JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada açık kafa kontrollü kortikal darbe ile murine travmatik beyin hasarı indüksiyon için bir protokol açıklar.

Özet

Hastalık Kontrol ve Yaralanma Önleme Merkezleri yaklaşık 2 milyon kişi travmatik bir beyin hasarı (TBI) Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl sürdürmek tahmin. Aslında, TBI tüm yaralanmaya bağlı mortalite üçte birden fazla katkıda bulunan bir faktördür. Bununla birlikte, TBI patofizyolojisinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, insan hastalarda TBI ile ilgili yaralanma mekanizmalarını kopyalayabilen TBI'nin preklinik modelleri kritik bir araştırma ihtiyacıdır. TBI kontrollü kortikal etki (CCI) modeli doğrudan maruz korteks etkilemek için mekanik bir cihaz kullanır. Hiçbir model insan hastalarda farklı yaralanma kalıplarını ve TBI heterojen doğasını tam olarak özetleyebilir iken, CCI klinik olarak uygulanabilir TBI geniş bir yelpazede indükleme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, CCI kolayca araştırmacılar deneyler arasında yanı sıra araştırmacı gruplar arasında sonuçları karşılaştırmak için izin standartlaştırılır. Aşağıdaki protokol, TBI'nin bir murine modelinde ticari olarak kullanılabilen bir cihazla ciddi bir CCI uygulanmasının ayrıntılı bir açıklamasıdır.

Giriş

Hastalık Kontrol ve Yaralanma Önleme Merkezleri yaklaşık 2 milyon Amerikalı travmatik bir beyin hasarı (TBI) her yıl1,2sürdürmek tahmin . Aslında, TBI sağlık maliyetleri yılda 80 milyar dolara yakın ve yaklaşık 4.000.000 $ kişi başına yılda ciddi bir TBI 3,4,5hayatta ile Amerika Birleşik Devletleri'nde tüm yaralanma ile ilgili ölümlerin%30üzerinde katkıda bulunur. TBI etkisi önemli uzun vadeli nörokognitif ve nöropsikiyatrik komplikasyonlar davranışsal sinsi başlangıcı ile hayatta kalanlar tarafından uğradığı vurgulanır, bilişsel, ve motor bozukluklar Kronik Travmatik Ensefalopati olarak adlandırdığı (CTE) 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9.000 , 10- Hatta subklinik sarsıntılı olaylar-klinik belirtilere neden olmayan bu etkiler-uzun vadeli nörolojik disfonksiyon yol açabilir11,12.

TBI çalışma için hayvan modelleri geç 1800's13beri istihdam edilmiştir. 1980'lerde TBI modelleme amacıyla pnömatik bir etkileyici geliştirilmiştir. Bu yöntem artık kontrollü kortikal etki (CCI)14olarak adlandırılır. CCI kontrolü ve tekrarlanabilirliği, araştırmacıların modeli kemirgenlerde kullanılmak üzere uyarlamalarına yol açtı15. Laboratuvarımız ticari olarak kullanılabilir bir etki leyici ve elektronik aktive cihazı16,17ile TBI ikna etmek için bu modeli kullanır. Bu model, kullanılan biyomekanik parametrelere bağlı olarak klinik olarak uygulanabilir TBI durumları geniş bir yelpazede üretme yeteneğine sahiptir. Laboratuarımızda ciddi bir yaralanma sonrası TBI beyinlerinin histolojik değerlendirilmesi, önemli ipsilateral kortikal ve hipokampal kaybın yanı sıra kontralateral ödem ve distorsiyon olduğunu göstermektedir. Ayrıca, CCI davranışsal tahliller 18 ile ölçülenolarak motor ve bilişsel fonksiyon tutarlı bir bozulma üretir. CCI sınırlamaları kraniyotomi ihtiyacı ve darbeci ve aktive cihazı edinme gideri içerir.

TBI birkaç ek modelleri var ve iyi lateral sıvı perküsyon modeli de dahil olmak üzere literatürde kurulmuştur, ağırlık damla modeli, ve patlama yaralanma modeli19,20,21. Bu modellerin her biri kendi farklı avantajları olsa da ana dezavantajları karışık yaralanma, yüksek mortalite ve standardizasyon eksikliği, sırasıyla22. Ayrıca, bu modellerin hiçbiri CCI'ın doğruluğunu, hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini sunmaz. Kameralı cihaza biyomekanik parametreleri girerek, CCI modeli araştırmacının yaralanmanın büyüklüğü, yaralanmanın derinliği ve beyne uygulanan kinetik enerji üzerinde hassas bir kontrol sağlamasına olanak tanır. Bu araştırmacılar beynin belirli bölgelerine TBI tüm spektrum u uygulamak için yeteneği verir. Ayrıca deneyden deneye kadar en büyük tekrarlanabilirliği sağlar.

