عزل مجموعات الضامة والخلايا اللحمية من الإنسان والماوس عينات عضله القلب

Summary

يقدم هنا بروتوكول لعزل مختلف المجموعات الفرعية من الضامة وغيرها من الخلايا غير المناعية من عضله الدم البشرية والماوس من خلال اعداد تعليق خليه واحده من خلال الهضم الانزيمي. وتعرض أيضا مخططات الصب لتحديد وتوصيف الضامة المعزولة علي أساس التدفق الخلوي.

Abstract

الضامة تمثل الأكثر تجانسا ووفره الخلايا المناعية السكان في القلب وهي مركزيه في القيادة التهاب والاستجابات التعويضية بعد أصابه القلب. كيف المجموعات الفرعية المختلفة من الضامة تنسق الاستجابات المناعية بعد أصابه القلب هي منطقه نشطه من البحوث. المقدمة هنا هو بروتوكول بسيط ان مختبرنا ينفذ بشكل روتيني ، لاستخراج الضامة من الفئران والعينات البشرية عضله العين التي تم الحصول عليها من الافراد الأصحاء والمريضة. باختصار ، ينطوي هذا البروتوكول علي الهضم الانزيمي لأنسجه القلب لتوليد تعليق خليه واحده ، تليها تلطيخ الأجسام المضادة ، وتدفق الخلايا الخلوية. هذه التقنية هي مناسبه لاختبارات وظيفية أجريت علي الخلايا فرزها ، فضلا عن الجزء الأكبر وخليه واحده التسلسل RNA. ومن المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هو بساطته ، الحد الأدنى من يوم إلى يوم الاختلاف وتطبيق واسعه تسمح التحقيق في تغاير الضام عبر مختلف نماذج الماوس والكيانات البشرية المرض.

Introduction

الضامة تمثل الأكثر وفره من نوع الخلايا المناعية في القلب ، وانها تلعب أدوارا هامه في توليد ردود الفعل التهابيه والتعويضية القوية بعد أصابه القلب^1،2،3،4. في السابق ، حددت مجموعتنا مجموعتين رئيسيتين من الضامة في قلب murine مشتقه من أصول تنموية متميزة^5،6. علي نطاق واسع ، يمكن تحديد السكان متميزة من الانسجه المقيمين القلب الضامة المجموعات الفرعية استنادا إلى التعبير سطح الخلية من CCR2 (C-C عزر المستقبلات chemokine 2). CCR2^{الضامة (} التعبير سطح الخلية: CCR2^{المنخفضة} و CCR2^-mhcii^عاليه) هي من أصل جنيني (السلالات البدائية والحمرة) ، قادره علي التجديد الذاتي ، وتمثل السكان المهيمنة تحت ظروف التماثل المنزلي. CCR2^{المقيمين +} الضامة هي من أصل نهائي الدم ، ويتم الحفاظ عليها من خلال التوظيف من الخلايا الاحاديه المتداولة ، وتمثل السكان القاصرين تحت ظروف التماثل المنزلي. وظيفيا ، CCR2^الضامة توليد الحد الأدنى من التهابات وهي حاسمه للتنمية التاجية القلب الوليد التجديد^5،7. في المقابل ،^{CCR2 +} الضامة بدء استجابات التهابيه قويه بعد الإهانات القلبية والمساهمة في التبعية عضله الاصابه ، وأعاده عرض سلبيه من البطين الأيسر ، وفشل القلب التقدم^8،9.

في الاونه الاخيره ، لقد أظهرنا ان عضله العين البشرية تحتوي أيضا علي مجموعتين فرعيتين متميزتين من الضامة التي تم تعريفها بالمثل^{اما CCR2 أو CCR2 +8}. وكشفت التعبيرات الجينية والتحليلات الوظيفية ان الCCR2^{البشرية} والCCR2 + الضامة تمثل مجموعات فرعيه متباعدة وظيفيا ومشابهه وظيفيا^لCCR2 والCCR2 + الضامة الموجودة في قلب الماوس. الإنسان CCR2^الضامة التعبير عن مستويات قويه من عوامل النمو ، بما في ذلك IGF1 ، Pdgf ، Cyr61 ، و HB-egf. ^{CCR2 +} الضامة المخصب في مستقطبات والخلوية التي تعزز التهاب ، مثل il-1b ، آيل-6 ، سي سي-2 ، سي سي-7 ، و tnf-a. حفز^{CCR2 +} الضامة تفرز مستويات اعلي بشكل ملحوظ من التهابات السايسيسين انترلوكين-1Β (IL-1β) في الثقافة. كيف تساهم هذه المجموعات الفرعية بشكل مختلف في إصلاح الانسجه وأعاده عرض البطين الأيسر (LV) في سياق أصابه القلب لا يزال مجالا للبحوث النشطة.

