JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الدراسة طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم التي تحمل عوامل تحفيز مستعمرة الحبيبية المحفزة للمناعة من الخلايا الجذعية الجنينية.

Abstract

الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي خلايا جذعية متعددة القدرات قادرة على التجديد الذاتي والتمايز في جميع أنواع الخلايا الجنينية. مثل العديد من أنواع الخلايا الأخرى، تطلق ESCs حويصلات غشاء صغيرة، مثل الإكسوسومات، إلى البيئة خارج الخلية. Exosomes بمثابة الوسطاء الأساسية للاتصال بين الخلايا وتلعب دورا أساسيا في العديد من العمليات الفسيولوجية (باثو). يعمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة (GM-CSF) كسيتوكين لتعديل الاستجابة المناعية. وجود جنرال موتورز CSF في exosomes لديه القدرة على تعزيز وظيفتها التنظيمية المناعية. هنا، تم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط بشكل ثابت في خط خلية مورين ESC ES-D3. تم تطوير بروتوكول لعزل الحويصلات خارج الخلية عالية الجودة المخصبة بالإكسوسوم (EVs) من خلايا ES-D3 التي تفرط في التعبير عن GM-CSF. وتميزت المركبات الكهربائية المعزولة المخصبة بالإكسوسوم بمجموعة متنوعة من النهج التجريبية. والأهم من ذلك، تبين أن كميات كبيرة من المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسوم موجودة في مركبات الكربون الكلورية المحورة. وعموما، قد تعمل المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم الحاملة للآلية العالمية من مركبات الكربون الهيدروفلورية ك الحويصلات الخالية من الخلايا لممارسة أنشطتها التنظيمية المناعية.

Introduction

ESCs مشتقة من مرحلة الكيسة الأريمية لجنين ما قبل الزرع1. كخلايا جذعية متعددة القدرات، تمتلك ESCs القدرة على التجديد الذاتي والتمييز في أي نوع من الخلايا الجنينية. نظرا لإمكاناتها التنموية الرائعة وقدرتها على الانتشار على المدى الطويل ، فإن ESCs ذات قيمة كبيرة للأبحاث الطبية الحيوية1. ركزت جهود البحث الحالية إلى حد كبير على الإمكانات العلاجية ل ESCs لمجموعة متنوعة من الاضطرابات المرضية الرئيسية ، بما في ذلك مرض السكري وأمراض القلب والأمراض العصبية2و3و4.

ومن المعروف أن خلايا الثدييات ، بما في ذلك ESCs ، تطلق الحويصلات ذات الأحجام المتغيرة للبيئة خارج الخلية ، وتمتلك هذه المركبات الكهربائية العديد من الوظائف الفسيولوجية والمرضية بسبب دورها في الاتصال بين الخلايا5. من بين أنواع فرعية مختلفة من المركبات الكهربائية، exosomes هي الحويصلات غشاء صغيرة أطلقت من أنواع مختلفة من الخلايا في الفضاء خارج الخلية عند الانصهار من مقصورات الغدد الصماء المتوسطة، والهيئات متعددة المركبات (MVBs)، مع غشاء البلازما6. وقد أفيد Exosomes للتوسط في الاتصالات بين الخلايا وتشارك بشكل حاسم في العديد من العمليات الفسيولوجية (باثو)7،8. ترث Exosomes بعض الوظائف البيولوجية من خلاياها الأبوية الخاصة ، لأن الإكسوسومات تحتوي على مواد بيولوجية تم الحصول عليها من السيتوسول ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية. وهكذا، يتم تغليف المستضدات المرتبطة بها أو العوامل التي تحفز الاستجابة المناعية المحددة لمرض معين في exosomes من أنواع معينة من الخلايا9. مهد هذا الطريق للتجارب السريرية استكشاف exosomes المستمدة من الورم كلقاح مضاد للسرطان10.

GM-CSF هو السيتوكين الذي تفرزه أنواع مختلفة من الخلايا المناعية11. تظهر الأدلة الناشئة أن GM-CSF ينشط وينظم الجهاز المناعي ويلعب دورا أساسيا في عملية تقديم المستضد12. على سبيل المثال، يشير تقرير سريري إلى أن GM-CSF يحفز الاستجابة المناعية للأورام كلقاح المساعد13. وقد تم التحقيق في العديد من الاستراتيجيات العلاج المناعي السرطان المستندة إلى GM-CSF لاستغلال النشاط المحفز المناعي قوية من GM-CSF في التجارب السريرية14. من بين هذه, وقد أظهرت لقاح السرطان تتألف من الخلايا السرطانية المشععة GM-CSF إفراز بعض الوعد في مرضى سرطان الجلد المتقدمة عن طريق تحفيز الاستجابات المضادة للخلايا والفكاهية ونخر لاحقة في الأورامالمنتشرة 15.

