نموذج مورين من تأثير القشرية التي تسيطر عليها للتحريض من إصابات الدماغ الصادمة

Summary

هنا نقوم بوصف بروتوكول لتحريض إصابة الدماغ الرماة من مورين عن طريق تأثير القشرية المفتوحة الرأس التي تسيطر عليها.

Abstract

وتقدر مراكز مكافحة الأمراض والوقاية من الإصابات أن ما يقرب من 2 مليون شخص يعانون من إصابات الدماغ الصادمة (TBI) كل عام في الولايات المتحدة. وفي الواقع، فإن معدل الوفيات الناجمة عن الإصابة هو عامل يسهم في أكثر من ثلث جميع الوفيات المتصلة بالإصابات. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء الفيزيولوجيا المرضية لـ TBI غير مفهومة بشكل جيد. وهكذا، فإن النماذج ما قبل السريرية من TBI قادرة على تكرار آليات الإصابة ذات الصلة TBI في المرضى البشر هي حاجة بحثية حاسمة. يستخدم نموذج التأثير القشري الخاضع للرقابة (CCI) من TBI جهازًا ميكانيكيًا للتأثير مباشرة على القشرة المكشوفة. في حين لا يمكن لأي نموذج تلخيص كامل أنماط الإصابات المتباينة والطبيعة غير المتجانسة من TBI في المرضى البشر، CCI قادرة على تحفيز مجموعة واسعة من TBI قابلة للتطبيق سريريا. وعلاوة على ذلك، فإن وحدة التنسيق التنسيقية يمكن توحيدها بسهولة مما يسمح للمحققين بمقارنة النتائج عبر التجارب وكذلك عبر أفرقة التحقيق. البروتوكول التالي هو وصف مفصل لتطبيق CCI شديدة مع جهاز تأثير المتاحة تجاريا في نموذج murine من TBI.

Introduction

وتقدر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية من الإصابات أن ما يقرب من2 مليون أميركي يعانون من إصابة الدماغ الصادمة (TBI) كل عام 1,². في الواقع، تساهم TBI في أكثر من 30٪ من جميع الوفيات المرتبطة بالإصابات في الولايات المتحدة مع تكاليف الرعايةالصحية تقترب من 80 مليار دولار سنويا وحوالي 4 ملايين دولار للشخص الواحد في السنة على قيد الحياة من TBI شديدة 3،^4،5. يتم تسليط الضوء على تأثير TBI من خلال المضاعفات العصبية المعرفية والعصبية النفسية العصبية الكبيرة على المدى الطويل التي يعاني منها الناجون مع بداية خبيثة من العاهات السلوكية والمعرفية والحركية تسمى اعتلال الدماغ الصادم المزمن (CTE) ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10.}حتى الأحداث الارتجاجية تحت السريرية - تلك الآثار التي لا تؤدي إلى أعراض سريرية - يمكن أن يؤدي إلى خلل عصبي طويل الأجل^11،12.

وقد استخدمت نماذج الحيوان لدراسة TBI منذ أواخر 1800 في¹³. في الثمانينات، تم تطوير تأثير هوائي لغرض نمذجة TBI. ويشار إلى هذه الطريقة الآن باسم تأثير القشرية الخاضعة للرقابة (CCI)¹⁴. أدى التحكم واستنساخ CCI الباحثين لتكييف النموذج للاستخدام في القوارض¹⁵. يستخدم مختبرنا هذا النموذج للحث على TBI عن طريق تأثير متاح تجاريا وجهاز التشغيل الإلكتروني^16،17. هذا النموذج قادر على إنتاج مجموعة واسعة من الدول TBI المطبقة سريريا اعتمادا على المعلمات الميكانيكية الحيوية المستخدمة. التقييم الهيستلوجي لأدمغة TBI بعد الإصابة الشديدة الناجمة عن مختبرنا يدل على فقدان كبير في القشرية وفرس النهر، فضلا عن وذمة وتشوه. بالإضافة إلى ذلك، تنتج CCI ضعف ثابت في الوظائف الحركية والمعرفية كما تقاس بالاختبارات السلوكية¹⁸. وتشمل القيود المفروضة على غرفة التجارة والصناعة الحاجة إلى استئصال الجمجمة ونفقات الحصول على جهاز الصدم والتشغيل.

