الانسجه الدهنية البشرية التجزئة الصغرى لتوصيف الخلية وخصائص الإفراز

Summary

هنا ، ونحن نقدم الإنسان الانسجه الدهنية خاليه من انزيم التجزئة الصغيرة باستخدام جهاز مغلق النظام. هذه الطريقة الجديدة تسمح لحصول علي من مجموعات المليمتر من الانسجه الدهنية المناسبة في زرع الجسم المجري, في المختبر الثقافة, والمزيد من العزلة الخلية وتوصيف.

Abstract

في العقد الماضي ، كانت عمليات زرع الانسجه الدهنية تستخدم علي نطاق واسع في الجراحة التجميلية وتقويم العظام لتعزيز أعاده الانسجه و/أو التجدد. وبناء علي ذلك ، تطورت تقنيات حصاد ومعالجه الانسجه الدهنية البشرية من أجل الحصول بسرعة وكفاءه علي كميات كبيره من الانسجه. ومن بين هذه التقنيات ، تمثل تكنولوجيا النظام المغلق نظاما مبتكرا وسهل الاستخدام لحصاد الانسجه الدهنية المكررة ومعالجتها وأعاده حقنها في وقت قصير وفي نفس التدخل (داخل العملية). يتم جمع الانسجه الدهنية عن طريق شفط الدهون ، وغسلها ، مستحلب ، شطف ومفروم ميكانيكيا في مجموعات الخلايا من 0.3 إلى 0.8 مم. وقد أظهرت الذاتي زرع الانسجه الدهنية مجزاه ميكانيكيا فعاليه ملحوظة في مختلف العلاجية مؤشرات مثل الطب التجميلي والجراحة ، والعظام والجراحة العامة. وكشف توصيف الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا عن وجود السفن الصغيرة السليمة داخل مجموعات الخلايا الشحمية ؛ التالي ، ترك مشكاة الاوعيه الدموية غير مضطرب. وقد أثريت هذه التكتلات في خلايا الاوعيه الدموية (اي أسلاف الخلايا الجذعية (MSC)) واظهر التحليل في المختبر زيادة في الإفراج عن عوامل النمو والخلوية المشاركة في إصلاح الانسجه وتجديدها ، بالمقارنة مع MSCs انزيمي المشتقة. وهذا يوحي بان الإمكانات العلاجية المتفوقة للانسجه الدهنية المجزاه تفسر بتردد اعلي من MSCs المفترض والنشاط سيكريتوري المحسنة. وما إذا كانت هذه الإضافات المضافة تساهم مباشره في زيادة عامل النمو ولا يعرف إنتاج السايسيسين. يسمح هذا الاجراء الذي تمت الموافقة عليه سريريا بزرع MSCs المفترض دون الحاجة إلى التوسع و/أو العلاج الانزيمي ، التالي تجاوز متطلبات GMP المبادئ التوجيهية ، والحد من تكاليف العلاجات القائمة علي الخلايا.

Introduction

الانسجه الدهنية ، وتستخدم لفتره طويلة كحشو في الجراحة الترميمية والتجميلية ، وقد أصبحت في الاونه الاخيره أكثر شعبيه في الطب التجديدي المعترف بها مره واحده كمصدر للخلايا الجذعية المسسبي (MSCs)¹. الدهون الانزيميه المنفصلة في المعلقات أحاديه الخلية تسفر عن كسر الاوعيه الدموية اللحمية الخالية من الخلايا الشحمية (SVF) التي يتم استخدامها دون تغيير في المريض أو ، أكثر شيوعا ، يتم استزراعها لعده أسابيع في MSCs².