ولأن الإكسوسومات المشتقة من مركبات الكربون الهيدروفلورية تمتلك أنشطة بيولوجية مماثلة لتلك التي تمتلكها البلدان النامية الأصلية، فربما يمكن أن تعمل الإكسوسومات الحاملة للآلية العالمية-CSF من مركبات الكربون الهيدروفلورية كحواف خالية من الخلايا لتنظيم الاستجابة المناعية. في هذه الورقة، يتم وصف طريقة مفصلة لإنتاج مركبات كهربائية عالية الجودة غنية بالإكسوسوم من ESCs تعبر عن GM-CSF. هذه المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم لديها القدرة على العمل ك الحويصلات التنظيمية المناعية لتعديل الاستجابة المناعية.

Protocol

1. زراعة خلايا ES-D3

  1. لتوليد مصل بقري جنيني خال من الاكسوسوم (FBS)، قم بتحميل FBS في جهاز طرد مركزي فائق والطرد المركزي عند 100,000 × غرام لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وجمع المصل الفائق كما FBS خالية من الاكسوسوم لزراعة خط الخلية مورين ESC ES-D3 والحصول على المركبات الكهربائية المخصب exosome.
  2. قبل طلاء خلايا ES-D3، اغلف أطباق زراعة الأنسجة 15 سم باستخدام الجيلاتين (0.1٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. بعد بروتوكول16الموصوفة سابقا ، والثقافة خلايا ES - D3 دون خلايا طبقة التغذية في الجيلاتين المغلفة 15 سم أطباق زراعة الأنسجة. يتكون الوسط ثقافة الخلية ES-D3 من DMEM، FBS الخالية من الإكسوسوم (15٪)، والأحماض الأمينية غير الأساسية (0.1 mM)، L-الجلوتامين (2 mM)، β ميركابتوثانول (0.1 mM)، البنسلين (50 وحدة / مل)، الستريبتومايسين (50 ميكروغرام / مل)، وعامل مثبط لسرطان الدم (LIF؛ 100 وحدة / مل). زراعة خلايا ES-D3 عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
  4. بمجرد أن تصل خلايا ES-D3 إلى حوالي 90٪ من الالتقاء في أطباق زراعة الأنسجة 15 سم ، قم بإزالة الوسط حسب الطموح. غسل الخلايا باستخدام التريبسين (5 مل؛ 0.05٪). أضف التريبسين (5 مل) إلى الأطباق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. جمع الخلايا من الأطباق.
  5. إضافة متوسط ثقافة جديدة (5 مل) إلى الخلايا التي تم جمعها ل inactivate التريبسين. الطرد المركزي الخلايا في 390 × ز لمدة 5 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا في وسط جديد وتحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
  6. بالنسبة للخلايا الممرة، صفح خلايا ES-D3 (5 × 106)في طبق زراعة الأنسجة المغلف بالجيلاتين (0.1٪) مع وسط طازج (15 مل) والثقافة لمدة 3 أيام قبل زراعة الخلايا.
  7. لجمع الخلايا الثقافة supernatant لعزل المركبات الكهربائية المخصب exosome، لوحة خلايا ES-D3 (1 × 107)في الجيلاتين المغلفة (0.1٪) 15 سم طبق زراعة الأنسجة مع المتوسطة الطازجة (15 مل) لمدة 3 أيام قبل جمع خلية الثقافة supernatant.

2. جيل من التعبير جنرال موتورز - CSF plasmid

ملاحظة: إنشاء pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP لفرط التعبير GM-CSF في خلايا ES-D3. في هذا البلازميد، والتعبير عن مورين GM-CSF cDNA جنبا إلى جنب مع البروتين علامة أنسنة رينيلا reniformis GFP (hrGFP) مدفوعة من قبل الإنسان polypeptide سلسلة استطالة عامل 1α (EF1α) المروج17،18.

