Modelo Murino de Impacto Cortical Controlado para la Inducción de Lesiones Cerebrales Traumáticas

Resumen

Aquí describimos un protocolo para la inducción de una lesión cerebral traumática murina a través de un impacto cortical controlado a cabeza abierta.

Resumen

Los Centros para el Control y la Prevención de Lesiones estiman que casi 2 millones de personas sufren una lesión cerebral traumática (TBI) cada año en los Estados Unidos. De hecho, el TBI es un factor que contribuye a más de un tercio de toda la mortalidad relacionada con el daño. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la fisiopatología de la TBI se entienden mal. Por lo tanto, los modelos preclínicos de TBI capaces de replicar los mecanismos de lesión pertinentes a TBI en pacientes humanos son una necesidad crítica de investigación. El modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI utiliza un dispositivo mecánico para impactar directamente la corteza expuesta. Si bien ningún modelo puede recapitular completamente los patrones de lesión dispares y la naturaleza heterogénea de TBI en pacientes humanos, CCI es capaz de inducir una amplia gama de TBI clínicamente aplicable. Además, CCI se estandariza fácilmente permitiendo a los investigadores comparar los resultados entre experimentos, así como entre grupos de investigación. El siguiente protocolo es una descripción detallada de la aplicación de un CCI grave con un dispositivo de impacto disponible comercialmente en un modelo murino de TBI.

Introducción

Los Centros para el Control y la Prevención de Lesiones estiman que aproximadamente 2 millones de estadounidenses sufren una lesión cerebral traumática (TBI) cada año^1,2. De hecho, TBI contribuye a más del 30% de todas las muertes relacionadas con lesiones en los Estados Unidos con costos de atención médica cercanos a $80 mil millones anuales y casi $4 millones por persona por año sobreviviendo a un TBI^{severo 3,4,5}. El impacto de la TBI se pone de relieve por las importantes complicaciones neurocognitivas y neuropsiquiátricas a largo plazo sufridas por sus sobrevivientes con el inicio insidioso de deficiencias conductuales, cognitivas y motoras que se denominan Encefalopatía Traumática Crónica (TEC) ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10}. Incluso los eventos conmocionsivas subclínicos —aquellos impactos que no resultan en síntomas clínicos— pueden conducir a una disfunción neurológica a largo plazo^11,12.

Los modelos animales para el estudio de TBI se han empleado desde finales de 1800^13. En la década de 1980, se desarrolló un impactador neumático con el propósito de modelar TBI. Este método se conoce ahora como impacto cortical controlado (CCI)¹⁴. El control y la reproducibilidad de CCI llevaron a los investigadores a adaptar el modelo para su uso en roedores^15. Nuestro laboratorio utiliza este modelo para inducir TBI a través de un impactador disponible comercialmente y un dispositivo de accionamiento electrónico^16,17. Este modelo es capaz de producir una amplia gama de estados TBI clínicamente aplicables dependiendo de los parámetros biomecánicos utilizados. La evaluación histológica de los cerebros TBI después de una lesión grave inducida en nuestro laboratorio demuestra una pérdida significativa de cortical y hipocampal ipsilateral, así como edema contralateral y distorsión. Además, CCI produce un deterioro constante en la función motora y cognitiva medida por ensayos conductuales¹⁸. Las limitaciones a CCI incluyen la necesidad de craneotomía y el gasto de adquirir el impactador y el dispositivo de accionamiento.

Existen varios modelos adicionales de TBI y están bien establecidos en la literatura, incluyendo el modelo de percusión de fluido lateral, modelo de caída de peso, y lesión por explosión modelo^19,20,21. Si bien cada uno de estos modelos tiene sus propias ventajas distintas, sus principales inconvenientes son lesiones mixtas, alta mortalidad y falta de estandarización, respectivamente^22. Además, ninguno de estos modelos ofrece la precisión, precisión y reproducibilidad de CCI. Al ajustar la entrada de parámetros biomecánicos en el dispositivo de accionamiento, el modelo CCI permite al investigador un control preciso sobre el tamaño de la lesión, la profundidad de la lesión y la energía cinética aplicada al cerebro. Esto da a los investigadores la capacidad de aplicar todo el espectro de TBI a áreas específicas del cerebro. También permite la mayor reproducibilidad desde el experimento hasta el experimento.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los ratones C57BL/6 fueron comprados al Laboratorio Jackson y el grupo alojado en una instalación de barrera en el Centro de Medicina Comparada de la Universidad Northwestern (Chicago, IL). Todos los animales fueron alojados en 12/12 h ciclo claro/oscuro con acceso gratuito a alimentos y agua.

1. Inducir la anestesia

1. Anestetizar el ratón con ketamina (125 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) inyectada por vía intraperitoneal.

2. Monitoreo de signos vitales cada 15 minutos

1. Controle la temperatura, la frecuencia respiratoria y el color de la piel. El ratón debe sentirse caliente al tacto. La piel debe aparecer rosa da a la piel y bien perfundida. La frecuencia respiratoria debe variar de 50 a 70 respiraciones por minuto.

3. Procedimientos prequirúrgicos

1. Pesar todos los ratones el día antes de la inducción de lesiones.
2. Esterilice un conjunto de instrumentos quirúrgicos mediante el autoclave para cada sujeto experimental. Esterilice el dispositivo de impacto antes de usarlo.
3. Prepare una jaula de recuperación colocando una jaula limpia sobre una almohadilla de calentamiento eléctrica establecida en un ajuste "bajo" y colocada de tal manera que los ratones puedan alejarse del calor una vez ambulatorio.
4. Configure el quirófano dentro de una campana de flujo laminar esterilizada.
   1. Coloque el marco de funcionamiento estereotaxico.
   2. Conecte el dispositivo de impacto al marco estereotaxico.
   3. Ajuste el dispositivo de accionamiento con los parámetros biomecánicos deseados para la velocidad y el tiempo de permanencia.
      NOTA: En este protocolo se describe una lesión cerebral grave utilizando una punta de impacto de 3 mm de diámetro a través de una craniectomía de 5 mm de diámetro con la velocidad establecida en 2,5 m/s y un tiempo de permanencia de 0,1 s. Se puede utilizar una amplia gama de parámetros biomecánicos para inducir todo el espectro de TBI.
5. Don nuevo equipo de protección personal y guantes estériles.
6. Ahave el pelaje del sitio operativo con cortadoras eléctricas.
7. Aplique pomada opthalmic protectora a los ojos del ratón para evitar lesiones corneales y secado.
8. Coloque el ratón en el quirófano.
9. Prepara la piel con un exfoliante quirúrgico a base de yodo alternado con alcohol tres veces.

4. Aplicación del impacto cortical controlado

1. Incise el cuero cabelludo 1 cm en la línea media con un bisturí que expone el cráneo.
2. Coloque el ratón dentro de un marco de funcionamiento estereotaxico asegurando los huesos temporales bilaterales entre las barras de oído en miniatura y bloqueando los incisivos dentro de una abrazadera incisiva creando una sujeción estable de tres puntos en la cabeza del ratón.
3. Retirar el cuero cabelludo lejos del sitio operativo con un hemostat o fórceps de bloqueo para asegurarse de que el cuero cabelludo no entre en contacto con la broca durante la craneectomía.
4. Identifique las suturas sagitales y coronales en el cráneo expuesto.
   NOTA: Este protocolo centra la craniectomía 2 mm a la izquierda de la sutura sagital y 2 mm rostral a la sutura coronal.
5. Realice una craniectomía usando un taladro con una broca de trephina.
   1. Para realizar la craneectomía, primero active el taladro a la máxima velocidad y luego aplique la broca trephina perpendicular al cráneo en el sitio de la craneectomía.
   2. Aplique una presión suave y uniforme al taladro una vez que se haga contacto con el cráneo. Una ligera "dar" se sentirá una vez que el taladro penetre a través del cráneo. No penetre en la dura subyacente.
      NOTA: Este protocolo utiliza una broca trephine de 5 mm para realizar la craneectomía.
6. Utilice fórceps y una aguja hipodérmica de pequeño calibre para extraer la solapa ósea, exponiendo completamente la duración subyacente.
7. Gire la punta del impactador en el campo operativo y baje hasta que haga contacto con la dura mater expuesta. Una vez que se realiza el contacto, el sensor de contacto del instrumento hará un tono audible para alertar al cirujano de que se ha hecho contacto. Esto marcará el punto cero desde el que se establece la profundidad de deformación.
   NOTA: Este protocolo utiliza una punta de impacto de 3 mm para generar una lesión grave. Se pueden utilizar puntas tan pequeñas como 1 mm para aplicar lesiones más localizadas.
8. Retraiga la punta impactante y ajuste la profundidad de impacto deseada reduciendo la posición del impactador en el marco estereotaxico.
   NOTA: En este protocolo describimos una lesión grave estableciendo la profundidad de deformación en 2 mm.
9. Aplique la lesión activando el impactador en el dispositivo de accionamiento.
10. Gire el dispositivo de impacto fuera del campo y retire el animal del marco estereotaxico.

5. Cierre del sitio quirúrgico

1. Controle el sangrado del cráneo y la superficie cortical lesionada con presión directa de un aplicador de punta de algodón estéril.
2. Seque el cráneo con un aplicador de algodón estéril.
3. Cierre el cuero cabelludo sobre la craneectomía con un adhesivo quirúrgico disponible comercialmente o sutura monofilamento.
   NOTA: En este protocolo se utiliza un adhesivo quirúrgico veterinario para cerrar el cuero cabelludo. El colgajo óseo no se reemplaza y se desecha.

6. Atención y monitoreo postoperatorio

1. Administrar la analgesia postoperatoria (p. ej., buprenorfina de liberación sostenida 0,1–0,5 mg/kg administrada por vía subcutánea proporcionando 72 h de analgesia sostenida).
2. Coloque el animal en la posición de recuperación de decúbato lateral en una jaula limpia precalentada.
3. Observe a los animales hasta que despierten y estén móviles, luego devuelva cada ratón a su jaula de origen.
4. Garantizar el acceso gratuito a alimentos y agua. La ingesta normal de alimentos y agua normal mente se reanuda dentro de una a dos horas después de la lesión.
5. Mida el peso corporal cada tres días a lo largo del experimento.

Resultados

El impactador se monta directamente en el marco estereotaxico, lo que permite una resolución de hasta 10 m para el control del punto de impacto, profundidad y penetración. Las fuerzas electromagnéticas empleadas pueden impartir velocidades de impacto que van de 1,5 a 6 m/s. Esto permite una precisión y reproducibilidad sin igual en toda la gama de TBI clínicamente relevantes. Los investigadores pueden realizar experimentos piloto cambiando los parámetros de la lesión, como el tamaño de la punta del impactador, la...

Discusión

Hay varios pasos que son críticos para aplicar una lesión confiable y consistente. En primer lugar, el ratón debe alcanzar un plano profundo de anestesia quirúrgica asegurando que no haya movimiento durante la realización de la craneectomía. Mientras que se pueden utilizar numerosos regímenes anestésicos para inducir anestesia general en roedores, los anestésicos que inducen depresión respiratoria como los anestésicos inhalatorios pueden resultar en un paro respiratorio cuando se combinan con un TBI grave. Est...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one for Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Mouse Specific Stereotaxic Base	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines for Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50