العديد من النماذج الإضافية من TBI موجودة وراسخة في الأدب بما في ذلك نموذج قرع السوائل الجانبية, نموذج انخفاض الوزن, وانفجار نموذج الإصابة^19,20,21. في حين أن كل من هذه النماذج لها مزاياها المتميزة الخاصة بها عيوبها الرئيسية هي الإصابات المختلطة، وارتفاع معدل الوفيات وعدم التوحيد القياسي، على التوالي²². وعلاوة على ذلك، لا أحد من هذه النماذج يقدم دقة ودقة وقابلية استنساخ CCI. من خلال ضبط مدخلات المعلمات الميكانيكية الحيوية في جهاز التشغيل، يسمح نموذج CCI للمحقق بالتحكم الدقيق في حجم الإصابة، وعمق الإصابة، والطاقة الحركية المطبقة على الدماغ. وهذا يعطي المحققين القدرة على تطبيق الطيف الكامل من TBI إلى مناطق محددة من الدماغ. كما أنه يسمح بأكبر قدر من التكرار من التجربة إلى التجربة.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نورث ويسترن على جميع الإجراءات. تم شراء الفئران C57BL/6 من مختبر جاكسون ومجموعة تقع في منشأة حاجز في مركز الطب المقارن في جامعة نورث ويسترن (شيكاغو، إلينوي). تم إيواء جميع الحيوانات في 12/12 ساعة ضوء / دورة مظلمة مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.

1. حث التخدير

1. التخدير الماوس مع الكيتامين (125 ملغ / كغ) وxylazine (10 ملغ / كغ) حقن داخل اقابي.

2. علامات حيوية رصد كل 15 دقيقة

1. مراقبة درجة الحرارة، ومعدل التنفس، ولون الجلد. يجب أن يشعر الماوس الحارة لمسة. يجب أن تظهر البشرة الوردي وperfused جيدا. يجب أن يتراوح معدل التنفس 50-70 نفساً في الدقيقة الواحدة.

3. الإجراءات السابقة للجراحة

1. وزن جميع الفئران في اليوم السابق للإصابة التعريفي.
2. تعقيم مجموعة واحدة من الأدوات الجراحية عن طريق الأوتوكلاف لكل موضوع تجريبي. تعقيم الجهاز المؤثر قبل الاستخدام.
3. إعداد قفص الانتعاش عن طريق وضع قفص نظيفة على منصة التدفئة الكهربائية تعيين إلى وضع "منخفضة" ووضعها بطريقة بحيث الفئران يمكن أن تتحرك بعيدا عن الحرارة مرة واحدة المتنقلة.
4. إعداد غرفة العمليات داخل غطاء محرك السيارة تدفق laminar معقمة.
   1. ضع إطار التشغيل المجسم.
   2. قم بإرفاق جهاز التأثير بإطار مجسم.
   3. تعيين جهاز التشغيل مع المعلمات الميكانيكية الحيوية المطلوبة للسرعة والوقت يسكن.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول يتم وصف إصابة دماغية شديدة باستخدام طرف تأثير قطره 3 مم عن طريق استئصال الجمجمة قطره 5 مم مع سرعة محددة عند 2.5 م/ث ووقت يسكن 0.1 s. ويمكن استخدام مجموعة واسعة من البارامترات البيوميكانيكية للحث على الطيف الكامل من TBI.
5. ارتداء معدات الحماية الشخصية الجديدة والقفازات المعقمة.
6. انزعي الفراء من موقع العمليات باستخدام المقصات الكهربائية.
7. تطبيق مرهم opthalmic واقية على عيون الماوس لمنع إصابة القرنية والتجفيف.
8. ضع الماوس في غرفة العمليات.
9. إعداد الجلد مع فرك الجراحية القائمة على اليود بالتناوب مع الكحول ثلاث مرات.

4. تطبيق تأثير القشرية الخاضعة للرقابة

1. يُقطع فروة الرأس 1 سم في خط الوسط مع مشرط يعرض الجمجمة.
2. ضع الماوس داخل إطار تشغيل مجسم من خلال تأمين العظام الزمنية الثنائية بين قضبان الأذن المصغرة وقفل القواطع داخل مشبك قاطع يخلق عقدًا مستقرًا من ثلاث نقاط على رأس الماوس.
3. سحب فروة الرأس بعيدا عن موقع العمليات مع hemostat أو تأمين ملقط لضمان فروة الرأس لا تأتي في اتصال مع بت الحفر أثناء استئصال الجمجمة.
4. تحديد الغرز المترهلة والإكليلية على الجمجمة المكشوفة.
   ملاحظة: يركز هذا البروتوكول استئصال الجمجمة 2 مم اليسار من خياطة sagittal و 2 مم rostral إلى خياطة الإكليل.
5. إجراء عملية استئصال الجمجمة باستخدام الحفر مع بت الحفر trephine.
   1. لإجراء استئصال الجمجمة، أولا ً تنشيط الحفر بأقصى سرعة ثم تطبيق بت الحفر trephine عمودي على الجمجمة في موقع استئصال الجمجمة.
   2. تطبيق لطيف، وحتى الضغط على الحفر بمجرد إجراء اتصال مع الجمجمة. سوف يشعر طفيف "إعطاء" مرة واحدة في الحفر تخترق الجمجمة. لا تخترق دورا الكامنة.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول بت حفر trephine 5 مم لإجراء استئصال الجمجمة.
6. استخدام ملقط وإبرة تحت الجلد مقياس صغير لإزالة رفرف العظام، وفضح تماما الأم دورا الكامنة.
7. تدوير طرف تأثير في مجال المنطوق وخفضه حتى يجعل الاتصال مع الأم دورا المكشوفة. بمجرد إجراء الاتصال سوف جهاز استشعار الاتصال الصك جعل لهجة مسموعة لتنبيه الجراح أن الاتصال قد تم. سيؤدي ذلك إلى علامة نقطة الصفر التي يتم تعيين عمق التشوه منها.
   ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول طرف تأثير 3 مم لتوليد إصابة شديدة. يمكن استخدام نصائح صغيرة مثل 1 مم لتطبيق المزيد من الإصابات المترجمة.
8. سحب طرف التأثير وتعيين عمق التأثير المطلوب عن طريق خفض موقف تأثير على الإطار مجسم.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول نصف إصابة خطيرة عن طريق وضع عمق تشوه إلى 2 ملم.
9. تطبيق الإصابة عن طريق تفعيل تأثير على جهاز التشغيل.
10. تدوير جهاز تأثير خارج الحقل وإزالة الحيوان من الإطار stereotaxic.

5. إغلاق الموقع الجراحي

1. السيطرة على النزيف من الجمجمة وسطح القشرية المصابة مع الضغط المباشر من القطن المعقمة يميل قضيب.
2. تجفيف الجمجمة مع قضيب القطن معقمة يميل.
3. أغلق فروة الرأس على استئصال الجمجمة باستخدام مادة لاصقة جراحية متاحة تجارياً أو خيط حيدة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول يتم استخدام لاصق ة جراحية بيطرية لإغلاق فروة الرأس. لا يتم استبدال رفرف العظام ويتم التخلص منها.

6 - الرعاية والرصد بعد العملية الجراحية

1. إعطاء التسكين بعد العملية الجراحية (على سبيل المثال، إطلاق مستمر البوبرينورفين 0.1-0.5 ملغ / كغ تدار تحت الجلد توفير 72 ساعة من التسكين المستمر).
2. ضع الحيوان في وضع التعافي الجانبي في قفص نظيف مسخن مسبقاً.
3. مراقبة الحيوانات حتى مستيقظا والمحمول، ثم العودة كل فأرة إلى قفصها المنزل.
4. ضمان الوصول المجاني إلى الغذاء والماء. عادة ما يستأنف تناول الطعام والماء العادي في غضون ساعة أو ساعتين بعد الإصابة.
5. قياس وزن الجسم كل ثلاثة أيام طوال التجربة.

النتائج

الصدم يتصاعد مباشرة على الإطار المجسم مما يسمح لقدر 10 درجة مئوية القرار للسيطرة على نقطة التأثير والعمق والاختراق. يمكن للقوى الكهرومغناطيسية المستخدمة نقل سرعات تأثير تتراوح بين 1.5-6 م / ث. وهذا يسمح لدقة لا مثيل لها واستنساخ على مجموعة كاملة من TBI ذات الصلة سريريا. يمكن للمحققين إجراء تجار...

Discussion

هناك العديد من الخطوات التي تعتبر حاسمة لتطبيق إصابة موثوقة ومتسقة. أولا، يجب أن يصل الماوس إلى مستوى عميق من التخدير الجراحي ضمان عدم وجود حركة أثناء أداء استئصال الجمجمة. في حين يمكن استخدام العديد من نظم التخدير للحث على التخدير العام في القوارض، فإن التخدير الذي يحفز الاكتئاب التنفسي ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one for Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Mouse Specific Stereotaxic Base	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines for Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50