  1. توليد العمود الفقري المتجه.
    1. هضم pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 ميكروغرام من الحمض النووي) باستخدام إنزيم تقييد EcoRI (100 وحدة) في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتوليد اثنين من شظايا الحمض النووي: العمود الفقري ناقلات (6.0 kb) وإدراج FD3ER (2.5 kb).
    2. نقل 50٪ من الحمض النووي البلازميد المهضوم (10 ميكروغرام) إلى أنبوب واحد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق وعلاجه بالفوسفاتاز القلوية (20 وحدة) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. حل كل من الحمض النووي غير المعالجة وإزالة الفوسفورات باستخدام إلكتروفورسيس هلام الآغاروز (2٪).
    3. تنقية شظايا الحمض النووي العمود الفقري ناقلات (6.0 kb) باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي . وفي حين أن العمود الفقري النواقل غير المعالج سيكون بمثابة المتجه الفارغ (pEF1α-IRES-hrGFP)، فإن العمود الفقري للنواقل المفككة سيستخدم لتوليد البلازميد المعبر عن جنرال موتورز-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
  2. إنشاء إدراج CDNA GM-CSF.
    1. هضم pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 ميكروغرام) باستخدام إنزيم تقييد EcoRI (100 وحدة) في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإنتاج اثنين من شظايا الحمض النووي: العمود الفقري ناقلات (6.5 kb) وإدراج مورين جنرال موتورز-CSF cDNA (474 bp).
    2. حل الحمض النووي المهضوم من خلال إلكتروفورسيس هلام الآغاروز (2٪). تنقية مورين GM-CSF cDNA جزء (474 نقطة أساس) باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي.
  3. توليد البلازميدات التعبير.
    1. إعداد تفاعلات ربط 2 (10 ميكرولتر الحجم الإجمالي) باستخدام عدة ربط الحمض النووي.
      1. لإنشاء المتجه الفارغ pEF1α-IRES-hrGFP، قم بتسييل العمود الفقري للنواقل غير المعالجة من الخطوة 2.1.3 (6.0 كيلوبايت؛ 500 نانوغرام).
      2. لتوليد pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP، ligate شظايا الحمض النووي التالية: (1) العمود الفقري ناقلات dephosphorylated من الخطوة 2.1.3 (6.0 كيلوبايت؛ 500 نانوغرام) و (2) جزء mGM-CSF cDNA ولدت في الخطوة 2.2.2 (474 نقطة أساس؛ 200 نانوغرام).
    2. Ligate عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحويل الحمض النووي المربط إلى خلايا DH5α المختصة E. القولونية. لوحة خلايا الإشريكية القولونية المحولة على لوحات LB-agar التي تحتوي على كاربينسيلين (50 ميكروغرام / مل).
    3. تنقية البلازميدات من مستعمرات الإشريكية القولونية المفردة باستخدام عدة عزل الحمض النووي. التحقق من صحة هويات البلازميدات عن طريق تسلسل الحمض النووي.

3. توليد خلايا ES-D3 الإفراط في التعبير GM-CSF

ملاحظة: تحويل خلايا ES-D3 مع pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP إلى التعبير الزائد GM-CS. Cotransfect وpBabe- نيو بلازميد في خلايا ES-D3 لتسهيل اختيار الخلايا المصابةطعنا 18،20.

