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  • Résumé
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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cette étude décrit une méthode pour isoler des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes porteuses de facteurs de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires immunostimulants à partir de cellules souches embryonnaires.

Résumé

Les cellules souches embryonnaires (CSE) sont des cellules souches pluripotentes capables de s’auto-renouveler et de se différencier en tous types de cellules embryonnaires. Comme beaucoup d’autres types de cellules, les CSE libèrent de petites vésicules membranaires, telles que des exosomes, dans l’environnement extracellulaire. Les exosomes servent de médiateurs essentiels de la communication intercellulaire et jouent un rôle fondamental dans de nombreux processus (patho)physiologiques. Le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) fonctionne comme une cytokine pour moduler la réponse immunitaire. La présence de GM-CSF dans les exosomes a le potentiel de renforcer leur fonction immunorégulatrice. Ici, gm-CSF a été surexprimé de manière stable dans la lignée cellulaire murine ESC ES-D3. Un protocole a été développé pour isoler des vésicules extracellulaires (VE) enrichies en exosomes de haute qualité à partir de cellules ES-D3 surexprimant le GM-CSF. Les véhicules électriques isolés enrichis en exosomes ont été caractérisés par une variété d’approches expérimentales. Il est important de se trouver des quantités importantes de GM-CSF dans les véhicules électriques enrichis en exosomes. Dans l’ensemble, les VE enrichis en exosomes porteurs de GM-CSF provenant de CES pourraient fonctionner comme des vésicules sans cellules pour exercer leurs activités immunorégulatrices.

Introduction

Les CSE sont dérivés du stade de blastocyste d’un embryon préimplantatoire1. En tant que cellules souches pluripotentes, les CSE ont la capacité de s’auto-renouveler et de se différencier en tout type de cellule embryonnaire. En raison de leur potentiel de développement remarquable et de leur capacité proliférative à long terme, les CES sont extrêmement précieux pour la recherche biomédicale1. Les efforts de recherche actuels se sont largement concentrés sur le potentiel thérapeutique des CSE pour une variété de troubles pathologiques majeurs, y compris le diabète, les maladies cardiaques et les maladies neurodégénératives2,3,4.

Les cellules de mammifères, y compris les CSE, sont connues pour libérer des vésicules de tailles variables dans l’environnement extracellulaire, et ces VE possèdent de nombreuses fonctions physiologiques et pathologiques en raison de leur rôle dans la communication intercellulaire5. Parmi les différents sous-types de VE, les exosomes sont de petites vésicules membranaires libérées par divers types de cellules dans l’espace extracellulaire lors de la fusion de compartiments endocytaires intermédiaires, de corps multivésiculaires (M MVB), avec la membraneplasmique 6. Il a été rapporté que les exosomes médient la communication intercellulaire et sont impliqués de manière critique dans de nombreux processus (patho)physiologiques7,8. Les exosomes héritent de certaines fonctions biologiques de leurs propres cellules parentales, car les exosomes contiennent des matériaux biologiques acquis à partir du cytosol, y compris des protéines et des acides nucléiques. Ainsi, les antigènes associés ou les facteurs stimulant la réponse immunitaire spécifique à une maladie donnée sont encapsulés dans les exosomes de types particuliers de cellules9. Cela a ouvert la voie à des essais cliniques explorant les exosomes dérivés de tumeurs en tant que vaccin anticancéreux10.

Gm-CSF est une cytokine sécrétée par différents types de cellules immunitaires11. De nouvelles preuves démontrent que le GM-CSF active et régule le système immunitaire et joue un rôle essentiel dans le processus de présentation de l’antigène12. Par exemple, un rapport clinique suggère que le GM-CSF stimule la réponse immunitaire aux tumeurs en tant qu’adjuvantvaccinal 13. Plusieurs stratégies d’immunothérapie du cancer à base de GM-CSF pour exploiter la puissante activité immunostimulatrice du GM-CSF ont été étudiées dans des essais cliniques14. Parmi ceux-ci, un vaccin anticancéreux composé de cellules tumorales sécrérant du GM-CSF irradiées s’est révélé prometteur chez les patients atteints de mélanome avancé en induisant des réponses antitumorales cellulaires et humorales et une nécrose ultérieure dans les tumeurs métastasées15.

