Иерархический и программируемый однопотный олигосахаридный синтез

Резюме

Этот протокол демонстрирует, как использовать программное обеспечение Auto-CHO для иерархического и программируемого синтеза олигосахаридов. В нем также описывается общая процедура экспериментов по определению RRV и гликозилирование SSEA-4.

Аннотация

В этой статье представлен общий экспериментальный протокол для программируемого синтеза олигосахарида одного горшка и показано, как использовать программное обеспечение Auto-CHO для генерации потенциальных синтетических решений. Программируемый один горшок олигосахарида синтез подход предназначен для расширения возможностей быстрого синтеза олигосахарида больших количествах с использованием тиогликозидных строительных блоков (BBLs) с соответствующим последовательным порядком относительных значений реактивности (RRVs). Auto-CHO является кросс-платформенным программным обеспечением с графическим пользовательским интерфейсом, который обеспечивает возможные синтетические решения для программируемого синтеза олигосахарида одного горшка путем поиска в библиотеке BBL (содержащей около 150 проверенных и точно предсказал RRV поддержки вектор регрессии. Алгоритм иерархического синтеза одного горшка реализован в Auto-CHO и использует фрагменты, генерируемые реакцией одного горшка, в качестве новых BBL. Кроме того, Auto-CHO позволяет пользователям давать обратную связь для виртуальных BBLs, чтобы сохранить ценные для дальнейшего использования. В этой работе показан одногоршоксинтез апогена 4 (SSEA-4), который является плюрипотентным маркером эмбриональных стволовых клеток человека.

Введение

Углеводы вездесущи в природе^1,2, но их наличие и способ действия остаются неизведанной территории, в основном из-за трудного доступа к этому классу молекул³. В отличие от автоматизированного синтеза олигопептидов и олигонуклеотидов, развитие автоматизированного синтеза олигосахаридов остается огромной задачей, и прогресс идет относительно медленно.

Для решения этой проблемы, Вонг и др. разработали первый автоматизированный метод синтеза олигосахаридов с помощью программного обеспечения под названием Optimer⁴, которая направляет выбор BBLs из библиотеки 50 BBLs для последовательного одного горшка Реакции. Каждый BBL был разработан и синтезирован с четко определенной реактивностью, настроенной различными группами защиты. Используя этот подход, сложности защиты манипуляций и промежуточной очистки могут быть сведены к минимуму при синтезе, которые считаются наиболее сложными вопросами, которые необходимо преодолеть при разработке автоматизированного синтеза. Несмотря на это заранее, метод по-прежнему довольно ограничен, так как количество BBLs слишком мала, и программа Optimer может обрабатывать только некоторые небольшие олигосахариды. Для более сложных олигосахаридов, которые требуют больше BBLs и несколько проходов одного горшка реакций и фрагмент конденсации, модернизированная версия программного обеспечения, Auto-CHO⁵, была разработана.

В Auto-CHO, больше чем 50.000 BBLs с определенной реактивностью к архиву BBL были добавлены, включая 154 синтетические и 50.000 фактически одни. Эти BBLs были разработаны машинного обучения на основе основных свойств, рассчитанные ЯМР химических сдвигов^6,7,и молекулярные дескрипторы⁸, которые влияют на структуру и реактивность BBLs. С этой обновленной программой и новым набором доступных BBL, потенциал синтеза расширяется, и, как показано, несколько олигосахаридов интерес может быть быстро подготовлен. Считается, что это новое развитие будет способствовать синтезу олигосахаридов для изучения их роли в различных биологических процессах и их воздействия на структуры и функции гликопротеинов и гликолипидов. Считается также, что эта работа принесет значительную пользу гликонаучному сообществу, учитывая, что этот метод доступен научному сообществу бесплатно. Синтез основных человеческих эмбриональных маркер стволовых клеток, SSEA-4⁵, демонстрируется в этой работе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Манипуляция программным обеспечением Auto-CHO

