בידוד של מקרופאג קבוצות מערכות ותאים סטרומה מתוך שריר הלב של האדם והעכבר דגימות

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים ותאים אחרים שאינם חסינים מפני שריר הלב של האדם והעכבר על ידי הכנת תא השעיה יחיד באמצעות עיכול אנזימטי. מערכות המשך הזדהות לצורך זרימה cy, מבוססי זיהוי ואפיון של מקרופאגים מבודדים מוצגים גם.

Abstract

מקרופאגים מייצגים את אוכלוסיית התא הטרוגנית ביותר ושופע החיסונית בלב הם מרכזיים בנהיגה בדלקת ותגובות מענה לאחר פציעה לב. כיצד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים לארגן את התגובות החיסונית לאחר פגיעה בלב הוא תחום פעיל של מחקר. מוצג כאן הוא פרוטוקול פשוט כי המעבדה שלנו מבצעת באופן שגרתי, עבור החילוץ של מקרופאגים מן העכבר ושריר הלב האנושי באמצעות דגימות שהתקבלו מאנשים בריאים וחולים. בקצרה, פרוטוקול זה כרוך בעיכול אנזימטי של רקמת הלב כדי ליצור השעיה תא בודד, ואחריו כתמים נוגדן, ולזרום cy, לנסות. טכניקה זו מתאימה עבור בחני פונקציונלי שבוצעה על תאים ממוינים, כמו גם בצובר תאים בודדים RNA ברצף. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הפשטות שלה, יום מינימלי הווריאציה היום והישימות רחב המאפשר חקירה של מקרופאג טרוגניות על פני מודלים העכבר השונים ישויות המחלה האנושית.

Introduction

מקרופאגים מייצגים את הסוג הנפוץ ביותר התא החיסונית בלב, והם משחקים תפקידים משמעותיים ביצירת מענה דלקתי ומשנה תגובות בעקבות פגיעה לב^1,2,3,4. בעבר, הקבוצה שלנו זיהה שתי קבוצות מערכות מרכזיות של מקרופאגים בליבו של מוראו נגזר ממקורות^{התפתחותיים ברורים 5,6}. באופן כללי, אוכלוסיות נפרדות של הרקמה תושב מקרופאג מערכות המשנה הלב יכול להיות מזוהה מבוסס על הביטוי משטח התא של CCR2 (C-C מוטיב קולטן כימוקין 2). CCR2^- מקרופאגים (משטח התא ביטוי: CCR2^-MHCII^נמוך ו CCR2^-mhcii^גבוה) הם של מוצא עובריים (פרימיטיבי ואריטרומטיות לינאואיד), מסוגל לחדש את עצמו, ולייצג אוכלוסייה דומיננטית תחת תנאים הומסטטיים. תושב CCR2⁺ מקרופאגים הם של מוצא מוחלט המטופאות, נשמרים באמצעות גיוס מתוך במחזור מונוציטים, ומייצגים אוכלוסיה קטין תחת תנאים הומסטטיים. פונקציונלית, CCR2^- מקרופאגים ליצור דלקת מינימלית הם קריטיים להתפתחות כלילית בלב התחדשות הלב^5,7. לעומת זאת, CCR2⁺ מקרופאגים ליזום תגובות דלקתיות חזקים בעקבות עלבונות לב ולתרום לפציעה קרדיולוגית מודלקת, שיפוץ לוואי של החדר השמאלי, ואת אי ספיקת לב התקדמות^8,9.

לאחרונה, הצגנו שריר הלב האנושי גם מכיל שתי קבוצות מערכות נפרדות של מקרופאגים המזוהים באופן דומה^{גם CCR2 או} CCR2^+8. ביטוי גנים וניתוחים פונקציונליים חשף כי האדם CCR2^- ו CCR2⁺ מקרופאגים לייצג תת מערכות מבחינה פונקציונלית ו הם אנלוגית פונקציונלית CCR2^{- ו CCR2} מקרופאגים נמצא בלב העכבר. האדם CCR2^- מקרופאגים לבטא רמות עמידות של גורמי גדילה, כולל IGF1, Pdgf, Cyr61, ו-HB-egf. CCR2⁺ מקרופאגים מועשרים נוגדנים ו ציטוקינים המעודדים דלקת, כגון il-1b, il-6, ccl-2, ccl-7, ו-tnf-a. מגורה CCR2⁺ מקרופאגים להפריש רמות גבוהות במידה ניכרת של ציטוקינים דלקתיות interleukin-1β (IL-1β) בתרבות. כיצד ערכות המשנה הללו לתרום באופן מהותי לתיקון רקמות ושמאלית חדרית (LV) שיפוץ בהקשר של פציעה בלב נשאר שטח של מחקר פעיל.

זרימה-cyמקרופאג try ניתוח מבוסס של טרוגניות בעכבר וללב האדם דורש לעכל את רקמת הלב ויצירת השעיית תא יחיד ואחריו הניתוח cy, מיון התא עבור תהליכים נוספים במורד הזרם כגון בצובר ברצף RNA/תא יחיד RNA רצפי או culturing תאים עבור assays פונקציונלי. הפרוטוקול המקורי לביצוע השעיית תא בודד מלבבות מורדין דווחו לראשונה על ידי קבוצת נחרנדורף בנחדורף ואח '. 2007¹⁰. המעבדה שלנו הותאמה ושינתה את הפרוטוקול לחלץ מקרופאגים משריר הלב האנושי. באמצעות הפרוטוקול אותו אך עם שינוי קל בצביעת והערכה, התאים CD45^- סטרומה משריר הלב האנושי וניתן גם לקצור. מוצג כאן, בטקסט ובווידאו, הוא פרוטוקול המתבצע באופן שגרתי עבור חילוץ של מקרופאגים או סטרומה משריר הלב האנושי.

דגימות של רקמות לב מתקבלים מחולים מבוגרים עם שריר הלב מורחבים (DCM: אידיופטית או משפחתית) או מחלת שריר הלב (ICM) שעברו שמאל חדרית לסייע המכשיר (LVAD) השרשה או השתלת לב. לבבות הסבר או ליבות LVAD הם בלתי מפותחים עם תמיסת מלח קר לפני תחילת תהליך העיכול. חשוב לציין כי "איכות" של הדגימה הרקמה נקבע במונחים של מידת צלקות או הסתננות רקמת שומן יכול מאוד להשפיע על התשואה של מקרופאגים. דגימות לב עם אזורים גדולים של צלקות יהיה הרבה יותר תאים התשואה הנמוכה והוא יכול להוות מגבלה טכנית רצינית כאשר הרצוי המטה ניתוח שיטות דורשים תא מתורבת culturing.

Protocol

הפרוטוקול המוצג אושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בלוח הסקירה המוסדי של סנט לואיס (#201305086). כל הנושאים מעניקים הסכמה מושכלת לפני איסוף המדגם והניסויים מתבצעים בהתאם לפרוטוקול הלמידה המאושר. הפרוטוקול המוצג מבוצע עם אישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש באוניברסיטת וושינגטון בבית הספר לרפואה וכדלקמן ההנחיות המתוארות במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנת דגימות של רקמת לב האדם

1. פלאש הסבר לבבות על ידי cannulating השמאלי והימני של עורק העורקים הכליליים ואת מבשם עם 200 mL של תמיסת מלח קר.
2. ריקון הרקמות האפימיות של LVAD על ידי canנולגאת כלי הקיבול ומבשם עם 50 mL של תמיסת מלח קר.
3. מנתח רקמות הדגימה מן הקיר פסגה או לרוחב של החדר השמאלי בתמיסת מלח קר או hbss באמצעות מספריים סטרילי.
4. בזהירות לנתח את שומן אפיארdial וכורתיים מתוך הדגימה באמצעות מספריים עדינים.
5. נתח נתחי רקמות לחתיכות במשקל כ 200 מ ג עם עזרה של להב סטרילי או מספריים.

2. הכנת לב העכבר

1. המתת חסד העכבר על ידי שיתוף₂ חנק או נקע בצוואר הרחם.
2. פתח את חלל החזה בעזרת מספריים חדים. השתמש במכשיר קהה. כדי להרים את הלב כלפי מעלה מבשם הלב עם ה-PBS הקרה באמצעות מחט של 25 גרם המצורפת למזרק של 5 מ ל. מעשה עד שהלב מופיע בצבע.
3. הסר את הלב והמקום בצלחת פטרי סטרילית על הקרח.

3. הכנת תא יחיד הבולם

1. מניחים נתחי רקמת לב אנושיים (~ 200 מ"ג) או לב מורין בצלחת פטרי סטרילית. שימוש דק ברקמה או במספריים סטריליים.
2. הגדר את העיכול:
   1. השתמש בנפח העיכול הסופי של 3 מ ל לחלק רקמת הלב האנושית (200 mg) או ללב מורין אחד. ריכוזי האנזים הסופיים הם כדלקמן: Collagenase1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).
   2. עבור כל תגובת עיכול להוסיף DMEM ואת כל האנזימים ל 15 מ"ל צינור חרוט. בעזרת מלקחיים נקיים, מניחים את הרקמה הקצוצה לתוך כל צינורית התגובה. מערבבים היטב על ידי הורטקנג עדין.
3. מעכל עבור 1 h ב 37 ° c בחממה רועדת מוגדר מהירות נמוכה עד בינונית.
4. לאחר 1 שעות של עיכול, להוציא את הצינורות מתוך החממה ומקום על הקרח. הגדר את 50 mL חרוט צינורות עם מסננת תא 40 יקרומטר על גבי. להרטיב את המסננים עם 2 מ ל של הפסקת אנזימים (ED) מאגר.
5. לנטרל את אנזימי העיכול על ידי הוספת 8 מ ל של מאגר ED לכל צינור עיכול. לאחר מכן יוצקים את כתוצאה 13 ml שילוב כולל דרך מסננת תא 40 יקרומטר לתוך הצינורות החרוטי 50 mL. העבר את הדגימות חזרה בצינור החרוט החדש של 15 מ"ל. זה מאפשר להתאים את התא אופטימלית וממזער את אובדן התאים במהלך צנטריפוגה.
6. לסובב את דגימות ב 400 x g עבור 6 דקות (צנטריפוגה להגדיר ב 4 ° c). להיפטר supernatant עוזב 0.5 mL של מדיה. השהה מחדש את הגלולה על ידי ליטוף עדין והוסף 1 mL של מאגר הליזה ACK. בעדינות מערבולת הצינור והדגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות לבצע הליזה תא דם אדום (RBC).
7. לאחר 5 דקות במאגר ACK, הוסף 9 מ"ל של DMEM למדגם. לשים את המכסה בחזרה על הצינורות בעדינות להפוך את הצינורות לערבב, ולסנן דרך מסננת תא 40 יקרומטר. לאסוף את פילטרט ב 15 מ"ל שפופרות חרוט.
8. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x g עבור 6 דקות ולהיפטר supernatant.
9. הוסף 1 מ ל של מאגר FACS והשהה מחדש את הגלולה. לאחר מכן העבירו את התאים במאגר FACS לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. צנטריפוגה שוב ב 400 x g עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב 100 μl של מאגר facs. השעיית תא בודד מוכן כעת לצביעת נוגדנים.

4. מכתים את הנוגדן

1. פאנל הנוגדן האנושי טיפוסי מורכב של נוגדנים הבאים: CD45-PercpCy 5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. נא פנה לטבלה 1. הוסף את כל הנוגדנים לדגימות הלב ב-1:50 דילול ו-דגירה עבור ~ 30-40 דקות ב 4 ° c בחושך. המשך לשלב 4.4 למטה.
2. עבור תאים סטרומה (תאים אנדותל, פיברובלסט, תאי שריר חלק), הוסף DRAQ5 (1 הריכוז הסופי μM) ו-CD45-percpCy 5.5. נא פנה לטבלה 1. המשך 30 דקות ב -4 ° c בחשכה. המשך לשלב 4.4 למטה.
3. עבור מקרופאגים לב מורלין להוסיף את הנוגדנים הבאים: CD45-PercpCy 5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421, ו Ly6G-FITC. . אנא פנה לשולחן 2 הוסף את כל הנוגדנים לדגימות הלב ב-1:100 דילול ו-דגירה עבור ~ 30-40 דקות ב 4 ° c בחושך. המשך לשלב 4.4 למטה.
4. שטוף את הדגימות פעמיים במאגר FACS. עבור כל כביסה, להוסיף 1 מ ל של מאגר FACS, בעדינות מערבולת, ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות, להשעות מחדש ב 350 μl של מאגר facs ולהוסיף dapi (1 μm, ריכוז סופי). הדגימות מוכנות כעת לניתוח/מיון של FACS.

תוצאות

הפרוטוקול תיאר מאפשר בידוד של מקרופאגים מהעכבר ושריר הלב האנושי. באמצעות הפרוטוקול אותו, אבל עם כתמים שונים האסטרטגיה לאחר הפעולה, התאים סטרומה יכול גם להיות נקצרו משריר הלב האנושי. תוצאות FACS המוצגות כאן נרכשו על פלטפורמת השלישי BD או BD. שולטת הפיצוי נוצרו מדגימות של בקרת ...

Discussion

הפרוטוקול מאפשר חילוץ של תת קבוצות ממקרופאג שונות משריר הלב האנושי. הפרוטוקול הוא פשוט ולוקח 3 כדי 4 שעות כדי להכין ההשעיה תא יחיד מוכן ניתוח FACS. למרות שהפרוטוקול הוא פשוט יחסית לביצוע, ישנם היבטים טכניים מסוימים שצריך להיחשב שיצמצם את השונות. ראשית, עבודה בזמן האופנה עם רקמת האדם היא הכרחי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conocal Tubes	Thermo Fisher	14-959-53A
40 µm Cell Strainers	Thermo Fisher	50-828-736
50 mL Conical Tubes	Thermo Fisher	352098
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2058
Collagenase 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
DNAse 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0.5M pH 8	Corning	46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer			490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer			976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3840201
Forceps	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
Hemostats	VWR	63042-052
Hyaluronidase type 1-s	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
Petridishes	Thermo Fisher	172931
Razor Blade	VWR	55411-050
Scissors	VWR	82027-578