Parce que les exosomes dérivés des CSE possèdent des activités biologiques similaires à celles des CES d’origine, peut-être que les exosomes porteurs de GM-LCR des CES pourraient fonctionner comme des vésicules sans cellules pour réguler la réponse immunitaire. Dans cet article, une méthode détaillée pour produire des VÉHICULES enrichis en exosomes de haute qualité à partir de CES exprimant gm-CSF est décrite. Ces VE enrichis en exosomes ont le potentiel de servir de vésicules immunorégulatrices pour moduler la réponse immunitaire.

Protocole

1. Cultiver des cellules ES-D3

  1. Pour générer du sérum bovin fœtal (FBS) sans exosomes, chargez FBS dans une ultracentrifugeuse et centrifugez à 100 000 x g pendant 16 h à 4 °C. Après la centrifugation, prélever le surnageant sérique sous forme de FBS sans exosomes pour la culture de la lignée cellulaire murine ESC ES-D3 et l’acquisition de VE enrichis en exosomes.
  2. Avant de plaquer les cellules ES-D3, recouvrir des boîtes de culture tissulaire de 15 cm à l’aide de gélatine (0,1%) à température ambiante pendant 30 min.
  3. Conformément à un protocole16décrit précédemment, la culture des cellules ES-D3 sans cellules de la couche nourricière dans les boîtes de culture tissulaire de 15 cm recouvertes de gélatine. Le milieu de culture cellulaire ES-D3 est composé de DMEM, de FBS sans exosomes (15 %), d’acides aminés non essentiels (0,1 mM), de L-glutamine (2 mM), de β-mercaptoéthanol (0,1 mM), de pénicilline (50 unités/mL), de streptomycine (50 μg/mL) et de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF; 100 unités/mL). Culturez des cellules ES-D3 à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2.
  4. Une fois que les cellules ES-D3 atteignent environ 90% de confluence dans des boîtes de culture tissulaire de 15 cm, retirez le milieu par aspiration. Laver les cellules à l’aide de trypsine (5 mL; 0,05%). Ajouter la trypsine (5 mL) dans les plats et incuber à 37 °C pendant 5 min. Collectez les cellules des plats.
  5. Ajouter un milieu de culture frais (5 mL) aux cellules prélevées pour inactiver la trypsine. Centrifuger les cellules à 390 x g pendant 5 min. Ressuspendez les cellules dans un milieu frais et déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  6. Pour les cellules passages, plaquer les cellules ES-D3 (5 x 106) dans un plat de culture tissulaire de 15 cm recouvert de gélatine (0,1%) avec un milieu frais (15 mL) et la culture pendant 3 jours avant de sous-culer les cellules.
  7. Pour recueillir le surnageant de culture cellulaire pour l’isolement des VE enrichis en exosomes, plaquer les cellules ES-D3 (1 x 107)dans une boîte de culture tissulaire de 15 cm recouverte de gélatine (0,1%) avec un milieu frais (15 mL) pendant 3 jours avant de collecter un surnageant de culture cellulaire.

2. Génération de plasmide d’expression GM-CSF

REMARQUE: Générer le plasmide de transfection pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP pour surexprimer GM-CSF dans les cellules ES-D3. Dans ce plasmide, l’expression de l’ADNc GM-CSF murin avec la protéine marqueur humanisée Renilla reniformis GFP (hrGFP) est entraînée par le promoteur du facteur d’élongation de la chaîne polypeptidique humaine 1α (EF1α)17,18.

  1. Générez l’épine dorsale vectorielle.
    1. Digérer le plasmide pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg d’ADN) à l’aide de l’enzyme de restriction EcoRI (100 unités) à 37 °C pendant 2 h pour générer deux fragments d’ADN : le squelette vectoriel (6,0 kb) et l’insert FD3ER (2,5 kb).
    2. Transférer 50 % de l’ADN plasmidique digéré (10 μg) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et traiter avec de la phosphatase alcaline (20 unités) à 37 °C pendant 1 h. Résoudre l’ADN non traité et déphosphorylé à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose (2%).
    3. Purifier les fragments d’ADN de l’épine dorsale du vecteur (6,0 kb) à l’aide d’un kit d’extraction de gel d’ADN. Alors que l’épine dorsale vectorielle non traitée servira de vecteur vide (pEF1α-IRES-hrGFP), l’épine dorsale vectorielle déphosphorylée sera utilisée pour générer un plasmide exprimant gm-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
  2. Générez l’insert d’ADNc GM-CSF.
    1. Digérer le plasmide pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) en utilisant l’enzyme de restriction EcoRI (100 unités) à 37 °C pendant 2 h pour produire deux fragments d’ADN : l’épine dorsale vectorielle (6,5 kb) et l’insert murin GM-CSF aDNc (474 pb).
    2. Résoudre l’ADN digéré par électrophorèse sur gel d’agarose (2%). Purifier le fragment d’ADNc gm-LCR murin (474 pb) à l’aide d’un kit d’extraction de gel d’ADN.
  3. Générez les plasmides d’expression.
    1. Mettez en place 2 réactions de ligature (volume total de 10 μL) à l’aide d’un kit de ligature de l’ADN.
      1. Pour générer le vecteur vide pEF1α-IRES-hrGFP, ligaturez l’épine dorsale du vecteur non traité à partir de l’étape 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).
      2. Pour générer pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligaturez les fragments d’ADN suivants : (1) l’épine dorsale du vecteur déphosphorylé de l’étape 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng) et (2) le fragment d’ADNc mGM-CSF généré à l’étape 2.2.2 (474 pb ; 200 ng).
    2. Ligature à 25 °C pendant 5 min. Transformez l’ADN ligaturé en cellules E. coli compétentes en DH5α. Plaquer les cellules d’E. coli transformées sur des plaques de LB-agar contenant de la carbénicilline (50 μg/mL).
    3. Purifier les plasmides des colonies uniques d’E. coli à l’aide d’un kit d’isolement de l’ADN. Valider l’identité des plasmides par séquençage de l’ADN.

3. Génération de cellules ES-D3 surexprimant GM-CSF

REMARQUE: Transfecter les cellules ES-D3 avec le plasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP pour surexprimer GM-CS. Cotransfecter le plasmide pBabe-Neo dans les cellules ES-D3 pour faciliter la sélection des cellules transfectées de manière stable18,20.

  1. Transfecter les plasmides dans les cellules ES-D3.
    1. Plaquer les cellules ES-D3 (1,4 x 106) dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm recouverte de gélatine (0,1%) avec milieu de culture (10 mL) pour la transfection. Culture de cellules ES-D3 plaquées à 37 °C pendant 24 h.
    2. Préparer deux mélanges de plasmides dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL : (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, lutte antivectorielle) avec pBabe-Neo (4 μg) et (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, exprimant GM-CSF) avec pBabe-Neo (4 μg). Effectuer la transfection à l’aide d’un kit de transfection en suivant le protocole du fabricant.
    3. Ajouter le milieu de transfection (1 mL) et le réactif de transfection (64 μL) à chaque tube contenant les mélanges de plasmides et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    4. Ajouter les mélanges de transfection aux plats respectifs de 10 cm de cellules ES-D3. Incuber à 37 °C pendant 5 h.
    5. Remplacer le milieu dans les plats de 10 cm par un milieu de culture frais (10 mL). Incuber à 37 °C pendant 24 h.
  2. Générer des populations en vrac de cellules ES-D3 transfectées de manière stable.
    1. Retirez le milieu des cellules ES-D3 transfectées. Laver les cellules avec de la trypsine (2 mL; 0,05%). Ajouter la trypsine (2 mL) et incuber à 37 °C pendant 5 min. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 mL et ajouter 2 mL de milieu de culture frais pour neutraliser la trypsine. Centrifuger à 390 x g pendant 5 min.
    2. Ressuspendez les cellules transfectées dans un milieu de culture frais (10 mL). Évaluer l’intensité de fluorescence de la GFP dans les cellules ES-D3 transfectées à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), conformément au protocole du fabricant.
    3. Transférer les cellules transfectées dans deux plats de 10 cm contenant un milieu de culture frais (10 mL). Ajouter la néomycine (0,5 mg/mL) pour éliminer les cellules non transfectées.
    4. Continuer à cultiver les cellules transfectées dans un milieu de culture contenant de la néomycine (0,5 mg/mL). Lorsque l’ES-D3 transfecté atteint 90% de confluence, transférez à nouveau les cellules dans des boîtes de culture tissulaire de 15 cm. Répétez la procédure pendant 2 semaines.
  3. Générez des clones de cellules ES-D3 transfectées de manière stable.
    1. Une fois que des populations en vrac de cellules ES-D3 transfectées de manière stable sont générées, collectez les cellules comme auparavant. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger les cellules à 390 x g pendant 5 min. Ressuspendez les cellules (1 x 107 cellules/mL) dans un milieu de culture frais.
    2. Filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire stérile de 40 μm. Purifier les cellules ES-D3 GFP positives à l’aide de FACS, en suivant le protocole du fabricant.
    3. Plaquer une seule cellule ES-D3 triée dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits recouverte de gélatine (0,1%) contenant des cellules ES-D3 parentales (1 x 103)dans un milieu exempt de néomycine (200 μL). La co-culture de cellules ES-D3 transfectées avec leurs homologues parentaux non transfectés garantit que les cellules ES-D3 uniques transfectées de manière stable survivent et prolifèrent en tant que clone unique.
    4. Culturez les cellules pendant 48 h, puis ajoutez de la néomycine (0,5 mg/mL) sur des plaques de 96 puits pour éliminer les cellules ES-D3 parentales non transfectées.
    5. Continuer à cultiver les cellules ES-D3 GFP positives dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits avec un milieu contenant de la néomycine (0,5 mg / mL) pendant 1 semaine. Transférer des lignées cellulaires clonales ES-D3 dans des boîtes de culture tissulaire de 6 cm recouvertes de gélatine (0,1 %) avec un milieu de culture (5 mL) contenant de la néomycine (0,5 mg/mL) pendant 1 semaine.
    6. Déterminer l’intensité de la fluorescence GFP dans chacun des clones de cellules ES-D3 transfectés à l’aide de FACS, en suivant le protocole du fabricant. Sélectionnez les clones ES-D3 exprimant soit GM-CSF, soit le vecteur vide avec des niveaux élevés de fluorescence verte.
    7. Déterminer les quantités de GM-CSF sécrétées par les cellules ES-D3 à l’aide d’un kit ELISA GM-CSF murin, en suivant le protocole du fabricant.

4. Isolement des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes

  1. Culture des cellules ES-D3 (1 x 107) dans des boîtes de culture tissulaire de 15 cm pendant 72 h à 37 °C. Recueillir le surnageant de culture cellulaire. Conserver le surnageant collecté à 4 °C jusqu’à 1 semaine pour maintenir l’intégrité exosomale.
  2. Centrifuger le surnageant de culture cellulaire à 5 000 x g pendant 60 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse pour sédimenter de gros fragments cellulaires.
  3. Recueillir le surnageant et centrifuger à 100 000 x g pendant 90 min à 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse.
  4. Retirez le surnageant. Rincez doucement chaque pastille deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; 1 mL) pour éliminer le surnageant résiduel de culture.
  5. Resuspendez chaque granulé dans PBS. Quantifier les VE enrichis en exosomes par leur teneur en protéines5.
    1. Mesurer la concentration en protéines des VE enrichis en exosomes à l’avec un test à l’acide bicinchoninique (ACA). Le rendement attendu des VE enrichis en exosomes des cellules ES-D3 est d’environ 4 μg de protéine/mL de surnageant de culture cellulaire. Resuspendez les VE enrichis en exosomes dans le PBS (concentration en protéines : ~6 μg/μL). Stockez les véhicules électriques enrichis en exosomes à -80 °C.

5. Caractérisation des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes par microscopie électronique à transmission

REMARQUE: Étudier la composition et la structure des VE enrichis en exosomes isolés des CES à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM)5.

  1. Fixer les VE enrichis en exosomes (3-5 μg/μL) avec une concentration finale de 2% de paraformaldéhyde de qualité EM à température ambiante pendant 2 h.
  2. Charger des échantillons fixes (10 μL) sur des grilles de cuivre avec un film de support en carbone. Incuber les échantillons avec des grilles de cuivre pendant 1 min, puis égoutter les grilles avec du papier filtre.
  3. Téfez les grilles avec une solution de coloration suivant le protocole du fabricant.
  4. Transférez les grilles sur un morceau de papier filtre à l’aide d’une pince à épilez. Laissez les grilles sécher pendant la nuit à température ambiante.
  5. Acquérir des images de microscopie électronique à l’aide d’un microscope électronique à transmission (grossissement de 50 000x), en suivant le protocole du fabricant.

6. Évaluation des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes par analyse par transfert de Western

  1. Préparez des extraits de cellules entières.
    1. Retirer le milieu des cellules ES-D3 cultivées dans des plats de 15 cm. Laver les cellules avec de la trypsine (5 mL; 0,05%). Ajouter la trypsine (5 mL) aux cellules. Incuber à 37 °C pendant 5 min. Prélever les cellules et ajouter un milieu de culture frais (5 mL) pour neutraliser la trypsine. Centrifuger les cellules à 390 x g pendant 5 min. Resuspendez les cellules dans PBS.
    2. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger à nouveau les cellules à 390 x g pendant 5 min. Resuspendez les cellules dans un tampon de chargement SDS-PAGE contenant 0,5 % de FDS (5 000 cellules/μL).
    3. Soniquer les échantillons pendant 10 s à l’aide d’un sonicateur d’amplitude de 10% (puissance: 500 W; fréquence ultrasonique: 20 kHz). Chauffer les échantillons à 100 °C pendant 5 min.
  2. Préparez les lysates des véhicules électriques enrichis en exosomes.
    1. Resuspendez les VE enrichis en exosomes dans un tampon de chargement SDS-PAGE contenant 0,5 % de FDS à une concentration de 1,2 μg/μL.
    2. Soniquer les échantillons pendant 10 s à l’aide d’un sonicateur d’amplitude de 10% (puissance: 500 W; fréquence ultrasonique: 20 kHz). Chauffer les échantillons à 100 °C pendant 5 min.
  3. Détecter les protéines par transfert Western.
    1. Chargez des extraits de cellules entières (10 μL; 5 000 cellules/μL) et des lysates EV enrichis en exosomes (10 μL; 1,2 μg/μL) dans chaque puits d’un gel Bis-Tris PAGE (4-20%). Transférer des protéines sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF).
    2. Incuber les membranes avec des anticorps primaires et secondaires appropriés. Anticorps dilués (aux concentrations indiquées ci-dessous) dans un tampon de buvard contenant du PBS, du Tween-20 (0,2 %) et du lait sec non grasse (10 % p/v).
      1. Utilisez les anticorps primaires suivants : anti-annexine V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-flottilline-1 (200 ng/mL), anti-cytochrome c (100 ng/mL), anti-disulfure isomérase (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) et anti-Oxphos COX IV-sous-unité IV (600 ng/mL).
      2. Utilisez les anticorps secondaires suivants : IgG anti-lapin de chèvre conjuguée à la peroxydase (20 ng/mL) et IgG anti-souris de chèvre conjuguée à la peroxydase (20 ng/mL).
    3. Détectez les protéines à l’aide d’un kit de détection de chimiluminescence amélioré.

7. Détermination des concentrations de GM-LCR dans les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes par ELISA

REMARQUE: Évaluer les quantités de GM-CSF dans les VE enrichis en exosomes par ELISA à l’aide d’un kit pour le GM-CSF murin, en suivant le protocole du fabricant avec quelques modifications.

  1. Enduire la plaque ELISA d’anticorps de capture. Traiter les VE enrichis en exosomes (0,6 μg) dans le PBS seul ou le PBS + 0,05 % Tween-20 (100 μL) à température ambiante pendant 30 min. Ajouter les échantillons traités sur la plaque ELISA revêtue et incuber à température ambiante pendant 1 h. Lavez la plaque avec PBS seul ou PBS + 0,05% Tween-20.
  2. Ajouter un anticorps de détection aux échantillons. Incuber à température ambiante pendant 1 h. Lavez la plaque avec PBS seul ou PBS + 0,05% Tween-20. Ajoutez Avidin-HRP aux échantillons. Incuber à température ambiante pendant 30 min. Lavez la plaque avec PBS seul ou PBS + 0,05% Tween-20.
  3. Déterminer les concentrations de GM-CSF dans les VE enrichis en exosomes en mesurant l’absorbance à 450 nm sur un lecteur de microplaques.

Résultats

Gm-CSF est surexprimé dans les ESC murins.
Pour surexprimer de manière stable le GM-CSF dans les cellules ES-D3, l’ADNc GM-CSF murin a été cloné dans un vecteur de transfection pour générer le vecteur d’expression pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figure 1A). Le GM-CSF a été surexprimé dans les cellules ES-D3 par transfection, et environ 20% des cellules ES-D3 transfectées transitoirement étaient GFP-positives. De...

Discussion

Cette étude montre une méthode très efficace de production de VE enrichis en exosomes portant la protéine immunostimulatrice GM-CSF, qui peut être utilisée pour étudier les effets immunomodulateurs des VE enrichis en exosomes. Plusieurs études suggèrent que les exosomes présentent des fonctions immunorégulatrices etantitumorales 22. Ainsi, les exosomes des CSE exprimant le GM-CSF pourraient également posséder des activités biologiques qui régulent la réponse immunitaire. Dans ce pr...

Déclarations de divulgation

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li et John W. Eaton ont déposé une demande de brevet aux États-Unis « Compositions comprenant des exosomes dérivés de cellules souches embryonnaires modifiées et leurs méthodes d’utilisation ».

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à M. Arkadiusz Slusarczyk et au Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) d’avoir acquis des images au microscope électronique à transmission. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH AA018016-01 (J.W.E.), du Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), des NIH CA106599 et CA175003 (C.L.), nih CA198249 (K.Y.) et Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Alkaline phosphate, Calf IntestinalNew England BiolabsM0290SDephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAbSanta Cruz Biotechnologyclone H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAbSanta Cruz Biotechnologyclone A-8, sc-13156Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone C-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAbThermo Fisherclone 20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31460Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assayThermo Fisher23223Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015Western blot
Carbenicillin, Disodium SaltThermo Fisher10177012Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterLow speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10Beckman Coulter09U1597Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKLow speed centrifugation
Cu grids with carbon support filmElectron Microscopy SciencesFF200-CuAcquiring electron microscopy images
EcoRINew England BiolabsR0101Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection systemThermo Fisher32106Western blot
FACScalibur flow cytometerBecton DickinsonExamining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serumATCCSCRR-30-2020Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μmThermo Fisher22-363-547Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%)Thermo FisherES006BCulturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kitThermo Fisher88733422Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumThermo Fisher10-829-018Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory FactorThermo FisherESG1106Medium for ES-D3 cells
L-glutamineVWRVWRL0131-0100Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagentThermo Fisher11668019Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XSBioTekDetermining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorterBeckman CoulterIsolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2988JGenerating GM-CSF expression plasmid
NeomycinThermo Fisher10-131-035Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acidsThermo FisherSH3023801Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milkThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher31985062Transfecting ES-D3 cells
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycinVWRsc45000-652Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranesMillipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation KitNew England BiolabsM2200SGenerating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscopeHitachiHT7700Acquiring electron microscopy images
TrypsinVWR45000-660Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHigh speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45TiBeckman Coulter09U4454High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottleBeckman Coulter355622High speed centrifugation
UranyLess staining solutionElectron Microscopy Sciences22409Acquiring electron microscopy images

Références

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
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