細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

要約

ここでは、閉じたシステム装置を用いて酵素フリーの微細断片化をヒト脂肪組織に提示する。この新しい方法は、生体内移植、インビトロ培養、およびさらなる細胞単離および特性化に適した脂肪組織のサブミリメートルクラスターの取得を可能にする。

要約

過去10年間、脂肪組織移植は、組織の再生および/または再生を強化するために、整形外科や整形外科で広く使用されてきました。したがって、ヒト脂肪組織を採取・処理する技術は、大量の組織を迅速かつ効率的に得るために進化してきた。これらの中で、クローズドシステム技術は、短時間で同じ介入(術中)で精製された脂肪組織を収穫、処理、再注入する革新的で使いやすいシステムを表します。脂肪組織は脂肪吸引によって採取され、洗浄され、乳化され、0.3~0.8mmの細胞クラスターに機械的にすすり込まれ、みじん切り.機械的に断片化された脂肪組織の自家移植は、異なる治療において顕著な有効性を示した。美容医学や手術、整形外科、一般的な手術などの適応症。微細断片化脂肪組織の特徴付けは、脂肪細胞クラスター内の無傷の小さな血管の存在を明らかにした。したがって、血管部膜のニッチは動揺しないままにされる。これらのクラスターは、血管細胞(すなわち、間葉系幹細胞(MSC)の祖先)に富み、インビトロ分析では、酵素的に由来するMSCと比較して、組織の修復および再生に関与する成長因子およびサイトカインの放出が増加したことを示した。これは、微細断片化された脂肪組織の優れた治療可能性が推定MSCのより高い頻度および増強された分泌活性によって説明されたことを示唆する。これらの添加されたペリサイトが高成長因子およびサイトカイン産生に直接寄与するかどうかは知られていない。この臨床的に承認された手順により、拡張および/または酵素治療を必要とせずに推定MSCを移植できるため、GMPガイドラインの要件を回避し、細胞ベースの治療のコストを削減できます。

概要

脂肪組織は、再建および美容手術の充填剤として長く使用され、最近では間葉系幹細胞(MSC)1の供給源として認識された再生医療においてより一般的になってきている。単細胞懸濁液を単細胞懸濁液に解離すると、患者に変わらず使用される脂肪細胞フリー間質血管画分(SVF)を得るか、より一般的には、MSC2に数週間培養される。

しかし、酵素解離は組織微小環境を破裂させ、インビトロ培養によってかなり修飾される推定再生細胞から隣接する調節細胞を隔離する。このような実験的なアーティファクトおよび結果的な機能的変化を避けるために、可能な限りそのネイティブ構成をそのまま維持しながら、治療用の脂肪組織を処理する試みがな^{されている3,4。}特に、機械的組織の破壊は酵素解離に取って代わり始めている。この目的のために、完全な浸漬閉塞系マイクロフラグメントリポアスは、サブミリメートル、血液および無油組織クラスター(例えば、リポゲム)にふるい質濾過および鋼大理石誘発^破壊3のシーケンスを介して、マイクロ断片化脂肪組織の自家移植は、この閉じたシステム技術を使用して、複数の適応症、化粧品、整形外科、直腸および婦人^科4、5、複数の適応症で成功している。^6,7,8,9,^10,11,12,13.

閉じたシステム装置と同位体SVFで得られたヒト微細断片脂肪組織(MAT)との比較は、血管/間質細胞分布および培養中の分泌活性に関して、MATはより多くのペリサイトを含有することを明らかにした。推定MSC^14、および成長因子およびサイトカ^イン15のより高い量を分泌する。

本記事は、閉じたシステム装置を用いたヒト皮下脂肪組織の酵素フリー微小断片化、及びインビトロ培養用微小化脂肪組織のさらなる処理、免疫組織化学およびFACS分析、存在する細胞型と分泌される可溶性因子を同定するために(図1)。記載された方法は、生存可能な脂肪組織細胞集団を含む脂肪由来のサブミリメートルオルガノイドを無傷のニッチで安全に生成し、さらなる応用および研究に適している。

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プロトコル

本研究におけるヒト組織の使用に関する倫理的承認は、南東スコットランド研究倫理委員会(参照:16/SS/0103)から得られた。

1. 皮下腹部脂肪組織コレクション

注:手動リポ吸引手順で使用されるすべての器械はマイクロ断片化装置の製造業者によって提供される。

1. 実験を通じて、すべての流体、容器、計器、および操作領域に対する無菌性を維持します。
2. 腹部形成術サンプル(溶液なしで無菌袋に外科チームによって調達)を、皮膚が上向きに向いている外科布の上に置きます。洗濯は不要です。最適な使用のために、4 °Cでサンプルを維持し、収穫の16時間以内に脂肪サンプルを処理します。
3. 37°C 0.9%NaCl溶液の50~100mLを注入し、組織試料の大きさに応じて(最大15cm2脂肪組織表面に50mLを使用し、それに応じて体積を増やす)、使い捨て組織浸潤カニューレを使用して、皮下に脂肪組織。皮の部分によって標本を扱う。
4. 10 mLルアーロックシリンジを使い捨て脂肪吸引カニューレに接続します。
5. 慎重にエッジから脂肪組織内のカニューレを導入します。中に入ったら、プランジャーを引っ張ってシリンジ内に真空を作ります。真空吸引を確保するために手でプランジャーを位置に保ちます。
6. 注射器がリポアポーズでいっぱいになるまで、脂肪組織サンプル内の放射状の動きを行います。組織からカニューレを慎重に取り外し、注射器を取り外します。新しい空の注射器を接続します。
7. リポアプシーの60mLが回収されるまで手順を繰り返す。
   注:処理可能なリポアプサスの最大量は、使用するデバイスの種類に応じて変化する。製造元の説明書(資料表)を参照してください。

2. リポアプサーの微細断片化

注:このプロトコルは、研究用のみを対象としています。マイクロフラグメンテーションは、市販のデバイス(材料の表)の助けを借りて行われます。

1. パッケージからデバイスを取り外し、本体が廃棄物袋に接続されていることを確認します。廃棄物回収袋を地面に置き、バルブがプロセスユニットキャップに固定されていることを確認します。
2. 入力ラインの端子スパイクを袋接続ポートに突き刺して生理生理生データに接続します。生理生理生の袋は処理単位より高く保つ。
   注:このプロトコルで使用される装置のタイプのために、無菌生理生理生理の2,000 mL袋が推薦される。
3. 回路のチューブに接続されている5つのクランプがすべて開いていることを確認します。処理部をグレーキャップを上向きに垂直位置に配置します。
4. 生理生理生理物系の溶液が処理単位を充填できるようにします。流れが廃棄物袋に達していることを確認します。それを振ることによって、処理ユニットからすべての気泡を取り除きます。
   注:以下のすべての通路は、処理装置内の空気がない場合に行う必要があります。
5. 処理部を青いキャップを上向きに垂直な位置に置き、入力ラインの横にあるクランプを閉じます。
6. 青入力キャップの自己閉塞弁にシリンジを接続してリポアセ海賊の注入を開始する。この手順の間に処理ユニットを垂直に保ち、すべてのリポアセ海賊がユニットに移されるまで、シリンジプランジャーをゆっくりと引っ張ります。すべてのリポアセ海賊が処理ユニット内になるまで、このプロセスを繰り返します。
   注:ビデオで使用される処理ユニットの場合は、その時点で最大30mLのリポアセ海賊を追加します。この手順は、リポアプシーの60mLが処理されるまで、最大2回行うことができる。
7. 入力クランプを開いて、生理生の流れを復元します。
8. 少なくとも2分間精力的に処理部を振り、廃棄物袋に生理液の流れを定期的にチェックする。
9. 処理部の生理生理液が透明になったら、約2分の揺れの後、グレーキャップを上に置き、グレーキャップ付近のドレインにあるクランプを閉じます。処理された組織は上部に浮かびます。
10. 10 mL Luerロックシリンジを生理生理生理液で充填し、青いキャップのローディングバルブに接続します。青いキャップの近くにあるクランプを閉じます。空の10 mL Luerロックシリンジを、プランジャーを完全に挿入して、グレーキャップのバルブに接続します。
    注:ルアーロックシリンジのみを使用してください。
11. 青いキャップから加工部に生理生をしっかりと注入します。灰色の弁に接続されている注射器が処理されたティッシュで満たされていることを確認してください。すべての生理食道を注入したら、慎重に両方の注射器を削除します。
12. 処理されたすべての組織が収集されるまで、手順 2.10 と 2.11 を繰り返します。
    注:MATの平均収量は手動脂肪吸引の60 mLから30 mLである。一部の組織は処理装置の中に残り、一部の塊はユニット内の青い端に取り付けられている場合があります。
13. 処理の最後に、すべての注射器を取り外し、すべてのクランプを閉じ、生理生理生殖器袋を取り外し、ローカルプロトコルに従って装置を処分する。
    注:処理装置を再利用できません。

3. 蛍光免疫組織化学

1. MATの300-500 μLを1.5 mLチューブに移します。4%の緩衝パラホルムアルデヒド(PFA)の1 mLを追加し、手で穏やかに混合(渦なし)し、一晩(16〜24時間)4°Cで残します。
2. 試料を回収し、1 mLのPBSを含むクリーンな1.5 mLチューブに移します。この手順を 2 回繰り返して、PFA の過剰を除去します。
3. PBS溶液中に15%(w/v)スクロースで試料を移し、一晩4°C(16~24時間)でインキュベートする
4. 24ウェルプレートの井戸に試料を移し、PBSに15%ショ糖と7%ゼラチン(w/v)で作られた埋め込み溶液を追加します。井戸を半分に満たしてください。37 °Cで4時間インキュベートします。
5. サンプルを4°Cに移します。ゼラチンが固化するために2〜4時間後、埋め込み溶液で井戸を充填し、一晩4°Cに残します。
6. 井戸からサンプルを取り除く。余分な埋め込み化合物を取り除き、ドライアイスで凍結します。サンプルは-80°Cで保存してください。
7. クライオスタットを使用して8-10 μmの厚いセクションを切断します。最適な断面化のために、-30 °Cでクライオスタットを使用してください。スライドは-80 °Cで貯えることができる。
8. 免疫蛍光を続行する前に、4%PFAの切片を7分間固定し、PFAを取り出し、断面からゼラチンを除去するためにぬるま湯PBS(37°C)で2回洗浄します。
9. PBS(v/v)で10%ヤギ血清でスライドを1時間室温で1時間インキュベートすることにより、非特異的抗体結合をブロックします。
10. PBS(w/v):マウス抗ヒト-NG2(1:100、ストック0.5mg/mL)、ウサギ抗ヒトPDGFRβ(1:100、ストック0.15mg/mL)で抗体希釈または0.2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)で一次抗体を希釈する。
11. ブロッキング溶液を除去し、希釈した一次抗体を添加する。一晩4°Cでインキュベートする。
    注:暗闇の中でこれからすべてのインキュベーションステップを実行します。
12. 一次抗体を取り出し、PBSで毎回3回洗浄します。
13. PBSにおける抗体希釈剤または0.2%(w/v)BSA中の二次抗体を希釈する:ヤギ抗マウス-555(1:300)、ヤギ抗ウサギ-647(1:300)。室温で1時間インキュベートする。
14. 二次抗体を取り出し、PBSで毎回3回洗浄します。
15. ビオチン共役レクチンを使用する場合は、アビジン/ビオチン遮断キットを使用してください。PBSとの間に2つの洗い物を提供する各試薬で10分間インキュベートする。
16. PBSで10%ヤギの血清で室温で1時間スライドをインキュベートすることによってブロッキングステップを繰り返します。
17. ビオチン化レクチン、ビオチン化ウレックスエウロウエウスレクチン(1:200、ストック2mg/mL)を添加し、PBSまたは抗体希釈剤で0.2%BSA(w/v)のいずれかで希釈した。室温で1時間30分をインキュベートする。
18. 過剰なビオチン化レクチンを除去し、毎回10分間PBSで3回洗浄する。
19. PBSまたは抗体希釈剤で0.2%(w/v)BSAのいずれかで希釈した二次ストレプトアビジン共役抗体を添加する。1時間インキュベートします。
20. 二次抗体を取り出し、PBSで毎回3回洗浄します。
21. 4',6-ダイアミド-2-フェニリンドール(DAPI,1:500,ストック5mg/mL)を用いたカウンターステイン核を、PBSで0.2%BSA(w/v)で希釈し、室温で10分間希釈した。
22. DAPI溶液を取り出し、PBSで2回、毎回10分ずつ洗います。
23. 水性取り付け剤でスライドを取り付けます。暗闇の中で一晩、または37°Cで1時間、完全に乾燥させてください。
24. 暗いところで4°Cのスライドを保ち、エピ蛍光顕微鏡で画像を取得します。

4. 微細断片化脂肪組織の消化と細胞分離

1. 微細断片化した脂肪組織を無菌容器に移す。
2. 1mg/mLの濃度でDMEMにタイプIIコラゲナーゼを溶解することにより、消化培地を作り上げます。
3. 微細断片化した脂肪組織に同じ体積の消化培地を加える(すなわち、30mLの試料の消化培地を加える)。
4. 密封容器を37°Cの振水浴に入れ、120rpmに設定し、45分間使用します。容器はサンプルの適切な揺れを可能にする必要がありますのでご注意ください。大きな容器が利用できない場合は、水平に配置された2本の50mLチューブ(それぞれに30mLのサンプル/消化培地混合物)を使用してください。
5. インキュベーション後、同量のブロッキング溶液(2%(v/v)FCS/PBS)を加えて消化をブロックし、100μmおよび70 μmセルストレーナーを通して順次濾過します。
6. 200 x gで5分間フィルタリングされた懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。
7. 赤血球逆流バッファーの約5 mL(155 mM NH₄Cl、170 mMトリス、pH 7.65)でペレットを再ステーペンドします。緩衝液の体積は、細胞ペレットで観察される赤血球汚染に応じて変化してもよい。室温で15分間インキュベートします。
8. 同量のブロッキング溶液を追加し、40 μmセルストレーナーを通してフィルターを行います。
9. 200 x gで5分間セル懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄する。
10. ブロッキング溶液中のペレットを再中断します。ピペッティングでよく混ぜます。血球計でトリパンブルーの除外で生存細胞を数えます。
    1. セル懸濁液の同じ体積をトリパンブルーの汚れと混ぜます。溶液の10 μLを吸引し、ヘモサイトメーターに置きます。
    2. 少なくとも5つの正方形に存在する生細胞(明るく丸い)の数を数え、平均セル数を取得します。染色希釈係数を含めるために、平均細胞数に2を掛けます。サンプルの1 mL当たりの生細胞の総数を取得するには、得られた数に10⁴を掛ける。
       注:得られた単一細胞懸濁液、すなわち間質血管画分(SVF)は、皮膜細胞増殖培地で20,000^細胞/cm2で播種することができる(DMEMはFCSで20%の熱を補充し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1%であるL-グルタミン)またはフローサイトメトリー分析およびソートに使用される。SVFにおける核細胞の平均収率は、MATのmL当たり約3x10⁴細胞である。並べ替え実験では、培養に十分な血管細胞を得るために、少なくとも 8 x 10⁵細胞が必要です。

5. セルのラベリングとソート

1. 室温で細胞懸濁液を200xgで5分間遠心分離し、100μL当たり1x10⁶細胞の濃度でブロッキング培地でペレットを再懸濁する。
2. アリコートは、未染色コントロールおよび蛍光マイナス1(FMO)に対して少なくとも50,000細胞をポリスチレン丸底流れ細胞測定チューブに対して制御する。別のチューブに入れることによって、多色染色のために細胞の残りの部分を使用してください。
   注:実験の設定が確立されると(すなわち、レーザー強度、ゲーティング戦略)、未染色コントロールおよびFMOに使用される細胞の数を減らすことができる場合、使用される抗体は同じである。
3. CD31-V450(1:400)、CD34-PE(1:100)、CD45-V450(1:400)、CD146-BV711(1:100)抗体を多色染色用単細胞懸濁液に追加します。FMO コントロールの場合は、V450 FMO 同等のボリュームの CD34-PE および CD146-BV711 と V450 アイソタイプ コントロールに追加します。CD31-V450、CD45-V450およびCD146-BV711プラスPEアイソタイプ制御のPE FMO同等のボリュームのために;BV711 FMO同等のボリュームのCD31-V450、CD45-V450およびCD34-PEプラスBV711アイソタイプコントロール用。
4. 穏やかにピペット、または渦はゆっくりと暗闇の中で20分間4°Cでチューブを混合し、インキュベートするチューブ内の溶液。
5. 補償制御ビーズを準備します。3ポリスチレン丸底流量細胞メトリーチューブで、正ビーズ15μL、負ビーズ15μLを70μLのブロッキング培地に加えます。CD34-PE、CD31-V450 または CD45-V450、および CD146-BV711 抗体をチューブごとに 1 つ追加します。
6. 穏やかにピペット、または渦をゆっくりと、ビーズと抗体を混合し、暗闇の中で20分間4°Cですべてのチューブをインキュベートする。
   注: 説明する手順は、フローサイトメトリー分析または細胞ソートのいずれかに使用できます。
7. 内皮成長培地(EGM)でチューブの内面をあらかじめ濡らして回収管を準備し、各チューブの底部に約50μLの培地を残します。
8. 抗体インキュベーション後、細胞およびビーズを2mLの遮断培地で洗浄して抗体の過剰を除去する。
9. チューブを200 x gで5分間遠心分離し、上清を慎重に吸引して溶液を取り出します。洗浄工程を複製します。
10. ブロッキング培地中の細胞を、250 μL当たり1x10⁶細胞の最終濃度で再中断し、ビーズを100μLのブロッキング培地で再中断する。
11. 細胞ストレーナーキャップを持つ新しいポリスチレン丸底フローサイトメトリーチューブに細胞を移します。これにより、セルの束が中断されます。
12. 暗闇の中で氷の上のセルソーターにすべてのセルとビーズ懸濁液を輸送します。
13. 染色されていない制御セルを実行して、背景蛍光を確立し、電圧を設定します。
14. 補正制御チューブを実行して、蛍光補正を設定します。
15. 前方散布領域(FSC-A)とサイドスキャッタエリア(SSC-A)を使用してセルを識別し、フォワードスキャッタエリア(FSC-A)と前方散布高さ(FSC-H)を使用して単一のセルを選択します。
16. DAPIを加え、試料の各mLに対して5μg/mL溶液の1 μLを加え、染色されていないコントロールに死細胞のゲーティングを設定する(図2)。DAPI染色後は洗浄不要です。
17. アイソタイプコントロールを実行して、非特異的結合に関連する背景蛍光閾値を設定し、ゲーティングを設定します。
18. マルチカラー染色サンプルを実行します。CD31およびCD45陰性細胞をゲーティングすることにより、血化細胞および内皮細胞を除外する。集採取管に集血(CD146⁺ CD34^-) およびアドベンティシャルセル (CD146^- CD34⁺) 集団を収集チューブに集める(図2)。
    注:最適な生存細胞収率は、ペリサイトの全生存細胞解離の約2%、アドベンティシャル細胞の1.5%である。

6. 細胞培養

1. ゼラチン被覆培養プレート上の30,000~40,000細胞/cm2の密度で新たに選別されたペリサイトおよびアドベンティシャル細胞
2. 培養プレートをコーティングするには、PBS溶液中の無菌0.2%(w/v)ゼラチン(cm2当たり溶液約100μL)でプレート領域を覆う。室温で10分間インキュベートし、溶液を除去します。培養プレートコーティング中に氷の上に新鮮にソートされた細胞を保管してください。
3. 遠心分離機は、200 x gで5分間採取し、細胞ペレットを適切な量の内皮増殖培地(EGM)で穏やかに再中断する。採取した細胞の数が非常に少ない場合は、遠心分離を避け、採取した細胞を直接プレートに入れます。
4. ゼラチンコーティングされたプレートに細胞を種をまきます。5% CO₂で 37 °C でインキュベートします。
5. 細胞がプレートに定着して(少なくとも72時間後)、外皮細胞増殖媒とEGMを交換し(DMEMは20%熱不活性化FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1%L-グルタミンを補充)、ペリサイトおよびアドベンショナル細胞の両方について。
6. ペリサイトおよびアドベンティカル細胞が80%〜90%の合流に達すると、0.05%トリプシン-EDTAを使用して細胞を解離する。5%FCS/PBSで収集し、遠心分離機を200 x gで5分間集め、血管細胞増殖培地で再中断し、1:3~1:5の比率(または約7,000セル/cm2)からコーティングされていないポリスチレン培養プレートまたはフラスコに細胞を通過させます。

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結果

手動リポアセッセンシーの機械的解離は、微小血管ネットワークを包む脂肪細胞の集合体からなる微小断片化脂肪組織(MAT)の産生をもたらした(図3)。ゼラチン埋め込みおよび凍結固定MATの免疫蛍光分析は、この構造を強調し、主に小さな毛細血管様血管からなる内皮細胞マーカーウレックス・エウロペウス・アグルチニン1(UEA-1)受容体によってマ...

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ディスカッション

本論文では、閉じたシステム装置を用いて、正常な脂肪組織微小解剖学を示す小さなクラスターにヒト脂肪組織の物理的分画について説明する。

手動吸引ヒト皮下脂肪組織および生理液は、装置の激しい手動振盪の際に、脂肪をサブミリメートルに破裂させる大きなピンボールスタイルの金属球を含む透明なプラスチックシリンダーにロードされるフラグメント。付属?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Buffered paraformaldehyde (PFA)	VWR chemicals	9317.901
0.9% NaCl Solution	Baxter	3KB7127
AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A21422
AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG	Life Technologies	A21245
Ammonium chloride	fisher chemicals	1158868
Antigent Diluent	Life Technologies	3218
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus	BD Biosciences	560497
Avidin/Biotin Blocking Kit	Life Technologies	4303
BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer	BD Biosciences		Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies
Biotinylated Ulex europaeus lectin	Vector Laboratories	Vector-B1065
BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control	BD Biosciences	563044
CD146-BV711	BD Biosciences	563186
CD31-V450	BD Biosciences	561653
CD34-PE	BD Biosciences	555822
CD45-V450	BD Biosciences	560367
DAPI	Life Technologies	D1306	stock concentration: 5mg/mL
Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)	Lipogems		provided in the Lipogems surgical kit
Diva software 306 (v.6.0)	BD Biosciences
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	Life Technologies	61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM	Lonza	CC-3156
Fetal Calf Serum (FCS)	Sigma-Aldrich	F2442
FlowJo (v.10.0)	FlowJo
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Gelatin	Acros Organics	410870025
Lipogems Surgical Kit	Lipogems	LG SK 60
Mouse anti human- NG2	BD Biosciences	554275	stock concentration: 0.5 mg/mL
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap	BD Biosciences	352235, 25/Pack
Polystyrene round bottom 5 mL tubes	BD Biosciences	352003
Rabbit anti human - PDGFRb	Abcam	32570	stock concentration: 0.15 mg/mL
Streptavidin conjugated-488	Life Technologies	S32354
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100-5kg
Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18)	Lipogems		provided in the Lipogems surgical kit
Tris base	fisher chemicals	BP152-500
Type- II Collagenase	Gibco	17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	560373
Widefield Zeiss observer	Zeiss		Objective used: Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)	Zeiss		DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm;  555: Green, excitation 555 nm;  647:Red, excitation 630 nm