1. Установка среды Java Runtime: убедитесь, что в устройстве установлена среда Java Runtime Environment (JRE). Если JRE был установлен, перейдите к следующему шагу, "программной инициализации"; в противном случае, скачать и установить JRE в соответствии с операционной системой пользователя найти по адресу: lt;https:/www.oracle.com/technetwork/java/javase/downloads/index.html.gt;
2. Программное обеспечение инициализации: перейдите на веб-сайт Auto-CHO на lt;https://sites.google.com/view/auto-cho/home'gt; и скачать программное обеспечение в соответствии с операционной системой. В настоящее время Auto-CHO поддерживает Windows, macOS и Ubuntu. Последнее руководство пользователя PDF представлено на веб-сайте Auto-CHO.
   1. Для пользователей Windows, распаковать Auto-CHO-Windows.zip и дважды нажмите на Auto-CHO.jar в папке Auto-CHO-Windows, чтобы начать программу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь должен установить unzip программное обеспечение, например, 7-Зип, найденный на lt;https://www.7-zip.org.gt;, для распаковки почтовый файл. Пользователь может также использовать команду Java-jar Auto-CHO.jar для запуска программы командным запросом Windows.
   2. Для пользователей macOS, право езду на Auto-CHO.jar и выбрать Открыть для запуска программы.
   3. Для пользователей Ubuntu:
      1. Установите libcanberra-gtk с помощью следующей команды:
         $ sudo apt-получить установить libcanberra-gtk
      2. Измените разрешение на доступ авто-CHO-Ubuntu.sh:
         $ chmod 755 Авто-ЧО-Убукту.ш
      3. Выполнить программу Auto-CHO:
         $ ./Авто-ЧО-Убунту.sh
3. Ввечу желаемую структуру гликанов. Выберите нарисовать структуру гликанов или прочитать существующий файл структуры.
   1. Вход путем рисования:
      1. Нажмите на Edit Glycan от GlycanBuilder^9,10 (Рисунок 1, btn1; Рисунок 2А) или область Нажмите здесь, чтобы отобразить синтетическую цель, чтобы нарисовать и отсеивать структуру запроса от GlycanBuilder. Информация о связи и хиральности не должна игнорироваться. Нажмите на globo-H, SSEA-4, или OligoLacNAc кнопки(рисунок 1, примеры), чтобы отобразить примеры.
      2. Выберите файл Экспорт в форматы последовательности Экспорт на GlycoCT, сжатый для сохранения отредактированной структуры (по желанию).
      3. Закройте диалог GlycanBuilder для завершения редактирования.
   2. Вход, читая файл:
      1. Нажмите на Edit Glycan от GlycanBuilder (Рисунок 1, btn1; Рисунок 2А) или область Нажмите здесь, чтобы отобразить синтетическую цель для отправления структуры запроса.
      2. Выберите файл Импорт из форматов последовательности для выбора файла структуры запроса с соответствующим форматом.
4. Параметры параметров поиска (необязательно).
   1. Определите параметры поиска в вкладке"Параметры настройки"(рисунок 1, вкладка 2), чтобы получить разумные результаты поиска.
      Примечание:
      Порог RRV высокого класса должен быть реальным числом и No0.
      Порог RRV среднего класса должен быть реальным числом и No0.
      Порог высокого класса RRV должен быть
      Номер Фрагмента Макса должен быть целым и No1.
      Мин BBL номер в фрагмент должен быть целым числаи и между 1 и 3.
      Номер Max BBL в фрагменте должен быть целым числам и между 1 и 3.
      Номер Max BBL в фрагменте должен бытьномером Мин BBL в фрагменте.
      Мин Донор / Принимая RRV Разница должна быть положительным реальным числом.
      Мин Донор / Принимая RRV Соотношение должно быть положительным реальным числом.
      Макс Донор / Принимая RRV Коэффициент должен быть положительным реальным числом.
      Макс Донор / Принимая RRV Коэффициентдолжен быть
   2. Нажмите на кнопку OK, чтобы включить новые настройки.
5. Выберите библиотеку строительного блока(рисунок 1,вкладка5). Настройка по умолчанию предназначена только для поиска в экспериментальной библиотеке. Если желательно искать как экспериментальные, так и виртуальные библиотеки, проверьте следующие шаги.
   1. Выберите вкладку Библиотеки виртуального блока зданий (рисунок 2C, вкладка5). Экспериментальные и виртуальные строительные блоки могут работать вместе, чтобы повысить способность к поиску Auto-CHO. В настоящее время Auto-CHO предоставляет более 50 000 виртуальных строительных блоков с прогнозируемыми RRV в библиотеке.
   2. Выберите Использование экспериментальных и виртуальных библиотек и применяйте фильтрацию для отображения виртуальных строительных блоков с определенными критериями. Нажмите на кнопку Show Выбранный виртуальный BBL (s) кнопку(Рисунок 2C, btn5), чтобы показать только выбранный виртуальный строительный блок (ы).
   3. Нажмите на кнопку Show Filtered Virtual BBL (рисунок 2C,btn6), чтобы показать только виртуальные строительные блоки с определенными критериями, определенными пользователем.
   4. Нажмите на кнопку Показать все виртуальные BBL (s) кнопку(Рисунок 2C, btn7), чтобы показать все доступные виртуальные строительные блоки и сбросить фильтр.
   5. Проверьте один или несколько желаемых виртуальных строительных блоков, которые пользователь хотел бы использовать для поиска.
6. Выберите вкладку «Структура запроса» (рисунок 1,tab1) и нажмите на кнопку Библиотеки поиска здания (рисунок 1, btn2), чтобы найти синтетические решения для структуры запроса. Затем подтвердите параметры параметров.
7. Поиск результата просмотра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результат поиска отображается во вкладке Визуализация результата (рисунок 1, tab6). Уменьшающие конечные приемы различных номеров остатков отображаются в столбце Уменьшенного конечного приемного (рисунок 1,зритель1).
   1. Выберите приемора редуктора, и решения отображаются в списке синтетических решений (рисунок 1, зритель2). Фрагменты отображаются в списке фрагментов (рисунок 1, зритель3), чтобы предложить, сколько фрагментов должно быть использовано в синтезе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система предоставляет подробную информацию о каждом фрагменте, включая RRV фрагмента, вычислительную доходность, а также о том, какая группа защиты должна быть дезащищена для последующего использования фрагмента в реакции одного горшка. Строительные блоки, используемые для сборки выбранного фрагмента, отображаются в viewer4 на рисунке 1. Зритель5 на рисунке 1 также отображает информацию о подключении фрагмента.
   2. Просмотр и проверка химических структур и подробная информация о выбранных строительных блоков в регионах химической структуры строительного блока и строительного блока браузера, соответственно, для экспериментальных строительных блоков (Рисунок 1,табу4).
8. Вывод результата поиска в текст (необязательно).
   1. Выберите вкладку «Текст результата» (рисунок 1,табу7).
   2. Нажмите на Текст Сохранить результат (рисунок 2B,btn4) и выберите пункт назначения текстового файла.
9. Обратная связь для виртуальных строительных блоков (необязательно).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратная связь может быть предоставлена на виртуальных строительных блоков через онлайн-вопросник. Обратная связь может помочь сообществу сохранить полезные виртуальные строительные блоки и удалить неэффективные.
   1. Выберите вкладку Virtual Building Block (рисунок 1,табу5).
   2. Нажмите на ссылку To rate виртуального строительного блока, которую желательно оценить или прокомментировать в колонке Отзывы.
   3. Заполните форму обратной связи после того, как система откроет веб-страницу и отправьте ее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не меняйте виртуальный идентификатор BBL.

2. Эксперименты определения RRV

1. В 10 мл круглого дна колбу, объединить два тиогликозида доноров (0,02 ммоль каждого: D_r4 является эталонным донором с известными RRV; D_x1 является донорской молекулой неизвестного RRV, абсолютного метанола (0,10 ммоль) и дририта в дихлорметане (DCM, 1,0 мл), затем перемешать при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
2. Возьмите аликвот этой смеси (30 л) и введите смесь в высокопроизводительную жидкую хроматографию (HPLC) в трех отдельных инъекциях (10 л для каждой инъекции). Измерьте коэффициент (а) между поглощением(A)и концентрацией донорской молекулыDв условиях разделения исходных линий (эфир ацетат/ n-Hexane 20/80).
3. Добавить раствор 0,5 М N-Iodosuccinimide (NIS) в ацетонитриле (40 л, 0,02 ммоль) в реакционную смесь, а затем добавить 0,1 М трифторметанесульфоновой кислоты (TfOH) раствор (20 qL, 0,002 ммоль), и перемешать смесь на RT для 2 ч.
4. Разбавить реакционную смесь DCM (4,0 мл), фильтровать и мыть насыщенным ваковым тиосульфатом натрия, содержащим 10% карбоната водорода натрия (2x с объемом 5 мл каждый). Извлекайте свочный слой с DCM (3x с 5 мл). Смешайте весь органический слой, промойте его 5 мл рассола и высушите примерно 200 мг сульфата ангидроусового магния.
5. Встряхните смесь мягко в течение 30 с, фильтровать его через воронку с рифленой фильтровальной бумагой для того, чтобы удалить сульфат магния, а затем собрать фильтрвать в 25 мл круглого дна колбу. Удалите растворитель с помощью вращающегося испарителя.
6. Растворите остатки в DCM (1,0 мл). Возьмите аликвот этой смеси (30 л) и введите ее в HPLC в трех отдельных инъекциях (10 л для каждой инъекции). Измерьте концентрации остальных доноров(D_xиd_ref)по HPLC в тех же условиях разделения (эфир ацетат/н-Гексан а 20/80) (A_ref)t 24417.0, (A_x)_t 23546.3.
7. Измерьте относительную реактивность между D_x1 против D_r4, k_x1/k_r4 0.0932. На основе относительного значения реактивности D_r4,относительное значение реактивности D_x1 составляет 3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: a : A /D, (A_ref)₀ - 74530.1, (A_x)0 и 26143.0. k _х/к_рефюр (ln'D_хх t - ln'D_xх₀)/(Ln'D_reft - ln'D_ref0) _хх t - ln'_{A x}q₀)/(Ln'A_reft - ln'A_ref0) 0.0932.

3. Одногоршковая гликозилация SSEA-4

1. Поместите 10 мл кругло-дно колбу под вакуумом, пламя сухой его, и позволяют колба остыть до RT в то же время под вакуумом. Удалите резиновую перегородку, чтобы добавить смесь дисахарида 1 донора (38 мг, 1,1 экв., 0,057 ммоль), первый прием2 (40 мг, 1,0 экв., 0,053 ммоль) и столбик магнитного перемешивания в колбу.
2. Перенесите 100 мг порошкообразного молекулярного сито 4 кв. м в колбу с круглым дном 5 мл. Держите эту колбу под вакуумом, пламя сухой его, и позволяют колба остыть до RT в то время как еще под вакуумом. Перенесите свежевысушенные молекулярные сито в первую колбу, содержащую исходный материал.
3. Передача 1 мл свежевысушенного DCM в колбу. Перемешать реакционную смесь в течение 1 ч на РТ, а затем поместить ее при температуре -40 градусов по Цельсию. Перенесите NIS (13 мг, 1,1 экв., 0,057 ммоль) в колбу.
4. Впрысните TfOH (34 зЛ, 0,3 экв., 0,017 ммоль, 0,5 М в эфире) в колбу через перегородку с помощью микрообъемного шприца при -40 градусов по Цельсию. Держите перемешивания при -40 градусах по Цельсию в течение 3 ч.
5. После первого приемного 2 почти потребляется, вводить раствор приемного 3 в DCM в колбу через перегородку.
6. Разогрейте реакционную смесь до -20 градусов и перенесите В колбу NIS (19 мг, 1,6 эк., 0,083 ммоль). Введите TfOH (34 л, 0,3 экв., 0,017 ммоль, 0,5 М в эфире) в колбу через перегородку при -20 градусов по Цельсию. Держите перемешивания при -20 градусах по Цельсию в течение 3 ч.
7. После того, как продукт первой реакции шага потребляется, утолить реакцию путем введения двух эквивалентов триэтил амина. Удалите молекулярное сито через воронку фильтра, упакованную с Celite, соберите фильтр в колбу с круглым дном 25 мл и промойте фильтр 10 мл DCM.
8. Перенесите фильтррат в сепараторную воронку и промойте его насыщенным водным тиосульфатом натрия, содержащим 10% NaHCO₃ (2x с 10 мл каждый). Извлекайте свочный слой с DCM (3x с 10 мл). Смешайте органические слои и промойте смесь рассолом (10 мл) и высушите ее, добавив ангидроус MgSO_4. Фильтр его и собирать фильтрвать в 100 мл кругло-дно колбы.
9. Удалите растворитель с помощью вращающегося испарителя. Растворите сырую смесь примерно с 1 мл DCM и загрузите ее на верхней части кремнеземной кровати. Вылейте продукт со смесью этилового ацетата и толуола (EtOAc/toluene, 1/4 до 1/2) и соберите фракции.
10. Удалите растворитель с помощью вращающегося испарителя. Сухие остатки под пониженным давлением, чтобы дать полностью защищены SSEA-4 производных 4 (74 мг, 50% на основе приемного 2) в качестве белой пены.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Результат поиска Auto-CHO, основанный на параметрах по умолчанию, указывает на то, что SSEA-4 может быть синтезирован реакцией на один горшок. На рисунке 3 показан скриншот программного обеспечения результата поиска SSEA-4. При выборе трисахарида, уменьшающего к...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Программное обеспечение Auto-CHO было разработано для оказания помощи химикам в продолжении иерархического и программируемого синтеза олигосахаридов⁵. Auto-CHO был построен на языке программирования Java. Это программное обеспечение GUI и кросс-платформенный, который в настоящее в...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	75-05-8
Anhydrous magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Cerium ammonium molybdate	TCI	C1794
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	75-09-2
Drierite	Sigma-Aldrich	7778-18-9
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	141-78-6
Methanol	Sigma-Aldrich	67-56-1
Molecular sieves 4 Å	Sigma-Aldrich
n-Hexane	Sigma-Aldrich	110-54-3
N-Iodosuccinimide	Sigma-Aldrich	516-12-1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	144-55-8
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich	10102-17-7
Toluene	Sigma-Aldrich	108-88-3
Trifluoromethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	1493-13-6