ومع ذلك ، تفكك الانزيم تمزق بيئات الانسجه الصغرى ، عزله الخلايا التنظيمية المجاورة من الخلايا التجديدية المفترضة التي تصبح تعديلا كبيرا من قبل في المختبر الثقافة. لتجنب مثل هذه التحف التجريبية والتعديلات الوظيفية المترتبة علي ذلك ، بذلت محاولات لمعالجه الانسجه الدهنية للاستخدام العلاجي مع الحفاظ علي تكوينها الأصلي كما سليمه قدر الإمكان^3،4. وعلي وجه الخصوص ، بدات اضطرابات الانسجه الميكانيكية لتحل محل التفكك الانزيمي. وتحقيقا لهذه الغاية ، الغمر الكامل مغلقه نظام الأجزاء الصغيرة الدهنية في الخلايا الفرعية ملليمتر ، والدم والنفط خاليه من مجموعات الانسجه (علي سبيل المثال ، ليبوجواهر) عن طريق سلسله من غربال الترشيح والرخام الصلب الناجم عن انقطاع³. الزرع الذاتي للانسجه الدهنية المجزاه جزئيا ، باستخدام هذه التكنولوجيا المغلقة للنظام ، كان ناجحا في مؤشرات متعددة ، والتي تغطي مستحضرات التجميل ، وجراحه العظام ، وطب المستقيم وامراض النسائية^{4،5، 6،7،8،9،10،11،12،13}.

وكشفت المقارنة بين الانسجه الدهنية الدقيقة المجزاه البشرية (حصيره) التي تم الحصول عليها مع جهاز النظام المغلق و SVF العصبية انه فيما يتعلق بتوزيع الخلايا الوعائية/اللحمية والنشاط سيكريتوري في الثقافة ، حصيره يحتوي علي المزيد من بيريسيلات ، والتي هي المفترض MSCs¹⁴، ويفرز كميات اعلي من عوامل النمو و السايتوكينات¹⁵.

وتوضح هذه المادة التجزئة الصغرى الخالية من الانزيمات للانسجه الدهنية تحت الجلد البشرية باستخدام جهاز مغلق ، والمزيد من معالجه هذه الانسجه الدهنية المجهرية للثقافة الانبوبيه ، والمناعي ، وتحليل النظام ، من أجل تحديد أنواع الخلايا الموجودة والعوامل القابلة للذوبان التي يفرزها (الشكل 1). الطريقة الموصوفة بأمان يولد الدهنية المشتقة من الملليمتر العضوي الذي يحتوي علي خلايا الانسجه الدهنية قابله للحياة في مكانه سليمه ، ومناسبه لمزيد من التطبيقات والدراسات.

Protocol

تم الحصول علي الموافقة الاخلاقيه لاستخدام الانسجه البشرية في هذا البحث من لجنه أخلاقيات البحوث في جنوب شرق اسكتلندا (المرجع: 16/SS/0103).

1. جمع الانسجه الدهنية تحت الجلد البطن

ملاحظه: يتم توفير جميع الاداات المستخدمة في الاجراء اليدوي لشفط الدهون من قبل الشركة المصنعة للجهاز الصغير التجزئة.

1. الحفاظ علي العقم لجميع السوائل والحاويات والاداات ، ومنطقه العمليات طوال التجربة.
2. ضع عينه شد البطن (التي تم شراؤها من قبل الفريق الجراحي في كيس معقم بدون اي محلول) فوق قطعه قماش جراحيه مع الجلد الذي يواجه صعودا. لا يلزم الغسيل. للاستخدام الأمثل ، والحفاظ علي العينة في 4 درجه مئوية ومعالجه العينة الدهنية في غضون 16 ساعة من الحصاد.
3. حقن 50 إلى 100 مل من 37 درجه مئوية 0.9 ٪ محلول كلوريد الصوديوم ، اعتمادا علي حجم عينه الانسجه (استخدام 50 mL للحد الأقصى 15 سم² سطح الانسجه الدهنية وزيادة حجم وفقا لذلك) ، وذلك باستخدام القابل للتصرف الانسجه تسلل cannula ، في تحت الجلد الانسجه الدهنية. التعامل مع العينة من قبل الجزء الجلدي.
4. قم بتوصيل حقنه قفل Luer 10 مل إلى cannula المتاح لشفط الدهون.
5. بعناية إدخال قني داخل الانسجه الدهنية من الحواف. مره واحده في الداخل ، وخلق فراغ داخل حقنه عن طريق سحب المكبس. الحفاظ علي المكبس في الموقف باليد لتامين شفط فراغ.
6. جعل الحركات الشعاعية داخل عينه الانسجه الدهنية حتى الحقنه مليئه بالدهون. قم بازاله الكانولا بعناية من النسيج وافصل الحقنه. قم بتوصيل حقنه فارغه جديده.
7. كرر الاجراء حتى يتم جمع 60 مل من ليبوسات.
   ملاحظه: الحد الأقصى لكميه الدهون التي يمكن معالجتها بالتغييرات وفقا لنوع الجهاز المستخدم. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).