  1. تحويل البلازميدات إلى خلايا ES-D3.
    1. صفيحة خلايا ES-D3 (1.4 × 106)في طبق زراعة الأنسجة المغلف بالجيلاتين (0.1٪) مع متوسط الثقافة (10 مل) للإصابة بالعدوى. اللوحة الثقافية لخلايا ES-D3 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    2. إعداد اثنين من خليط البلازميد في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 ميكروغرام، مكافحة ناقلات الأمراض) مع pBabe-Neo (4 ميكروغرام) و(2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 ميكروغرام، مع التعبير عن GM-CSF) مع pBabe-Neo (4 ميكروغرام). تنفيذ العدوى باستخدام عدة العدوى بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
    3. إضافة متوسطة العدوى (1 مل) وكواشف العدوى (64 ميكرولتر) إلى كل أنبوب يحتوي على مخاليط البلازميد واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. إضافة خليط transfection إلى كل 10 سم أطباق من خلايا ES-D3. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعة.
    5. استبدل الأطباق المتوسطة في 10 سم بوسط ثقافي طازج (10 مل). حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. توليد مجموعات كبيرة من خلايا ES-D3 المصابة بشكل ثابت.
    1. إزالة الوسيطة من خلايا ES-D3 المصابة. غسل الخلايا مع تريبسين (2 مل؛ 0.05٪). إضافة تريبسين (2 مل) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وإضافة 2 مل من الثقافة الجديدة المتوسطة لتحييد التريبسين. جهاز طرد مركزي عند 390 x g لمدة 5 دقائق.
    2. إعادة إنفاق الخلايا المصابة في وسط الثقافة الطازجة (10 مل). تقييم كثافة الفلورية من GFP في الخلايا ES-D3 المصابة باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. نقل الخلايا المصابة إلى اثنين من أطباق 10 سم تحتوي على ثقافة جديدة المتوسطة (10 مل). إضافة النيوميسين (0.5 ملغ / مل) للقضاء على الخلايا غير المصابة.
    4. مواصلة زراعة الخلايا المصابة في وسط الثقافة التي تحتوي على النيوميسين (0.5 ملغم / مل). عندما يصل التقاء ES-D3 المصاب بالعدوى إلى 90٪، قم بنقل الخلايا إلى أطباق زراعة الأنسجة 15 سم مرة أخرى. كرر الإجراء لمدة أسبوعين.
  3. توليد استنساخ خلايا ES-D3 المصابة بشكل ثابت.
    1. بمجرد إنشاء مجموعات كبيرة من خلايا ES-D3 المصابة بشكل ثابت ، قم بجمع الخلايا كما كان من قبل. تحديد أرقام الخلايا باستخدام مقياس الدم. الطرد المركزي الخلايا في 390 × ز لمدة 5 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا (1 × 107 خلايا / مل) في وسط الثقافة الطازجة.
    2. تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر معقمة. تنقية GFP إيجابية ES-D3 الخلايا باستخدام FACS، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. لوحة واحدة فرزها ES-D3 الخلية في بئر واحد من الجيلاتين المغلفة (0.1٪) لوحة زراعة الأنسجة 96 جيدا التي تحتوي على الخلايا الأبوية ES-D3 (1 × 103)في المتوسط الخالي من النيوميسين (200 ميكرولتر). يضمن الاستزراع المشترك لخلايا ES-D3 المصابة مع نظيراتها الأبوية غير المصابة بقاء خلايا ES-D3 المفردة المصابة بشكل ثابت وتكاثرها كاستنساخ واحد.
    4. زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة، ومن ثم إضافة النيوميسين (0.5 ملغم/ مل) إلى لوحات 96 بئر للقضاء على الخلايا الأبوية غير المصابة ES-D3.
    5. استمر في زراعة خلايا ES-D3 الإيجابية من GFP في لوحات زراعة الأنسجة ذات 96 بئرا مع متوسط يحتوي على النيوميسين (0.5 ملغم / مل) لمدة أسبوع واحد. نقل خطوط الخلايا clonal ES-D3 إلى الجيلاتين المغلفة (0.1٪) 6 سم أطباق زراعة الأنسجة مع متوسطة الثقافة (5 مل) التي تحتوي على النيوميسين (0.5 ملغم / مل) لمدة أسبوع واحد.
    6. تحديد كثافة مضان GFP في كل من استنساخ الخلايا ES-D3 المصابة باستخدام FACS، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. حدد استنساخ ES-D3 الذي يعبر إما عن GM-CSF أو المتجه الفارغ ذو المستويات العالية من الفلورسينس الأخضر.
    7. تحديد كميات GM-CSF التي تفرزها خلايا ES-D3 باستخدام مجموعة مورين GM-CSF ELISA، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

4. عزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم

  1. زراعة خلايا ES-D3 (1 × 107) في أطباق زراعة الأنسجة 15 سم لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية. جمع ثقافة الخلية supernatant. مخزن جمعت supernatant في 4 درجة مئوية تصل إلى 1 أسبوع للحفاظ على سلامة exosomal.
  2. الطرد المركزي خلية الثقافة supernatant في 5000 س ز لمدة 60 دقيقة في 4 درجة مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي لرواسب شظايا الخلايا الكبيرة.
  3. جمع supernatant والطرد المركزي في 100،000 س ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجة مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي للغاية.
  4. أزل الناتنات الفائق. شطف بلطف كل بيليه مرتين مع المالحة العازلة الفوسفات (PBS; 1 مل) لإزالة الثقافة المتبقية supernatant.
  5. إعادة إنفاق كل بيليه في برنامج تلفزيوني. قياس المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم من خلال محتواها من البروتين5.
    1. قياس تركيز البروتين من المركبات الكهربائية المخصبة exosome مع حمض البيسينونيك (BCA) المقايسة. العائد المتوقع من المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم من خلايا ES-D3 هو ما يقرب من 4 ميكروغرام بروتين / مل من الخلايا التناسلية. Resuspend المركبات الكهربائية المخصبة exosome في برنامج تلفزيوني (تركيز البروتين: ~ 6 ميكروغرام / ميكرولتر). تخزين المركبات الكهربائية المخصب exosome في -80 درجة مئوية.