Protokol

Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. C57BL/6 fareler Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı ve grup Northwestern Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Merkezi'nde bir bariyer tesisinde barındırılanın (Chicago, IL). Tüm hayvanlar 12/12 saat açık/karanlık döngüsünde yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile barındırılabildi.

1. Anestezi yi teşvik etmek

  1. Ketamin (125 mg/kg) ve intraperitoneal enjekte xylazine (10 mg/kg) ile fareyi anestezi.

2. Her 15 dakikada bir izlenen hayati işaretler

  1. Sıcaklığı, solunum hızını ve cilt rengini izleyin. Fare dokunmak için sıcak hissetmeli. Cilt pembe ve iyi perfüzyon görünmelidir. Solunum hızı dakikada 50-70 arasında olmalıdır.

3. Cerrahi öncesi işlemler

  1. Yaralanma indüksiyonundan bir gün önce tüm fareleri tartın.
  2. Her deneysel denek için otoklavlayarak bir dizi cerrahi aleti sterilize edin. Kullanmadan önce etkileyen cihazı sterilize edin.
  3. "Düşük" ayarına ayarlanmış ve fareler bir kez ambulatuar ısı uzak hareket edebilir şekilde konumlandırılmış bir elektrikli ısıtma yastığı üzerine temiz bir kafes yerleştirerek bir kurtarma kafesi hazırlayın.
  4. Sterilbir laminar akış başlığı içinde ameliyathane kurmak.
    1. Stereotaksik çalışma çerçevesini konumlandırın.
    2. Etkileyen aygıtı stereotaksik çerçeveye takın.
    3. Hız ve çalışma süresi için istenilen biyomekanik parametreleri ile harekete alma cihazı ayarlayın.
      NOT: Bu protokolde, 2,5 m/s hız ayarı ve 0,1 s'lik bir çalışma süresi ile 5 mm çapında kraniektomi ile 3 mm çapında bir darbe ucu kullanılarak ciddi bir beyin hasarı tanımlanmıştır. Biyomekanik parametrelergeniş bir yelpazede TBI tam spektrum ikna etmek için kullanılabilir.
  5. Yeni kişisel koruyucu ekipman ve steril eldivenler giyin.
  6. Elektrikli makaslar kullanarak operatör yerinden kürk tıraş.
  7. Kornea yaralanması ve kuruma önlemek için farenin gözlerine koruyucu opthalmik merhem uygulayın.
  8. Fareyi ameliyathaneye yerleştirin.
  9. Alkol ile dönüşümlü bir iyot bazlı cerrahi scrub ile üç kez cilt hazırlayın.

4. Kontrollü kortikal etki uygulaması

  1. Kafa derisini orta hatta 1 cm kalınlığında bir neşterle kafatasını teşhir edin.
  2. Fareyi, minyatür kulak çubukları arasında ikili zamansal kemikleri güvence altına alarak ve kesici dişleri bir kesici kesici kelepçenin içine kilitleyerek fareyi stereotaksik bir çalışma çerçevesi içinde konumlandırın ve fare nin başına sabit bir üç nokta lı tutun.
  3. Kafa derisinin kraniektomi sırasında matkap ucuyla temas etmediğinden emin olmak için kafa derisini bir hemostat veya kilitleme forceps ile ameliyat yerinden uzaklaştırın.
  4. Maruz kalan kafatasındaki sagital ve koronal dikişleri tanımlayın.
    NOT: Bu protokol, sagital sütürden 2 mm sol ve koronal sütüre 2 mm rostral kraniektomi yi merkezalır.
  5. Bir trephine matkap biti ile bir matkap kullanarak bir kraniektomi gerçekleştirin.
    1. Kraniektomi gerçekleştirmek için, ilk maksimum hızda matkap etkinleştirin ve daha sonra kraniektomi yerinde kafatasına dik trephine matkap ucu uygulayın.
    2. Kafatası ile temas yapıldıktan sonra matkap için nazik, hatta basınç uygulayın. Matkap kafatasına nüfuz ettikten sonra hafif bir "vermek" hissedilecektir. Altta yatan dura nüfuz etmeyin.
      NOT: Bu protokol kraniektomi yapmak için 5 mm trephine matkap ucu kullanır.
  6. Kemik flebini çıkarmak için forceps ve küçük bir gösterge hipodermik iğne kullanın, tamamen altta yatan dura mater açığa.
  7. Darbe ucunu ameliyat alanına döndürün ve maruz kalan dura mater ile temas edene kadar düşürün. Temas yapıldıktan sonra cihazın temas sensörü, cerrahı temasın yapıldığı konusunda uyarmak için duyulabilir bir ton yapacaktır. Bu, deformasyon derinliğinin ayarlandığı sıfır noktasını işaretler.
    NOT: Bu protokol, ciddi bir yaralanma oluşturmak için 3 mm'lik bir darbe ucu kullanır. Daha fazla lokalize yaralanma uygulamak için 1 mm gibi küçük ipuçları kullanılabilir.
  8. Etkileyen ucu geri çekin ve stereotaksik çerçeve üzerindeki etki veya konumunu düşürerek istediğiniz etki derinliğini ayarlayın.
    NOT: Bu protokolde deformasyon derinliği2 mm'ye ayarlayarak ciddi bir yaralanma yı tanımlıyoruz.
  9. Darbeciyi harekete geçirmek için yaralanmayı uygulayın.
  10. Darbe cihazını alanın dışına döndürün ve hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın.