2-التفتيت الجزئي للدهون الشحمية

ملاحظه: هذا البروتوكول مخصص للاستخدام البحثي فقط. يتم تنفيذ التجزئة الدقيقة بمساعده جهاز متاح تجاريا (جدول المواد).

1. قم بازاله الجهاز من الحزمة وتحقق من ان الوحدة الرئيسية متصلة بكيس النفايات. وضع كيس جمع النفايات علي الأرض والتاكد من ان يتم تامين الصمامات لوحدات العملية القبعات.
2. قم بتوصيل الارتفاع النهائي لخط الإدخال إلى الكيس الملحي عن طريق اختراق منفذ توصيل الحقيبة. حافظ علي الكيس الملحي اعلي من وحده المعالجة.
   ملاحظه: لنوع الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول ، يوصي بحقيبة 2,000 مل من المحلول الملحي المعقم.
3. تحقق من ان جميع المشابك 5 متصلة أنابيب الدوائر مفتوحة. ضع وحده المعالجة في وضع عمودي مع الغطاء الرمادي للأعلى.
4. السماح للحل الملحي لملء وحده المعالجة. تاكد من ان التدفق يصل إلى كيس النفايات. أزاله جميع فقاعات الهواء من وحده المعالجة عن طريق هز ذلك.
   ملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ جميع المقاطع التالية في غياب الهواء في وحده المعالجة.
5. ضع وحده المعالجة في وضع عمودي مع الغطاء الأزرق صعودا واغلق المشبك بجوار خط الإدخال.
6. أبدا بحقن الدهون عن طريق توصيل الحقنه بالصمام انسداد الذاتي لغطاء الإدخال الأزرق. الحفاظ علي وحده المعالجة العمودية خلال هذا الاجراء وسحب ببطء المكبس حقنه حتى تم نقل جميع الدهون إلى الوحدة. كرر العملية حتى تكون جميع الدهون داخل وحده المعالجة.
   ملاحظه: لوحده المعالجة المستخدمة في الفيديو ، أضف الحد الأقصى 30 مل من الدهون الدهنية في ذلك الوقت. يمكن اجراء العملية بحد اقصي مرتين ، حتى 60 مل من الدهون الشحمية التي تمت معالجتها.
7. فتح المشبك الإدخال لاستعاده تدفق المالحة.
8. يهز بقوة وحده المعالجة لمده 2 دقيقه علي الأقل ، والتحقق بانتظام من تدفق محلول ملحي في كيس النفايات.
9. عندما يتحول المحلول الملحي في وحده المعالجة إلى الشفافية ، بعد دقيقتين تقريبا من الاهتزاز ، ضع الوحدة مع الغطاء الرمادي للأعلى ، واغلق المشبك الموجود علي الاستنزاف بالقرب من الغطاء الرمادي. الانسجه المعالجة سوف تطفو في الأعلى.
10. ملء حقنه قفل Luer 10 مل مع محلول ملحي وتوصيله إلى صمام التحميل من الغطاء الأزرق. اغلق المشبك الموجود بالقرب من الغطاء الأزرق. قم بتوصيل حقنه قفل Luer 10 مل فارغه ، مع المكبس المدرج بالبالكامل ، إلى صمام الغطاء الرمادي.
    ملاحظه: استخدام المحاقن قفل Luer فقط.
11. حقن المحلول الملحي بقوة في وحده المعالجة من الغطاء الأزرق. تاكد من ان الحقنه المتصلة بالصمام الرمادي يتم ملؤها بالانسجه المعالجة. مره واحده بعد ان حقن كل المالحة ، وأزاله بعناية كل من المحاقن.
12. كرر الخطوات 2.10 و 2.11 حتى يتم جمع كافة الانسجه المعالجة.
    ملاحظه: متوسط الغلة من حصيره هو 30 مل من 60 مل من الدهون اليدوية. وسوف تبقي بعض الانسجه داخل وحده المعالجة وبعض كتل قد تكون موجودة تعلق علي الحافة الزرقاء داخل الوحدة.
13. في نهاية المعالجة ، وأزاله جميع المحاقن ، وإغلاق جميع المشابك ، وفصل كيس ملحي والتخلص من الجهاز وفقا للبروتوكولات المحلية.
    ملاحظه: لا يمكن أعاده استخدام جهاز المعالجة.

3. مضان مناعي

1. نقل 300-500 μL من حصيره إلى أنبوب 1.5 mL. أضافه 1 مل من 4 ٪ مؤقتا بارافورمالدهيد (PFA) ، مزيج بلطف باليد (لا فورتيكنج) وترك في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها (من 16 إلى 24 ساعة).
2. جمع العينة ونقلها إلى أنبوب 1.5 mL نظيفه تحتوي علي 1 مل من برامج تلفزيونيه. كرر الخطوة مرتين لأزاله الزائدة PFA.
3. نقل العينة في 15 ٪ (ث/الخامس) السكروز في حل الخدمات التلفزيونية واحتضان في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها (من 16 إلى 24 ساعة)
4. نقل العينة في بئر من 24 لوحه جيدا وأضافه حل تضمين المصنوعة من السكروز 15 ٪ و 7 ٪ الجيلاتين (ث/ف) في الخدمات التلفزيونية. أملا البئر في منتصف الطريق. احتضان لمده 4 ساعات في 37 درجه مئوية.
5. نقل العينات إلى 4 درجه مئوية. بعد 2-4 h للحصول علي الجيلاتين ليصلب ، تملا البئر مع حل تضمين وترك في 4 °C بين عشيه وضحيها.
6. أزاله العينات من الآبار. أزاله مركب التضمين الزائد وتجميد الجليد الجاف. تخزين العينات في-80 درجه مئوية.
7. قطع المقاطع السميكة 8-10 μm باستخدام التبريد. للحصول علي المستوي الأمثل ، استخدم التبريد عند-30 درجه مئوية. يمكن تخزين الشرائح في-80 درجه مئوية.
8. قبل المضي قدما مع المناعي ، إصلاح الأقسام في 4 ٪ PFA لمده 7 دقائق. أزاله PFA ويغسل مرتين مع الفاترة تلفزيوني (37 درجه مئوية) من أجل أزاله الجيلاتين من الأقسام.
9. منع الأجسام المضادة غير محدده ملزمه من خلال احتضان الشرائح مع 10 ٪ مصل الماعز في الخدمات التلفزيونية العامة (v/v) لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
10. تمييع الأجسام المضادة الاساسيه في مخفف الأجسام المضادة أو 0.2 ٪ (ث/ف) الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسنيين) في الاذاعه التلفزيونية (w/v): الماوس المضادة للإنسان-NG2 (1:100 ، الأسهم 0.5 ملغ/مل) ، أرنب المضادة ل0.15 1:100 الإنسان
11. أزاله الحل حظر وأضافه الأجسام المضادة الاساسيه المخففة. احتضان في 4 °C بين عشيه وضحيها.
    ملاحظه: تنفيذ جميع الخطوات حضانة من الآن فصاعدا في الظلام.
12. أزاله الأجسام المضادة الاساسيه ويغسل 3 مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه في كل مره.
13. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في مخفف الأجسام المضادة أو 0.2 ٪ (ث/ف) جيش الصرب البوسنيين في الاذاعه التلفزيونية: الماعز المضادة للماوس-555 (1:300) ، الماعز المضادة لأرنب-647 (1:300). احتضان 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
14. أزاله الأجسام المضادة الثانوية ويغسل ثلاث مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه في كل مره.
15. إذا تم استخدام البيوتين مترافق لكتين, استخدام avidin/البيوتين حجب عده. احتضان لمده 10 دقيقه مع كل كاشف المقدمة مع اثنين من يغسل في ما بين مع تلفزيوني.
16. كرر خطوه الحجب من خلال احتضان الشرائح لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع 10% مصل الماعز في الخدمات التلفزيونية.
17. أضافه لكتين الحيوية, بيونكس اوليكس يوروريوس لكتين (1:200, الأسهم 2 مغ/مل), المخفف اما في 0.2% بوسنيا (w/v) في الجسم التلفزيوني أو الأجسام المضادة diluent. احتضان 1 ساعة و 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
18. أزاله الزائدة الحيوية لكتين ويغسل ثلاث مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه في كل مره.
19. أضافه العقديات الثانوية مترافق الأجسام المضادة المخفف في اي 0.2 ٪ (ث/ف) جيش الصرب البوسنيين في تلفزيوني أو الأجسام المضادة diluent. احتضان لمده 1 ساعة.
20. أزاله الأجسام المضادة الثانوية ويغسل ثلاث مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه في كل مره.
21. النوى مضاده للبقع مع 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI ، 1:500 ، الأسهم 5 ملغ/مل) ، المخفف في 0.2 ٪ بوسنيا (w/v) في الخدمات التلفزيونية ، لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
22. أزاله الحل DAPI ويغسل مرتين مع تلفزيوني ، 10 دقيقه في كل مره.
23. جبل الشرائح مع عامل تصاعد مائي. ندعه يجف تماما ، اما بين عشيه وضحيها علي مقاعد البدلاء في الظلام أو 1 ح في 37 درجه مئوية.
24. الحفاظ علي الشرائح في 4 درجه مئوية في الظلام والحصول علي الصور علي المجهر الكتابي.

4. هضم الانسجه الدهنية المجزاه الصغرى وعزل الخلايا

1. نقل الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا إلى حاويه معقمه.
2. الطازجة تشكل المتوسطة الهضم عن طريق تذويب النوع الثاني كولاجيناز في DMEM في تركيز 1 مغ/مل.
3. أضافه نفس حجم الهضم المتوسطة إلى الانسجه الدهنية المجزاه الصغرى (اي ، ل 30 مل من عينه أضافه 30 مل من متوسط الهضم).
4. وضع الحاوية مختومه في 37 درجه مئوية يهز حمام المياه تعيين إلى 120 دوره في الدقيقة ل 45 min. يرجى ملاحظه ان الحاوية يجب ان تسمح اهتزاز السليم للعينه. إذا كانت حاويه كبيره غير متوفرة ، استخدم أنابيب 2 50 mL (30 مل من العينة/الهضم خليط متوسط في كل) وضعت أفقيا.
5. بعد الحضانة ، ومنع الهضم عن طريق أضافه كميه متساوية من حل الحجب (2 ٪ (v/v) FCS/تلفزيوني) وتصفيه بالتتابع من خلال 100 μm و 70 μm الخلية strainers.
6. الطرد المركزي التعليق المصفاة لمده 5 دقائق في 200 x g. تجاهل الخارقة.
7. أعاده تعليق بيليه في ما يقرب من 5 مل من كريات تحلل العازلة (155 mM NH₄Cl ، 170 mm تريس ، pH 7.65). قد يختلف حجم المخزن المؤقت وفقا للتلوث الكريات الذي لوحظ في الكريات الخلوية. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه.
8. أضافه كميه متساوية من حل الحجب وتصفيه من خلال مصفاه خليه 40 μm.
9. الطرد المركزي تعليق الخلية لمده 5 دقائق في 200 x g وتجاهل supernatant.
10. أعاده تعليق بيليه في حل الحظر. اخلط جيدا عن طريق التنضيد. عد الخلايا القابلة للحياة مع الاستبعاد الأزرق الترلون علي مقياس الكريات الدموية.
    1. اخلطي كميه متساوية من تعليق الخلية مع الصبغة الزرقاء من التريكان. يستنشق 10 μL من المحلول ووضعه علي مقياس الكريات الدموية.
    2. احسب عدد الخلايا الحية (الساطعة والمستديرة) الموجودة في 5 مربعات علي الأقل واحصل علي رقم الخلية المتوسط. من أجل تضمين عامل تخفيف وصمه عار ، وضرب متوسط عدد الخلايا بنسبه 2. للحصول علي العدد الإجمالي للخلايا الحية لكل 1 مل من عينه تتضاعف العدد الذي تم الحصول عليه بنسبه 10⁴.
       ملاحظه: الحصول علي تعليق خليه واحده ، وهي كسر الاوعيه الدموية (SVF) ، يمكن ان تكون اما المصنفة في 20,000 خلايا/سم² في متوسط نمو الخلايا الوعائية (dmem تستكمل مع 20 ٪ الحرارة النشطة FCS ، 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين و 1 ٪ L-الجلوتامين) أو تستخدم لتحليل تدفق الخلوي والفرز. الغلة متوسطه من [نوتد] خلايا في ال [سفف] تقريبا 3 [اكس] 10⁴ خلايا لكل [مل] من حصيره. تتطلب الاختبارات الفرز ما لا يقل عن 8 x 10⁵ خلايا للحصول علي ما يكفي من خلايا الاوعيه الدموية لزراعه.

5-وسم الخلايا وفرزها

1. الطرد المركزي تعليق الخلية في درجه حرارة الغرفة لمده 5 دقائق في 200 x g، وأعاده تعليق بيليه في حجب المتوسطة في تركيز 1 × 10⁶ خلايا لكل 100 μl.
2. Aliquot علي الأقل 50,000 خلايا للسيطرة غير ملون والفلورية ناقص واحد (FMO) الضوابط في البوليسترين جولة أسفل أنابيب التدفق الخلوي. استخدام بقية الخلايا لتلطيخ متعدد ألوان عن طريق وضع في أنبوب آخر.
   ملاحظه: بمجرد إنشاء إعدادات التجربة (اي ، كثافة الليزر ، استراتيجية النابضة) ، يمكن تقليل عدد الخلايا المستخدمة للتحكم غير الملون و FMOs ، إذا ، الأجسام المضادة المستخدمة هي نفسها.
3. أضافه CD31-V450 (1:400) ، CD34 (1:100) ، CD45-V450 (1:400) و CD146-BV711 (1:100) الأجسام المضادة لتعليق خليه واحده لتلطيخ متعدد ألوان. بالنسبة لعناصر التحكم الخاصة ب FMO ، أضف: لV450 المكافئة ل FMO من CD34 و CD146 بالاضافه إلى V450 التحكم في النمط; لوحدات التخزين المكافئة PE FMO من CD31-V450 و CD45 V450 و CD146 بالاضافه إلى عنصر تحكم النمط PE; لBV711 المكافئة ل FMO من CD31-V450 و CD45 V450 و CD34-PE بالاضافه إلى التحكم في النمط الBV711.
4. ماصه برفق ، أو دوامه ببطء الحل في أنبوب لخلط واحتضان الأنابيب في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه في الظلام.
5. اعداد حبات التحكم في التعويض. أضافه 15 μL من الخرز الإيجابي و 15 μL من الخرز السلبية إلى 70 μL من حجب المتوسطة في 3 البوليسترين جولة أسفل أنابيب التدفق الخلوي. أضافه CD34 ، CD31-V450 أو CD45 V450 ، والأجسام المضادة CD146-BV711 ، واحد لكل أنبوب.
6. ماصه برفق ، أو دوامه ببطء ، لخلط الأجسام المضادة مع الخرز واحتضان جميع الأنابيب في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه في الظلام.
   ملاحظه: يمكن استخدام الاجراء الموصوف اما لتحليل التدفق الخلوي أو فرز الخلايا.
7. اعداد أنابيب جمع من قبل ترطيب السطح الداخلي للأنابيب مع متوسط نمو بطانية (غير عادي) ، وترك ما يقرب من 50 μL من المتوسطة في الجزء السفلي من كل أنبوب.
8. بعد حضانة الأجسام المضادة ، وأزاله الزائدة من الأجسام المضادة عن طريق غسل الخلايا والخرز مع 2 مل من منع المتوسطة.
9. أزاله الحل عن طريق يطرد الأنابيب في 200 x g ل 5 دقيقه ويستنشق بعناية supernatant. تكرار خطوه الغسيل.
10. أعاده تعليق الخلايا في منع المتوسطة في تركيز نهائي من 1 × 10⁶ خلايا لكل 250 Μl. أعاده تعليق الخرز في 100 μl من حجب المتوسطة.
11. نقل الخلايا إلى البوليسترين الجديد جولة أسفل أنابيب التدفق الخلوي مع غطاء مصفاه الخلية. وهذا سيسمح بتعطيل كتل الخلايا.
12. نقل جميع الخلايا والمعلقات حبه إلى فأرز الخلية علي الجليد في الظلام.
13. تشغيل خلايا التحكم غير الملون لتاسيس الفلورية الخلفية وتعيين الفولتية.
14. تشغيل أنابيب التحكم التعويض لتعيين التعويض مضان.
15. استخدام منطقه مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل ناحية مبعثر الجانب (SSC-A) لتحديد الخلايا ، ومن ثم استخدام ناحية مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل ارتفاع مبعثر إلى الامام (FSC-H) لتحديد خلايا واحده.
16. أضافه DAPI ، 1 μL من 5 ميكروغرام/مل الحل لكل مل من عينه ، إلى السيطرة غير ملون لتعيين النابضة للخلايا الميتة (الشكل 2). لا يلزم الغسيل بعد تلطيخ DAPI.
17. قم بتشغيل عناصر تحكم النمط لتاسيس عتبات الخلفية المتعلقة بالربط غير المحدد وتعيين النابض.
18. تشغيل العينة الملونة متعددة ألوان. استبعاد الخلايا التي تكون الدم والبطانية عن طريق النابضة علي CD31 و CD45 الخلايا السالبة. جمع السكان pericyte (^{CD146 + CD34)}والخلايا الخلوية ( CD146-^{CD34 +}) في أنابيب جمع (الشكل 2).
    ملاحظه: إنتاجيه الخلايا القابلة للاستمرار الأمثل هي تقريبا 2% من التفكك الكلي للخلايا الحية ل pericytes و 1.5% لخلايا التهوية.

6-ثقافة الخلية

1. البذور الطازجة فرزها perسيلات والخلايا التهوية في كثافة 30,000 إلى 40,000 الخلايا/سم² علي لوحات الجيلاتين المغلفة الثقافة
2. لمعطف لوحات الثقافة ، وتغطيه منطقه لوحه مع العقيمة 0.2 ٪ (ث/الخامس) الجيلاتين في حل تلفزيوني (تقريبا 100 μL من محلول لكل سم²). احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه وأزاله الحل. الحفاظ علي فرز الخلايا الطازجة علي الجليد خلال طلاء لوحه الثقافة.
3. الطرد المركزي الخلايا التي تم جمعها حديثا في 200 x g لمده 5 دقائق وأعاده التعليق برفق بيليه الخلية في كميه مناسبه من متوسط نمو بطانية (غير عادي). إذا كان عدد الخلايا التي تم جمعها منخفض جدا ، تجنب طرد ولوحه مباشره الخلايا التي تم جمعها.
4. بذور الخلايا علي لوحات الجيلاتين المغلفة. احتضان في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO₂.
5. مره واحده واستقرت الخلايا والتمسك لوحه (بعد ما لا يقل عن 72 h) ، تبادل غير عادي مع متوسط نمو الخلايا الوعائية (DMEM تستكمل مع 20 ٪ الحرارة النشطة FCS ، 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين و 1 ٪ L-الجلوتامين) لكل من الخلايا الخلوية والتهوية.
6. مره واحده وقد وصلت pericytes والخلايا التهوية 80 ٪-90 ٪ التقاء ، والخلايا الانفصال باستخدام 0.05 ٪ تريبسين-أدتا. جمع مع 5 ٪ FCS/تلفزيوني ، جهاز الطرد المركزي في 200 x g لمده 5 دقائق ، أعاده التعليق في متوسط نمو الخلايا الوعائية ، ومن ثم مرور الخلايا من 1:3 إلى 1:5 نسبه (أو في حوالي 7,000 الخلايا/سم²) علي لوحات الثقافة البوليسترين غير المصقول أو قوارير.

النتائج

ادي التفكك الميكانيكي للدهون اليدوية إلى إنتاج الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا (MAT) ، والتي تتكون من مجموعه من الخلايا الشحمية التي تغلف شبكه الاوعيه المجهرية (الشكل 3). تحليل المناعية من الجيلاتين-جزءا لا يتجزا من كريوفيكسيد ويسلط الضوء علي هذا الهيكل ، وتب...

Discussion

تصف هذه الورقة التجزئة الفيزيائية ، باستخدام جهاز مغلق ، من الانسجه الدهنية البشرية إلى مجموعات صغيره تعرض التشريح المجهري للانسجه الدهنية العادية.

يتم تحميل الانسجه الدهنية تحت الجلد الإنسان يدويا ومحلول ملحي في اسطوانه بلاستيكية شفافة تحتوي علي الكرات المعدنية الكبيرة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Buffered paraformaldehyde (PFA)	VWR chemicals	9317.901
0.9% NaCl Solution	Baxter	3KB7127
AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A21422
AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG	Life Technologies	A21245
Ammonium chloride	fisher chemicals	1158868
Antigent Diluent	Life Technologies	3218
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus	BD Biosciences	560497
Avidin/Biotin Blocking Kit	Life Technologies	4303
BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer	BD Biosciences		Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies
Biotinylated Ulex europaeus lectin	Vector Laboratories	Vector-B1065
BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control	BD Biosciences	563044
CD146-BV711	BD Biosciences	563186
CD31-V450	BD Biosciences	561653
CD34-PE	BD Biosciences	555822
CD45-V450	BD Biosciences	560367
DAPI	Life Technologies	D1306	stock concentration: 5mg/mL
Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)	Lipogems		provided in the Lipogems surgical kit
Diva software 306 (v.6.0)	BD Biosciences
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	Life Technologies	61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM	Lonza	CC-3156
Fetal Calf Serum (FCS)	Sigma-Aldrich	F2442
FlowJo (v.10.0)	FlowJo
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Gelatin	Acros Organics	410870025
Lipogems Surgical Kit	Lipogems	LG SK 60
Mouse anti human- NG2	BD Biosciences	554275	stock concentration: 0.5 mg/mL
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap	BD Biosciences	352235, 25/Pack
Polystyrene round bottom 5 mL tubes	BD Biosciences	352003
Rabbit anti human - PDGFRb	Abcam	32570	stock concentration: 0.15 mg/mL
Streptavidin conjugated-488	Life Technologies	S32354
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100-5kg
Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18)	Lipogems		provided in the Lipogems surgical kit
Tris base	fisher chemicals	BP152-500
Type- II Collagenase	Gibco	17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	560373
Widefield Zeiss observer	Zeiss		Objective used: Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)	Zeiss		DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm;  555: Green, excitation 555 nm;  647:Red, excitation 630 nm