5. توصيف الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالنقال المجهري الإلكتروني

ملاحظة: التحقيق في تكوين وهيكل المركبات الكهربائية المخصبة exosome معزولة عن ESCs باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (TEM)5.

  1. إصلاح المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم (3-5 ميكروغرام/ميكرولتر) بتركيز نهائي قدره 2٪ من بارافورمالديهايد درجة EM في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  2. تحميل عينات ثابتة (10 ميكرولتر) على شبكات النحاس مع فيلم دعم الكربون. احتضان العينات مع شبكات النحاس لمدة 1 دقيقة، ومن ثم استنزاف الشبكات مع ورقة تصفية.
  3. وصمة عار الشبكات مع محلول تلطيخ بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
  4. نقل الشبكات إلى قطعة من ورق التصفية باستخدام ملاقط. السماح للشبكات لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  5. الحصول على صور المجهر الإلكتروني باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (50،000x التكبير)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

6. تقييم الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالنثرى من قبل تحليل البقع الغربية

  1. إعداد مقتطفات الخلية بأكملها.
    1. إزالة المتوسطة من خلايا ES-D3 المستزرعة في أطباق 15 سم. غسل الخلايا مع تريبسين (5 مل؛ 0.05٪). إضافة تريبسين (5 مل) إلى الخلايا. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. جمع الخلايا وإضافة ثقافة جديدة المتوسطة (5 مل) لتحييد التريبسين. الطرد المركزي الخلايا في 390 × ز لمدة 5 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا في برنامج تلفزيوني.
    2. تحديد أرقام الخلايا باستخدام مقياس الدم. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 390 × ز لمدة 5 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا في المخزن المؤقت لتحميل SDS-PAGE الذي يحتوي على 0.5٪ SDS (5000 خلية/ميكرولتر).
    3. Sonicate عينات لمدة 10 ق باستخدام sonicator مع 10 ٪ السعة (القوة الكهربائية : 500 واط ؛ تردد بالموجات فوق الصوتية : 20 كيلوهرتز). سخني العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. إعداد الليسات من المركبات الكهربائية المخصب exosome.
    1. إعادة إنفاق المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم في المخزن المؤقت للتحميل SDS-PAGE الذي يحتوي على 0.5٪ من SDS بتركيز 1.2 ميكروغرام/ميكرولتر.
    2. Sonicate عينات لمدة 10 ق باستخدام sonicator مع 10 ٪ السعة (القوة الكهربائية : 500 واط ؛ تردد بالموجات فوق الصوتية : 20 كيلوهرتز). سخني العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. الكشف عن البروتينات عن طريق وصمة عار الغربية.
    1. تحميل مستخلصات الخلايا الكاملة (10 ميكرولتر؛ 5000 خلية/ميكرولتر) وليسات EV المخصبة بالإكسوسوم (10 ميكرولتر؛ 1.2 ميكروغرام/ميكرولتر) في كل بئر من هلام Bis-Tris PAGE (4-20٪). نقل البروتينات إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدن (PVDF).
    2. احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة. تمييع الأجسام المضادة (بتركيزات المشار إليها أدناه) في العازلة النشاف التي تحتوي على برنامج تلفزيوني، توين-20 (0.2٪)، والحليب الجاف غير الدهني (10٪ ث / الخامس).
      1. استخدم الأجسام المضادة الأولية التالية: مضادة للمرفقات V (200 نانوغرام/مل)، مضادة للCD81 (50 نانوغرام/مل)، مضادة فلوتيلين-1 (200 نانوغرام/مل)، مضاد للسيتوكروم ج (10 0 نانوغرام/مل)، والإيزوميراز المضاد للبروتين (200 نانوغرام/مل)، ومكافحة GAPDH (33 نانوغرام/مل)، ومكافحة أوكسفوس كوكس الرابع- الوحدة الفرعية الرابعة (600 نانوغرام/مل).
      2. استخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية: الماعز المترافق مع الماعز المضادة للأرانب IgG (20 نانوغرام / مل) والماعز المترافق peroxidase المضادة للفأرة IgG (20 نانوغرام / مل).
    3. الكشف عن البروتينات باستخدام عدة الكشف عن chemiluminescence المحسنة.

7. تحديد تركيزات GM-CSF في الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم بواسطة ELISA

ملاحظة: تقييم كميات GM-CSF في EVs المخصب exosome بواسطة ELISA باستخدام عدة ل murine GM-CSF، بعد بروتوكول الشركة المصنعة مع بعض التعديلات.

  1. معطف لوحة ELISA مع التقاط الأجسام المضادة. علاج المركبات الكهربائية المخصب exosome (0.6 ميكروغرام) في برنامج تلفزيوني وحده أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20 (100 ميكرولتر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إضافة عينات المعالجة إلى لوحة ELISA المغلفة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وحده أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20.
  2. إضافة الأجسام المضادة الكشف إلى العينات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وحده أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20. إضافة Avidin-HRP إلى العينات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وحده أو برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين-20.
  3. تحديد تركيزات GM-CSF في المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم عن طريق قياس الامتصاص عند 450 نانومتر على قارئ لوحة صغيرة.

النتائج

يتم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط في ESCs مورين.
لتعبيرات جنرال موتورز-CSF بشكل مفرط في خلايا ES-D3، تم استنساخ مورين GM-CSF cDNA في ناقل العدوى لتوليد متجه التعبير pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(الشكل 1A). تم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط في خلايا ES-D3 عن طريق العدوى ، وكان حو?...

Discussion

تظهر هذه الدراسة طريقة فعالة للغاية لإنتاج مركبات EVs الغنية بالإكسوسوم تحمل البروتين المحفز للمناعة GM-CSF ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الآثار التضمين المناعي للمركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم. تشير العديد من الدراسات إلى أن exosomes تظهر وظائف مناعية تنظيمية ومضادة للورم22.

Disclosures

قدمت كافيتا يادانايبودي وتشي لي وجون و. إيتون طلب براءة اختراع أمريكي "مؤلفات تتألف من إكسوسومات هندسية مشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية وطرق استخدامها".

Acknowledgements

ونحن ممتنون للسيد Arkadiusz Slusarczyk وكنتاكي شبكة البنية التحتية للبحوث الطبية الحيوية (KBRIN، P20GM103436) للحصول على انتقال صور المجهر الإلكتروني. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح المقدمة من NIH AA018016-01 (J.W.E.) والصندوق الاستئماني لتحدي أبحاث كومنولث كنتاكي (J.W.E.) وNIS CA106599 وCA175003 (C.L.) وNIS CA198249 (K.Y.) ومنحة أبحاث التنفس المجانية (K.Y.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alkaline phosphate, Calf IntestinalNew England BiolabsM0290SDephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAbSanta Cruz Biotechnologyclone H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAbSanta Cruz Biotechnologyclone A-8, sc-13156Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone C-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAbThermo Fisherclone 20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31460Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assayThermo Fisher23223Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015Western blot
Carbenicillin, Disodium SaltThermo Fisher10177012Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterLow speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10Beckman Coulter09U1597Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKLow speed centrifugation
Cu grids with carbon support filmElectron Microscopy SciencesFF200-CuAcquiring electron microscopy images
EcoRINew England BiolabsR0101Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection systemThermo Fisher32106Western blot
FACScalibur flow cytometerBecton DickinsonExamining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serumATCCSCRR-30-2020Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μmThermo Fisher22-363-547Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%)Thermo FisherES006BCulturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kitThermo Fisher88733422Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumThermo Fisher10-829-018Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory FactorThermo FisherESG1106Medium for ES-D3 cells
L-glutamineVWRVWRL0131-0100Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagentThermo Fisher11668019Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XSBioTekDetermining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorterBeckman CoulterIsolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2988JGenerating GM-CSF expression plasmid
NeomycinThermo Fisher10-131-035Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acidsThermo FisherSH3023801Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milkThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher31985062Transfecting ES-D3 cells
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycinVWRsc45000-652Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranesMillipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation KitNew England BiolabsM2200SGenerating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscopeHitachiHT7700Acquiring electron microscopy images
TrypsinVWR45000-660Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHigh speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45TiBeckman Coulter09U4454High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottleBeckman Coulter355622High speed centrifugation
UranyLess staining solutionElectron Microscopy Sciences22409Acquiring electron microscopy images

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?. Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?. PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177 GM CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved