Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir menschliche Fettgewebe enzymfreie Mikrofragmentierung mit einem geschlossenen Systemgerät. Diese neue Methode ermöglicht die Gewinnung von Submillimeter-Clustern von Fettgewebe, die für In-vivo-Transplantationen, In-vitro-Kulturen und weitere Zellisolation und -charakterisierung geeignet sind.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren wurden Fettgewebetransplantationen häufig in der plastischen Chirurgie und Orthopädie eingesetzt, um die Gewebeaufreicherung und/oder Regeneration zu verbessern. Dementsprechend haben sich Techniken zur Ernte und Verarbeitung von menschlichem Fettgewebe entwickelt, um schnell und effizient große Mengen an Gewebe zu erhalten. Unter diesen stellt die geschlossene Systemtechnologie ein innovatives und einfach zu bedienendes System zur Ernte, Verarbeitung und Reinjektion von raffiniertem Fettgewebe in kurzer Zeit und in der gleichen Intervention (intraoperativ) dar. Adiposegewebe wird durch Fettabsaugung, gewaschen, emulgiert, gespült und mechanisch in Zellcluster von 0,3 bis 0,8 mm gehackt. Indikationen wie ästhetische Medizin und Chirurgie, orthopädische und allgemeine Chirurgie. Die Charakterisierung von mikrofragmentiertem Fettgewebe ergab das Vorhandensein intakter kleiner Gefäße in den Adipozyten-Clustern; daher bleibt die perivaskuläre Nische ungestört. Diese Cluster sind in perivaskulären Zellen angereichert (d. h. mesenchymale Stammzell (MSC) Vorfahren) und In-vitro-Analysen zeigten eine erhöhte Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, die an der Gewebereparatur und -regeneration beteiligt sind, im Vergleich zu enzymatisch abgeleiteten MSCs. Dies deutet darauf hin, dass das überlegene therapeutische Potenzial des mikrofragmentierten Fettgewebes durch eine höhere Häufigkeit von mutmaßlichen MSCs und verbesserte sekretore Aktivität erklärt wird. Ob diese zusätzlichen Pericyte direkt zu einem höheren Wachstumsfaktor und zur Zytokinproduktion beitragen, ist nicht bekannt. Dieses klinisch zugelassene Verfahren ermöglicht die Transplantation mutmaßlicher MSCs ohne Erweiterung und/oder enzymatische Behandlung, wodurch die Anforderungen der GMP-Richtlinien umgangen werden und die Kosten für zellbasierte Therapien gesenkt werden.

Einleitung

Adipose Gewebe, lange als Füllstoff in der rekonstruktiven und kosmetischen Chirurgie verwendet, ist in letzter Zeit beliebter in der regenerativen Medizin einmal als Quelle für mesenchymale Stammzellen (MSCs)^anerkannt1 . Lipoaspiraturen, die enzymatisch in einzellige Suspensionen dissoziiert sind, ergeben eine adipozytenfreie stromale Gefäßfraktion (SVF), die unverändert beim Patienten verwendet wird oder, häufiger, für mehrere Wochen in MSCs²kultiviert wird.

Die Enzymdissoziation bricht jedoch die Gewebemikroumgebungen und schützt benachbarte regulatorische Zellen von mutmaßlichen regenerativen Zellen ab, die durch die In-vitro-Kultur erheblich verändert werden. Um solche experimentellen Artefakte und daraus resultierenden funktionellen Veränderungen zu vermeiden, wurden Versuche unternommen, Fettgewebe für den therapeutischen Gebrauch zu verarbeiten und gleichzeitig seine native Konfiguration so intakt wie möglich zu halten^3,4. Insbesondere die mechanische Gewebestörung hat begonnen, die enzymatische Dissoziation zu ersetzen. Zu diesem Zweck wird das vollständige Tauchsystem Mikrofragmente Lipoaspiraten in submillimeter-, blut- und ölfreie Gewebehaufen (z.B. Lipogems) über eine Sequenz von Siebfiltration und Stahlmarmor induzierte Störung³. Die autologe Transplantation von mikrofragmentiertem Fettgewebe mit dieser geschlossenen Systemtechnologie war in mehreren Indikationen erfolgreich, die Kosmetika, Orthopädie, Proktologie und Gynäkologie umfassen^{4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13}.