5. Cerrahi saha kapatma

  1. Steril pamuk uçlu aplikatörden gelen doğrudan basınç la kafatası ve yaralı kortikal yüzeykanamakontrol edin.
  2. Steril pamuk uçlu aplikatör ile kafatası kuru.
  3. Ticari olarak kullanılabilen cerrahi yapıştırıcı veya monofilament sütür kullanarak kraniektomi üzerine kafa derisini kapatın.
    NOT: Bu protokolde kafa derisi kapatmak için veteriner cerrahi yapıştırıcı kullanılır. Kemik flebi değiştirilmez ve atılır.

6. Ameliyat sonrası bakım ve izleme

  1. Postoperatif analjezi uygulayın (örn. sürekli salınımlı buprenorfin 0.1-0.5 mg/kg subkutan olarak uygulanarak 72 saat sürekli analjezi sağlar).
  2. Temiz bir önceden ısıtılmış kafesiçinde lateral decubitus kurtarma pozisyonunda hayvan yerleştirin.
  3. Uyanık ve mobil kadar hayvanları gözlemleyin, sonra kendi kafese her fare dönmek.
  4. Yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlayın. Normal gıda ve su alımı genellikle yaralanmadan sonra bir ila iki saat içinde devam.
  5. Deney boyunca her üç günde bir vücut ağırlığını ölçün.

Sonuçlar

Darbeci doğrudan stereotaksik çerçeveye monte edilerek darbe noktasının, derinliğin ve penetrasyonun kontrolü için 10 m'ye kadar çözünürlük sağlar. Kullanılan elektromanyetik kuvvetler 1,5-6 m/s arasında değişen darbe hızlarını verebilir. Bu, klinik olarak ilgili Tüm TBI yelpazesinde benzersiz hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlar. Araştırmacılar, istenen yaralanma derecesini en iyi şekilde üreten parametreleri belirlemek için darbe uç boyutu, darbe hızı ve darbe derinliği gibi yaralanm...

Tartışmalar

Güvenilir ve tutarlı bir yaralanma uygulamak için kritik olan birkaç adım vardır. İlk olarak, fare kraniektomi performansı sırasında hiçbir hareket sağlayan cerrahi anestezi derin bir düzleme ulaşmak gerekir. Kemirgenlerde genel anesteziyi tetiklemek için çok sayıda anestezik rejim kullanılabilirken, inhalasyonanestezisi gibi solunum depresyonuna neden olan anesteziler ciddi bir TBI ile kombine edildiğinde solunum durmasına neden olabilir. Bu protokolde intraperitoneal enjekte edilen ketamin (125 mg/k...

Açıklamalar

Yazarların hiçbir mali çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant GM117341 ve American College of Surgeons C. James Carrico Araştırma Bursu tarafından S.J.S. tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed Injection Xylazine Sterile SolutionLLOYD, Inc.5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mLZoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USABSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0Foredom Electric CompanyK.1070
Imapact one for Stereotaxix CCILeica Biosystems Nussloch GmbH39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USPHenry Schein, Inc56344
Mouse Specific Stereotaxic BaseLeica Biosystems Nussloch GmbH39462980
Trephines for Micro DrillFine Science Tools, Inc18004-50

Referanslar

  1. Faul, M. . Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths 2002-2006. , (2010).
  2. Roozenbeek, B., Maas, A. I., Menon, D. K. Changing patterns in the epidemiology of traumatic brain injury. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 231-236 (2013).
  3. Corso, P., Finkelstein, E., Miller, T., Fiebelkorn, I., Zaloshnja, E. Incidence and lifetime costs of injuries in the United States. Injury Prevention. 12 (4), 212-218 (2006).
  4. Pearson, W. S., Sugerman, D. E., McGuire, L. C., Coronado, V. G. Emergency department visits for traumatic brain injury in older adults in the United States: 2006-08. Western Journal of Emergency Medicine. 13 (3), 289-293 (2012).
  5. Whitlock, J. A., Hamilton, B. B. Functional outcome after rehabilitation for severe traumatic brain injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 76 (12), 1103-1112 (1995).
  6. Schwarzbold, M., et al. Psychiatric disorders and traumatic brain injury. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 4 (4), 797-816 (2008).
  7. Whelan-Goodinson, R., Ponsford, J., Johnston, L., Grant, F. Psychiatric disorders following traumatic brain injury: their nature and frequency. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 24 (5), 324-332 (2009).
  8. Peskind, E. R., Brody, D., Cernak, I., McKee, A., Ruff, R. L. Military- and sports-related mild traumatic brain injury: clinical presentation, management, and long-term consequences. Journal of Clinical Psychiatry. 74 (2), 180-188 (2013).
  9. Martin, L. A., Neighbors, H. W., Griffith, D. M. The experience of symptoms of depression in men vs women: analysis of the National Comorbidity Survey Replication. JAMA Psychiatry. 70 (10), 1100-1106 (2013).
  10. Makinde, H. M., Just, T. B., Cuda, C. M., Perlman, H., Schwulst, S. J. The Role of Microglia in the Etiology and Evolution of Chronic Traumatic Encephalopathy. Shock. 48 (3), 276-283 (2017).
  11. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., McAllister, T. Subconcussive Blows to the Head: A Formative Review of Short-term Clinical Outcomes. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (3), 159-166 (2016).
  12. Carman, A. J., et al. Expert consensus document: Mind the gaps-advancing research into short-term and long-term neuropsychological outcomes of youth sports-related concussions. Nature Reviews Neurology. 11 (4), 230-244 (2015).
  13. Kramer, S. P. A Contribution to the Theory of Cerebral Concussion. Annals of Surgery. 23 (2), 163-173 (1896).
  14. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. Journal of Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
  15. Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
  16. Schwulst, S. J., Trahanas, D. M., Saber, R., Perlman, H. Traumatic brain injury-induced alterations in peripheral immunity. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 75 (5), 780-788 (2013).
  17. Trahanas, D. M., Cuda, C. M., Perlman, H., Schwulst, S. J. Differential Activation of Infiltrating Monocyte-Derived Cells After Mild and Severe Traumatic Brain Injury. Shock. 43 (3), 255-260 (2015).
  18. Makinde, H. M., Cuda, C. M., Just, T. B., Perlman, H. R., Schwulst, S. J. Nonclassical Monocytes Mediate Secondary Injury, Neurocognitive Outcome, and Neutrophil Infiltration after Traumatic Brain Injury. Journal of Immunology. 199 (10), 3583-3591 (2017).
  19. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22 (1), 42-75 (2005).
  20. Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
  21. Reneer, D. V., et al. A multi-mode shock tube for investigation of blast-induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
  22. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal Models of Traumatic Brain Injury and Assessment of Injury Severity. Molecular Neurobiology. , (2019).
  23. Makinde, H. M., et al. Monocyte depletion attenuates the development of posttraumatic hydrocephalus and preserves white matter integrity after traumatic brain injury. PLoS One. 13 (11), e0202722 (2018).
  24. Osier, N. D., Dixon, C. E. The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions. Frontiers in Neurology. 7, 134 (2016).
  25. Iaccarino, C., Carretta, A., Nicolosi, F., Morselli, C. Epidemiology of severe traumatic brain injury. Journal of Neurosurgical Sciences. 62 (5), 535-541 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 150Travmatik beyin hasarkraniektomidura materkontroll kortikal etkiintraparenkimal kanamasubaraknoid kanamasubdural kanamastereotaksik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır