 in un fiaschetatore rotondo-fondo da 5 mL. Tenere questa fiaschetta sotto vuoto, asciugarla a fiamma e lasciare raffreddare il pallone in RT mentre è ancora sotto vuoto. Trasferire i setacci a 4 molecolari appena essiccati nel primo flacone che contiene il materiale di partenza.
3. Trasferire 1 mL di DCM appena essiccato nel pallone. Mescolare la miscela di reazione per 1 h a RT e poi metterlo a una temperatura di -40 gradi centigradi. Trasferire il NIS (13 mg, 1.1 eq., 0.057 mmol) nel pallone.
4. Iniettare TfOH (34 , 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 M in etere) nella fiaschetta attraverso il setto utilizzando una siringa di micro-volume a -40 gradi centigradi. Continuare a mescolare a -40 gradi centigradi per 3 h.
5. Dopo che il primo accettatore 2 è quasi consumato, iniettare la soluzione di accettatore 3 in DCM nel pallone attraverso il setto.
6. Riscaldare la miscela di reazione fino a -20 gradi centigradi e trasferire NIS (19 mg, 1,6 eq., 0,083 mmol) nel pallone. Iniettare TfOH (34 , 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 M in etere) nel flacone attraverso il setto a -20 gradi centigradi. Continuare a mescolare a -20 gradi centigradi per 3 h.
7. Dopo che il prodotto della reazione del primo passo viene consumato, placare la reazione iniettando due equivalenti di ammina di trietilo. Rimuovere i setacci molecolari attraverso un imbuto filtrato pieno di Celite, raccogliere il filtrato in un pallone rotondo-fondo da 25 ml e lavare ulteriormente il filtro con 10 mL di DCM.
8. Trasferire il filtrato in un imbuto separatore e lavarlo con tiosulto di sodio acquoso saturo contenente 10% NaHCO₃ (2x con 10 mL ciascuno). Estrarre lo strato acquoso con DCM (3x con 10 mL). Unire gli strati organici e lavare il composto con salamoia (10 mL) e asciugarlo aggiungendo anhydrous MgSO₄. Filtrarlo e raccogliere il filtrato in una fiaschetta rotonda-bottom da 100 ml.
9. Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante. Sciogliere la miscela grezza con circa 1 mL di DCM e caricarla sopra il letto di silice. Elutare il prodotto con una miscela di acetato etilico e toluene (EtOAc/toluene, 1/4 a 1/2) e raccogliere le frazioni.
10. Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante. Asciugare i residui sotto pressione ridotta per dare derivato SSEA-4 completamente protetto 4 (74 mg, 50% a base di accettatore 2) come schiuma bianca.

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Risultati

Il risultato della ricerca Auto-CHO in base alle impostazioni dei parametri di default indica che SSEA-4 può essere sintetizzato da una reazione un pot [2 x 1 x 3]. Figura 3 Mostra lo screenshot del software del risultato di ricerca SSEA-4. Quando viene selezionato un tipo di fine riduzione trisaccore (Figura 3, etichetta 1), il programma mostra quattro possibili soluzioni per la query. La prima soluzione ha un frammento (

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Discussione

Il software Auto-CHO è stato sviluppato per aiutare i chimici a procedere gerarchica e programmabile sintesi one-pot di oligosaccharides⁵. Auto-CHO è stato costruito da linguaggio di programmazione Java. Si tratta di un software GUI e multipiattaforma, che attualmente supporta Windows, macOS e Ubuntu. Il software può essere scaricato gratuitamente per il sito Auto-CHO all'indirizzo e il suo codice sorgente con licenza MIT è accessibile da GitHub al...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	75-05-8
Anhydrous magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Cerium ammonium molybdate	TCI	C1794
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	75-09-2
Drierite	Sigma-Aldrich	7778-18-9
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	141-78-6
Methanol	Sigma-Aldrich	67-56-1
Molecular sieves 4 Å	Sigma-Aldrich
n-Hexane	Sigma-Aldrich	110-54-3
N-Iodosuccinimide	Sigma-Aldrich	516-12-1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	144-55-8
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich	10102-17-7
Toluene	Sigma-Aldrich	108-88-3
Trifluoromethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	1493-13-6