Der Vergleich zwischen menschlichem mikrofragmentiertem Fettgewebe (MAT), das mit dem geschlossenen Systemgerät gewonnen wurde, und isogener SVF ergab, dass MAT in Bezug auf die vaskuläre/stromale Zellverteilung und die sekretorische Aktivität in der Kultur mehr Pericyte enthält, die mutmaßliche MSCs¹⁴und sezerniert höhere Mengen an Wachstumsfaktoren und Zytokinen¹⁵.

Der vorliegende Artikel veranschaulicht die enzymfreie Mikrofragmentierung des menschlichen subkutanen Fettgewebes mit einem geschlossenen Systemgerät und die Weiterverarbeitung solcher mikronisierten Fettgewebe für In-vitro-Kultur, Immunhistochemie und FACS-Analyse, um die vorhandenen Zelltypen und die sezernierten löslichen Faktoren zu identifizieren (Abbildung 1). Die beschriebene Methode erzeugt sicher adipose abgeleitete Submillimeter-Organoide, die lebensfähige Fettgewebezellpopulationen in einer intakten Nische enthalten, die für weitere Anwendungen und Studien geeignet ist.

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Protokoll

Die Ethikkommission für die Verwendung von menschlichem Gewebe in dieser Forschung wurde von der South East Scotland Research Ethics Committee (Referenz: 16/SS/0103) erteilt.

1. Subkutane Abdominal Adipose Gewebesammlung

HINWEIS: Alle im manuellen Lipo-Aspirationsverfahren verwendeten Instrumente werden vom Hersteller des Mikrofragmentierungsgeräts zur Verfügung gestellt.

1. Bewahren Sie die Sterilität für alle Flüssigkeiten, Behälter, Instrumente und den Betriebsbereich während des gesamten Experiments aufrecht.
2. Legen Sie die Abdominoplastikprobe (vom chirurgischen Team beschafft in einen sterilen Beutel ohne Lösung) auf ein chirurgisches Tuch mit der Nachobenhaut. Es ist kein Waschen erforderlich. Für eine optimale Anwendung die Probe bei 4 °C aufbewahren und die Fettprobe innerhalb von 16 h nach der Ernte verarbeiten.
3. Injizieren Sie 50 bis 100 ml 37 °C 0,9% NaCl-Lösung, abhängig von der Größe der Gewebeprobe (verwenden Sie 50 ml für maximal 15 cm² Fettgewebeoberfläche und erhöhen Sie das Volumen entsprechend), mit einer Einweg-Gewebeinfiltrationskanüle, in die subkutane Fettgewebe. Behandeln Sie die Probe durch den kutanen Teil.
4. Schließen Sie eine 10 ml Luer-Sperrspritze an eine Einweg-Fettsaugkanüle an.
5. Führen Sie die Kanüle vorsichtig in das Fettgewebe von den Rändern ein. Sobald Sie drinnen sind, erstellen Sie das Vakuum in der Spritze, indem Sie den Kolben ziehen. Halten Sie den Kolben von Hand in Position, um die Vakuumabsaugung zu sichern.
6. Machen Sie radiale Bewegungen innerhalb der Fettgewebeprobe, bis die Spritze voller Lipoaspirat ist. Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle aus dem Gewebe und trennen Sie die Spritze. Schließen Sie eine neue leere Spritze an.
7. Wiederholen Sie den Vorgang, bis 60 ml Lipoaspirat gesammelt wurden.
   HINWEIS: Die maximale Menge an Lipoaspirat, die verarbeitet werden kann, ändert sich je nach Art des verwendeten Geräts. Bitte beachten Sie die Herstelleranleitung (Materialtabelle).

2. Mikrofragmentierung des Lipoaspirats

HINWEIS: Dieses Protokoll ist nur für die Forschungsnutzung gedacht. Die Mikrofragmentierung erfolgt mit Hilfe eines handelsüblichen Geräts (Materialtabelle).

1. Entfernen Sie das Gerät aus der Verpackung, und stellen Sie sicher, dass das Hauptgerät mit dem Abfallbeutel verbunden ist. Legen Sie den Abfallsammelbeutel auf den Boden und stellen Sie sicher, dass die Ventile an den Verschlüssen der Prozesseinheit befestigt sind.
2. Schließen Sie die Klemmenspitze der Eingangsleitung an den Saline-Beutel an, indem Sie den Sackanschluss durchbohren. Halten Sie den Salinebeutel höher als die Verarbeitungseinheit.
   HINWEIS: Für den in diesem Protokoll verwendeten Gerätetyp wird ein 2.000 ml Beutel steriler Saline empfohlen.
3. Stellen Sie sicher, dass alle 5 Klemmen, die mit den Rohren der Schaltkreise verbunden sind, geöffnet sind. Platzieren Sie die Verarbeitungseinheit in einer vertikalen Position mit der grauen Kappe nach oben.
4. Lassen Sie die Saline-Lösung die Verarbeitungseinheit füllen. Prüfen Sie, ob der Fluss den Abfallbeutel erreicht. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Verarbeitungseinheit, indem Sie sie schütteln.
   HINWEIS: Alle folgenden Passagen müssen in Abwesenheit von Luft in der Verarbeitungseinheit durchgeführt werden.
5. Platzieren Sie die Verarbeitungseinheit in einer vertikalen Position mit der blauen Kappe nach oben und schließen Sie die Klemme neben der Eingangslinie.
6. Beginnen Sie mit der Injektion des Lipoaspirats, indem Sie die Spritze an das selbstverschließende Ventil der blauen Eingangskappe anschließen. Halten Sie die Verarbeitungseinheit während dieses Vorgangs vertikal und ziehen Sie den Spritzenkolben langsam, bis das gesamte Lipoaspirat auf das Gerät übertragen wurde. Wiederholen Sie den Vorgang, bis sich das gesamte Lipoaspirat innerhalb der Verarbeitungseinheit befindet.
   HINWEIS: Für die im Video verwendete Verarbeitungseinheit fügen Sie maximal 30 ml Lipoaspirat hinzu. Das Verfahren kann maximal zweimal durchgeführt werden, bis 60 ml Lipoaspirat verarbeitet wurden.
7. Öffnen Sie die Eingangsklemme, um den Saline-Fluss wiederherzustellen.
8. Mindestens 2 min die Verarbeitungseinheit kräftig schütteln und den Schaummittel-Lösungsfluss in den Abfallbeutel regelmäßig überprüfen.
9. Wenn die Saline-Lösung in der Verarbeitungseinheit transparent wird, legen Sie nach ca. 2 min Schütteln das Gerät mit der grauen Kappe nach oben und schließen Sie die Klemme am Abfluss in der Nähe der grauen Kappe. Das verarbeitete Gewebe schwebt oben.
10. Füllen Sie eine 10 ml Luer-Sperrspritze mit Einer saline Lösung und schließen Sie sie an das Ladeventil der blauen Kappe an. Schließen Sie die Klemme in der Nähe der blauen Kappe. Schließen Sie eine leere 10 ml Luer-Verriegelungsspritze mit vollständig eingesetztem Kolben an das Ventil der grauen Kappe an.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur Luer-Sperrspritzen.
11. Die Saline aus der blauen Kappe fest in die Verarbeitungseinheit einspritzen. Stellen Sie sicher, dass die mit dem Grauen Ventil verbundene Spritze folglich mit dem verarbeiteten Gewebe gefüllt wird. Nachdem Sie die gesamte Saline injiziert haben, entfernen Sie vorsichtig beide Spritzen.
12. Wiederholen Sie die Schritte 2.10 und 2.11, bis das gesamte verarbeitete Gewebe gesammelt ist.
    HINWEIS: Die durchschnittliche Ausbeute von MAT beträgt 30 ml ab 60 ml manueller Lipoaspirat. Ein Teil des Gewebes bleibt in der Verarbeitungseinheit und einige Klumpen können an der blauen Kante innerhalb des Geräts befestigt sein.
13. Am Ende der Verarbeitung alle Spritzen entfernen, alle Klemmen schließen, den Säumbeutel lösen und das Gerät nach lokalen Protokollen entsorgen.
    HINWEIS: Das Verarbeitungsgerät kann nicht wiederverwendet werden.

3. Fluoreszenz-Immunhistochemie

1. Übertragen Sie 300-500 l MAT in ein 1,5 ml Rohr. 1 ml 4% gepuffertes Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen, vorsichtig von Hand mischen (kein Wirbeln) und bei 4 °C über Nacht (von 16 bis 24 h) ablassen.
2. Sammeln Sie die Probe und übertragen Sie in ein sauberes 1,5 ml Rohr mit 1 ml PBS. Wiederholen Sie den Schritt zweimal, um pfA-Überschuss zu entfernen.
3. Die Probe in 15% (w/v) Saccharose in PBS-Lösung übertragen und bei 4 °C über Nacht inkubieren (von 16 auf 24 h)
4. Die Probe in einen Brunnen einer 24-Well-Platte geben und eine Einbettlösung aus 15% Saccharose und 7% Gelatine (w/v) in PBS hinzufügen. Füllen Sie den Brunnen auf halbem Weg. 4 h bei 37 °C inkubieren.
5. Übertragen Sie die Proben auf 4 °C. Nach 2-4 h für die Gelatine zu erstarren, füllen Sie den Brunnen mit der Einbettlösung und lassen Sie bei 4 °C über Nacht.
6. Entfernen Sie die Proben aus den Brunnen. Überschüssige Einbettungsmasse entfernen und auf Trockeneis einfrieren. Bewahren Sie die Proben bei -80 °C auf.
7. Schneiden Sie 8-10 'm dicke Abschnitte mit einem Kryostat. Für eine optimale Schnittierung verwenden Sie das Kryostat bei -30 °C. Dias können bei -80 °C gelagert werden.
8. Bevor Sie mit der Immunfluoreszenz fortfahren, fixieren Sie die Abschnitte in 4% PFA für 7 min. Entfernen Sie das PFA und waschen Sie zweimal mit lauwarmem PBS (37 °C), um Gelatine aus den Abschnitten zu entfernen.
9. Blockieren Sie die unspezifische Antikörperbindung, indem Sie die Dias mit 10% Ziegenserum in PBS (v/v) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
10. Verdünnung der primären Antikörper in Antikörperverdünnung simpermittel oder 0,2% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (w/v): Maus Anti-Human-NG2 (1:100, Lager 0,5 mg/ml), Kaninchen anti-human-PDGFR (1:100, Lager 0,15 mg/ml).
11. Entfernen Sie die Blockierlösung, und fügen Sie die verdünnten Primärantikörper hinzu. Bei 4 °C über Nacht inkubieren.
    HINWEIS: Führen Sie von nun an alle Inkubationsschritte im Dunkeln aus.
12. Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie 3 Mal mit PBS für 10 min jedes Mal.
13. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Antikörperverdünnung oder 0,2% (w/v) BSA in PBS: Ziege Anti-Maus- 555 (1:300), Ziege Anti-Kaninchen- 647 (1:300). 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
14. Entfernen Sie die sekundären Antikörper und waschen Sie dreimal mit PBS für 10 min jedes Mal.
15. Wenn ein Biotin konjugiertes Lektin verwendet wird, verwenden Sie das Avidin/Biotin-Blockierungskit. 10 min mit jedem Reagenz mit zwei Waschungen dazwischen mit PBS inkubieren.
16. Wiederholen Sie den Blockierschritt, indem Sie die Dias 1 h bei Raumtemperatur mit 10% Ziegenserum in PBS inkubieren.
17. Fügen Sie das biotinylatierte Lektin, biotinyliertes Ulex europaeus lectin (1:200, Vorrat 2 mg/ml), entweder in 0,2% BSA (w/v) in PBS oder Antikörperverdünnung verdünnt hinzugeben. 1 h und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
18. Überschüssiges biotinyliertes Lektin entfernen und dreimal mit PBS für 10 min jedes Mal waschen.
19. Fügen Sie den sekundären streptavidin konjugierten Antikörper hinzu, der entweder in 0,2% (w/v) BSA in PBS oder Antikörperverdünnung verdünnt ist. Inkubieren für 1 h.
20. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie dreimal mit PBS für 10 min jedes Mal.
21. Counterstain-Kerne mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1:500, Lager 5 mg/ml), verdünnt in 0,2% BSA (w/v) in PBS, für 10 min bei Raumtemperatur.
22. Entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie sie zweimal mit PBS, jeweils 10 min.
23. Montieren Sie die Dias mit einem wässrigen Montagemittel. Lassen Sie es vollständig trocknen, entweder über Nacht auf der Bank im Dunkeln oder 1 h bei 37 °C.
24. Halten Sie die Dias bei 4 °C im Dunkeln und erfassen Sie Bilder auf einem Epifluoreszenzmikroskop.

4. Verdauung des mikrofragmentierten Fettgewebes und Zellisolierung

1. Übertragen Sie das mikrofragmentierte Fettgewebe in einen sterilen Behälter.
2. Das Verdauungsmedium frisch aufstellen, indem man die Typ-II-Kollagenase in DMEM in der Konzentration von 1 mg/ml auflöst.
3. Fügen Sie dem mikrofragmentierten Fettgewebe das gleiche Volumen des Verdauungsmediums hinzu (d. h. für 30 ml Probe 30 ml Verdauungsmedium hinzufügen).
4. Legen Sie den versiegelten Behälter 45 min in ein 37 °C Schüttelwasserbad mit 120 Umdrehungen pro Minute. Bitte beachten Sie, dass der Behälter ein ordnungsgemäßes Schütteln der Probe ermöglichen sollte. Wenn kein großer Behälter verfügbar ist, verwenden Sie zwei 50 ml Rohre (jeweils 30 ml Proben-/Verdauungsmediummischung) horizontal platziert.
5. Blockieren Sie nach der Inkubation die Verdauung, indem Sie ein gleiches Volumen an Blockierlösung (2% (v/v) FCS/PBS) hinzufügen und sequenziell durch 100 m und 70 m Zellsiebe filtern.
6. Zentrifugieren Sie die gefilterte Aufhängung für 5 min bei 200 x g. Entsorgen Sie den Überstand.
7. Das Pellet in ca. 5 ml Erythrozytenlysepuffer (155 mM NH₄Cl, 170 mM Tris, pH 7,65) wieder aufsetzen. Das Puffervolumen kann je nach der erythrozytenKontamination, die im Zellpellet beobachtet wird, variieren. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
8. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Blockierlösung hinzu und filtern Sie durch ein 40-m-Zellensieb.
9. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 200 x g und entsorgen Sie den Überstand.
10. Setzen Sie das Pellet in der Sperrlösung wieder aus. Durch Pipettieren gut mischen. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypan-Blauausschluss auf einem Hämozytometer.
    1. Mischen Sie ein gleiches Volumen der Zellsuspension mit Trypan blauen Fleck. 10 l der Lösung aspirieren und auf ein Hämozytometer legen.
    2. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen (hell und rund), die in mindestens 5 Quadraten vorhanden sind, und erhalten Sie die mittlere Zellzahl. Um den Fleckenverdünnungsfaktor einzubeziehen, multiplizieren Sie die mittlere Zellzahl mit 2. Um die Gesamtzahl der lebenden Zellen pro 1 ml der Probe zu erhalten, multiplizieren Sie die erhaltene Zahl mit 10⁴.
       HINWEIS: Die erhaltene einzellige Suspension, nämlich die stromale Gefäßfraktion (SVF), kann entweder mit 20.000 Zellen/cm² im perivaskulären Zellwachstumsmedium (DMEM ergänzt durch 20% Inaktivierte Wärme, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin) oder zur Analyse und Sortierung der Durchflusszytometrie verwendet. Die durchschnittliche Ausbeute von Nukleatzellen im SVF beträgt etwa 3 x 10⁴ Zellen pro ml MAT. Sortierexperimente erfordern mindestens 8 x 10⁵ Zellen, um genügend perivaskuläre Zellen für die Kultivierung zu erhalten.

5. Zellkennzeichnung und -sortierung

1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 min bei 200 x gund setzen Sie das Pellet in einem Blockiermedium in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen pro 100 l wieder auf.
2. Aliquot mindestens 50.000 Zellen für die ungefärbte Kontrolle und die Fluoreszenz minus eins (FMO) steuert in Polystyrol runden Bodenfluss Zytometrie-Röhren. Verwenden Sie den Rest der Zellen für die mehrfarbige Färbung, indem Sie sie in ein anderes Rohr legen.
   HINWEIS: Sobald die Einstellungen des Experiments festgelegt wurden (d. h. Laserintensität, Gating-Strategie), kann die Anzahl der Zellen, die für die unbefleckte Steuerung verwendet werden, und die FMOs reduziert werden, wenn die verwendeten Antikörper identisch sind.
3. Fügen Sie CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) und CD146-BV711 (1:100) Antikörper zur Einzelzellsuspension für mehrfarbige Färbung hinzu. Fügen Sie für die FMO-Steuerelemente hinzu: für die V450 FMO-Äquivalent-Volumes cd34-PE und CD146-BV711 plus V450-Isotypsteuerung; für die PE FMO-Äquivalent-Volumes cd31-V450, CD45-V450 und CD146-BV711 plus PE-Isotypkontrolle; für die BV711 FMO-Äquivalent-Volumes von CD31-V450, CD45-V450 und CD34-PE plus BV711-Isotypsteuerung.
4. Sanft Pipette, oder Wirbel langsam die Lösung in der Röhre zu mischen und bebrüten die Rohre bei 4 °C für 20 min im Dunkeln.
5. Vorbereiten von Kompensationskontrollperlen. Fügen Sie in 3 Polystyrol-Rundboden-Flow-Cytometrie-Röhren 15 L positive Perlen und 15 L Negativperlen zu 70 l Blockiermedium hinzu. Fügen Sie CD34-PE, CD31-V450 oder CD45-V450 und CD146-BV711 Antikörper hinzu, eine pro Tube.
6. Sanft Pipette, oder Wirbel langsam, um die Antikörper mit den Perlen zu mischen und alle Rohre bei 4 °C für 20 min im Dunkeln zu inkubieren.
   HINWEIS: Das beschriebene Verfahren kann entweder für die Durchflusszytometrieanalyse oder die Zellsortierung verwendet werden.
7. Bereiten Sie Sammelrohre vor, indem Sie die Innenfläche der Rohre mit endothelialem Wachstumsmedium (EGM) vorbenetzen, sodass ca. 50 l Medium auf der Unterseite jedes Rohres übrig bleiben.
8. Nach der Antikörperinkubation, entfernen Sie den Überschuss an Antikörpern, indem Sie die Zellen und die Perlen mit 2 ml Blockiermedium waschen.
9. Entfernen Sie die Lösung, indem Sie die Rohre 5 min bei 200 x g zentrieren und den Überstand sorgfältig anstreuen. Replizieren Sie den Waschschritt.
10. Setzen Sie die Zellen im Blockiermedium in einer Endkonzentration von 1 x 10⁶ Zellen pro 250 l aus. Setzen Sie die Perlen in 100 l Blockiermedium wieder aus.
11. Übertragen Sie die Zellen in neue Polystyrol-Rund-Boden-Flow-Zytometrie-Röhren mit Zellsiebkappe. Dies wird die Störung von Zellklumpen ermöglichen.
12. Transportieren Sie alle Zell- und Perlensuspensionen im Dunkeln zum Zellsortierer auf Eis.
13. Führen Sie ungefärbte Steuerzellen aus, um die Hintergrundfluoreszenz zu ermitteln und die Spannungen einzustellen.
14. Führen Sie die Kompensationskontrollröhrchen aus, um die Fluoreszenzkompensation einzustellen.
15. Verwenden Sie Vorwärtsstreufläche (FSC-A) vs. Side Scatter Area (SSC-A), um Zellen zu identifizieren, und verwenden Sie dann Vorwärtsstreufläche (FSC-A) vs Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H), um einzelne Zellen auszuwählen.
16. Fügen Sie dAPI, 1 l von 5 g/ml Lösung für jede ml Probe, dem unbefleckten Steuerelement hinzu, um das Gating für abgestorbene Zellen festzulegen (Abbildung 2). Nach der DAPI-Färbung ist kein Waschen erforderlich.
17. Führen Sie Isotypsteuerelemente aus, um Hintergrundfluoreszenzschwellenwerte für die nicht spezifische Bindung festzulegen und die Gating festzulegen.
18. Führen Sie die mehrfarbige gebeizte Probe aus. Ausschließen von hämatopoetischen und endotheliaalen Zellen durch Gating auf CD31 und CD45 negativen Zellen. Sammeln Sie die Pericyte -(CD146⁺ CD34^{- )}und die Adventitialcell (CD146^- CD34⁺) Populationen in Sammelröhren (Abbildung 2).
    HINWEIS: Die optimalen zellfähigen Zellerträge betragen etwa 2 % der gesamten Livezelldissoziation für Pericyten und 1,5 % für adventliche Zellen.

6. Zellkultur

1. Samen frisch sortierte Pericyten und adventliche Zellen mit einer Dichte von 30.000 bis 40.000 Zellen/cm2 auf gelatinebeschichteten Kulturplatten
2. Um die Kulturplatten zu beschichten, bedecken Sie den Plattenbereich mit steriler 0,2% (w/v) Gelatine in PBS-Lösung (ca. 100 l Lösung pro cm²). Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren und die Lösung entfernen. Frisch sortierte Zellen während der Kulturplattenbeschichtung auf Eis halten.
3. Zentrifugieren Sie frisch gesammelte Zellen bei 200 x g für 5 min und setzen Sie das Zellpellet vorsichtig in einer angemessenen Menge an endothelialer Wachstumsmedium (EGM) wieder auf. Wenn die Anzahl der gesammelten Zellen sehr gering ist, vermeiden Sie die Zentrifugation und Platte direkt die gesammelten Zellen.
4. Säen Sie die Zellen auf gelatinebeschichteten Platten. Bei 37 °C in 5%_CO2inkubieren.
5. Sobald sich die Zellen abgelegt und an der Platte haften (nach mindestens 72 h), tauschen Sie EGM mit dem perivaskulären Zellwachstumsmedium (DMEM ergänzt durch 20% hitzeinaktiviertes FCS, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin) gegen Pericytes und adventliche Zellen.
6. Sobald Pericyten und adventliche Zellen 80%-90% Zusammenfluss erreicht haben, dissoziieren Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA. Mit 5% FCS/PBS, Zentrifuge bei 200 x g für 5 min, Re-Suspend in perivaskulärezelligem Zellwachstumsmedium, und dann die Zellen von 1:3 bis 1:5 Verhältnis (oder bei ca. 7.000 Zellen/cm²⁾auf unbeschichtete Polystyrol-Kulturplatten oder -Flaschen übertragen.

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Ergebnisse

Die mechanische Dissoziation manueller Lipoaspiraten führte zur Herstellung von mikrofragmentiertem Fettgewebe (MAT), das aus einem Aggregat von Adipozyten besteht, die ein mikrovaskuläres Netzwerk umhüllen (Abbildung 3). Die Immunfluoreszenzanalyse von gelatine- und kryofixiertem MAT hebt diese Struktur hervor und zeigt das Gefäßnetzwerk, das durch den endothelialen Zellmarker Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1)-Rezeptor gekennzeichnet ist, der hauptsä...

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Diskussion

Dieses Papier beschreibt die physikalische Fraktionierung von menschlichem Fettgewebe in kleinen Clustern, die normale Fettgewebe-Mikroanatomie zeigen, mit einem geschlossenen Systemgerät.

Manuell angesaugte menschliches subkutanes Fettgewebe und eine Saline-Lösung werden in einen transparenten Kunststoffzylinder geladen, der große metallische Kugeln im Flipperstil enthält, die beim kräftigen manuellen Schütteln des Geräts das Fett in sub-Millimeter zerbrechen. Fragmente. Angeschlossene...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Buffered paraformaldehyde (PFA)	VWR chemicals	9317.901
0.9% NaCl Solution	Baxter	3KB7127
AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A21422
AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG	Life Technologies	A21245
Ammonium chloride	fisher chemicals	1158868
Antigent Diluent	Life Technologies	3218
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus	BD Biosciences	560497
Avidin/Biotin Blocking Kit	Life Technologies	4303
BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer	BD Biosciences		Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies
Biotinylated Ulex europaeus lectin	Vector Laboratories	Vector-B1065
BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control	BD Biosciences	563044
CD146-BV711	BD Biosciences	563186
CD31-V450	BD Biosciences	561653
CD34-PE	BD Biosciences	555822
CD45-V450	BD Biosciences	560367
DAPI	Life Technologies	D1306	stock concentration: 5mg/mL
Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)	Lipogems		provided in the Lipogems surgical kit
Diva software 306 (v.6.0)	BD Biosciences
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	Life Technologies	61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM	Lonza	CC-3156
Fetal Calf Serum (FCS)	Sigma-Aldrich	F2442
FlowJo (v.10.0)	FlowJo
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Gelatin	Acros Organics	410870025
Lipogems Surgical Kit	Lipogems	LG SK 60
Mouse anti human- NG2	BD Biosciences	554275	stock concentration: 0.5 mg/mL
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap	BD Biosciences	352235, 25/Pack
Polystyrene round bottom 5 mL tubes	BD Biosciences	352003
Rabbit anti human - PDGFRb	Abcam	32570	stock concentration: 0.15 mg/mL
Streptavidin conjugated-488	Life Technologies	S32354
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100-5kg
Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18)	Lipogems		provided in the Lipogems surgical kit
Tris base	fisher chemicals	BP152-500
Type- II Collagenase	Gibco	17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	560373
Widefield Zeiss observer	Zeiss		Objective used: Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)	Zeiss		DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm;  555: Green, excitation 555 nm;  647:Red, excitation 630 nm