تحليل التدفق الخلوي القائم علي التجانس الضام في الماوس والقلب البشري يتطلب هضم انسجه القلب وتوليد تعليق خليه واحده تليها تحليل تدفق الخلوية أو فرز الخلايا لمزيد من العمليات المصب مثل التسلسل RNA السائبة/خليه واحده الجيش النيبالي التسلسلي التسلسل أو الخلايا لاختبارات وظيفية. البروتوكول الأصلي لاجراء تعليق خليه واحده من قلوب murine وأبلغت لأول مره من قبل مجموعه ناهريندورف في ناهريندورف وآخرون 2007¹⁰. لدينا مختبر تكييف وتعديل البروتوكول لاستخراج الضامة من عضله العضل البشرية. باستخدام نفس البروتوكول ولكن مع تعديل طفيف في تلطيخ ومخطط النابضة ، ويمكن أيضا ان^{تحصد الخلايا CD45 من} عضله الام البشرية. يقدم هنا ، في النص والفيديو ، هو البروتوكول الذي يتم تنفيذه بشكل روتيني لاستخراج الضامة أو اللحمية من عضله الدم البشرية.

يتم الحصول علي عينات الانسجه القلبية من المرضي البالغين الذين يعانون من اعتلال عضله القلب المتوسع (DCM: مجهول الشخص أو العائلي) أو اعتلال العضلة الدماغية (ICM) الذي يخضع لعمليه غرس أو زرع القلب في جهاز مساعده البطين الأيسر (LVAD). القلوب المفسرة أو النوى LVAD هي إينترافاسكولارلي perfused مع المحلول الملحي البارد قبل بدء عمليه الهضم. من المهم ان نلاحظ ان "نوعيه" عينه من الانسجه التي تحدد من حيث درجه من تندب أو تسلل الانسجه الدهنية يمكن ان تؤثر بشكل كبير علي الغلة من الضامة. عينات القلب مع مساحات كبيره من تندب سيكون لها اقل بكثير من الغلة الخلية ويمكن ان تشكل القيود الفنية خطيره عند المطلوب أساليب التحليل المصب تتطلب في المختبر الخلية الخياطة.

Protocol

وقد وافقت جامعه واشنطن في مجلس سانت لويس للاستعراض المؤسسي علي البروتوكول المقدم (#201305086). وتوفر جميع المواد الموافقة المستنيرة قبل جمع العينات وتجري التجارب وفقا لبروتوكول الدراسة المعتمد. يتم تنفيذ البروتوكول المعروض بموافقه اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها في كليه الطب بجامعه واشنطن ويتبع المبادئ التوجيهية الموصوفة في دليل المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية.

1. اعداد عينات انسجه القلب البشرية

1. مسح القلوب المفسرة عن طريق تعليب الشريان التاجي الأيسر والأيمن اوستيا والحقنت مع 200 مل من المحلول الملحي البارد.
2. دافق المناديل الورقية لل lvad قمي عن طريق تعليب السفينة الابيميه و حقنت مع 50 مل من المياه المالحة الباردة.
3. تشريح عينه من الانسجه من الجدار الجانبي أو الأفقي للبطين الأيسر في المحلول الملحي البارد أو HBSS باستخدام مقص معقم.
4. تشريح بعناية من الدهون الذواقة و قلبي أوتار من العينة باستخدام مقص غرامه.
5. تشريح قطع الانسجه إلى قطع تزن حوالي 200 ملغ مع مساعده من شفره معقمه أو مقص.

2. اعداد قلب الماوس

1. موت ببطء الماوس بواسطة CO₂ اختناق أو خلع عنق الرحم.
2. فتح تجويف الصدر بمساعده مقص حاد. استخدام الأرقاء حاده لرفع القلب صعودا. Perfuse القلب مع تلفزيونيه الباردة باستخدام ابره 25 G تعلق علي حقنه 5 مل. Perfuse حتى يظهر القلب مقشر في اللون.
3. أزاله القلب ووضع في طبق بيتري معقمه علي الجليد.

3. اعداد تعليق خليه واحده

1. وضع قطع انسجه القلب البشرية (~ 200 ملغ) أو القلب murine في طبق بيتري معقمه. فرم النسيج ناعما باستخدام شفره معقمه أو مقص.
2. اعداد الهضم:
   1. استخدام حجم الهضم النهائي من 3 مل لكل قطعه انسجه القلب البشرية (200 ملغ) أو لكل قلب murine واحد. تركيزات الانزيم النهائي هي علي النحو التالي: Collagenase1 (450 U/mL) ، DNase1 (60 U/mL) ، حمض الهيالورونيك (60 U/mL).
   2. لكل رد فعل الهضم أضافه DMEM وجميع الانزيمات إلى أنبوب مخروطي 15 مل. مع مساعده من ملقط نظيفه ، ووضع الانسجه المفرومة ناعما في كل أنبوب رد فعل. اخلط جيدا بواسطة الفورتكينغ اللطيف.
3. هضم ل 1 ح في 37 درجه مئوية في حاضنه تهتز تعيين إلى سرعه الانفعالات منخفضه إلى متوسطه.
4. بعد 1 ساعة من الهضم ، وإخراج الأنابيب من الحاضنة ومكان علي الجليد. اعداد 50 mL أنابيب مخروطيه مع مصفاه الخلية 40 μm علي القمه. الرطب المرشحات مع 2 مل من انزيم تعطيل (ED) العازلة.
5. إلغاء تنشيط انزيمات الهضم عن طريق أضافه 8 مل من العازلة ED لكل أنبوب الهضم. ثم صب الناتج 13 مل الخليط الكلي من خلال مصفاه الخلية 40 μm في أنابيب مخروطيه 50 mL. نقل العينات مره أخرى في أنبوب مخروطي 15 مل الطازجة. وهذا يتيح التكوير الخلية الأمثل ويقلل من فقدان الخلايا اثناء الطرد.
6. تدور العينات في 400 x g لمده 6 دقائق (جهاز الطرد المركزي تعيين في 4 درجه مئوية). تجاهل ماده طافي ترك 0.5 mL من وسائل الاعلام. أعاده تعليق بيليه الخلية بواسطة الأنابيب لطيف وأضافه 1 مل من المخزن المؤقت تحلل ACK. قم بتحريك الأنبوب برفق وحضنه في درجه حرارة الغرفة لمده 5 دقائق لأداء خلايا الدم الحمراء (ربك) تحلل.
7. بعد 5 دقائق في المخزن المؤقت ACK ، أضافه 9 مل من DMEM إلى العينة. وضع الغطاء مره أخرى إلى الأنابيب وعكس بلطف أنابيب لخلط ، وتصفيه من خلال مصفاه الخلية 40 μm. جمع الترشيح في 15 مل أنابيب مخروطيه.
8. الطرد المركزي الأنابيب في 400 x g لمده 6 دقائق وتجاهل supernatant.
9. أضافه 1 مل من المخزن المؤقت FACS وأعاده تعليق بيليه. ثم نقل في الخلايا في المخزن المؤقت FACS إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL. الطرد المركزي مره أخرى في 400 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 100 μl من المخزن المؤقت facs. تعليق خليه واحده جاهزه الآن لتلطيخ الأجسام المضادة.

4. تلطيخ الأجسام المضادة

1. تتكون لوحه الأجسام المضادة البشرية النموذجية من الأجسام المضادة التالية: CD45, CD14, CD64, هلا-د-APC/Cy7, CCR2-APC. يرجى الرجوع إلى الجدول 1. أضافه جميع الأجسام المضادة إلى عينات القلب في 1:50 التخفيف واحتضان ل ~ 30-40 دقيقه في 4 درجه مئوية في الظلام. انتقل إلى الخطوة 4.4 أدناه.
2. للخلايا اللحمية (الخلايا البطانية ، الليفية ، خلايا العضلات الملساء) ، أضافه DRAQ5 (1 μM التركيز النهائي) و CD45-percpCy 5.5. يرجى الرجوع إلى الجدول 1. احتضان لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية في الظلام. انتقل إلى الخطوة 4.4 أدناه.
3. بالنسبة للضامة القلب murine أضافه الأجسام المضادة التالية: CD45-بيركبيسي 5.5 ، CD64 ، MHCII-APC/Cy7 ، CCR2 BV421 ، و Ly6G-FITC. يرجى الرجوع إلى الجدول 2. أضافه جميع الأجسام المضادة إلى عينات القلب في 1:100 التخفيف واحتضان ل ~ 30-40 دقيقه في 4 درجه مئوية في الظلام. انتقل إلى الخطوة 4.4 أدناه.
4. غسل العينات مرتين في المخزن المؤقت FACS. لكل غسل ، أضافه 1 مل من العازلة FACS ، دوامه بلطف ، والطرد المركزي في 400 x g لمده 5 دقائق ، أعاده التعليق في 350 μl من المخزن المؤقت facs وأضافه dapi (1 μM ، التركيز النهائي). عينات جاهزه الآن ل FACS التحليل/الفرز.

النتائج

البروتوكول الموصوف يسمح بعزل الضامة من الماوس وعضله الام البشرية. باستخدام نفس البروتوكول ، ولكن مع تلطيخ مختلفه واستراتيجية النابضة ، ويمكن أيضا ان تحصد الخلايا اللحمية من عضله الام البشرية. تم الحصول علي نتائج FACS المعروضة هنا اما علي BD لسريي أو BD FACS ARIA الثالث منصة. تم إ?...

Discussion

يسمح البروتوكول لاستخراج المجموعات الفرعية الضامة المختلفة من عضله الام البشرية. البروتوكول بسيط ويستغرق 3 إلى 4 ساعات لاعداد تعليق خليه واحده جاهزه للتحليل FACS. وعلي الرغم من ان تنفيذ البروتوكول بسيط نسبيا ، فان هناك بعض الجوانب التقنية التي يتعين النظر فيها والتي ستقلل من التغير إلى ادني...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conocal Tubes	Thermo Fisher	14-959-53A
40 µm Cell Strainers	Thermo Fisher	50-828-736
50 mL Conical Tubes	Thermo Fisher	352098
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2058
Collagenase 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
DNAse 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0.5M pH 8	Corning	46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer			490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer			976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3840201
Forceps	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
Hemostats	VWR	63042-052
Hyaluronidase type 1-s	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
Petridishes	Thermo Fisher	172931
Razor Blade	VWR	55411-050
Scissors	VWR	82027-578