JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Это исследование описывает метод выделения из эмбриональных стволовых клеток, обогащенных экзосомами внеклеточных везикул, несущих иммуностимулирующие колониестимулирующие факторы гранулоцитарных макрофагов.

Аннотация

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, способные к самообновлению и дифференцировке во все типы эмбриональных клеток. Как и многие другие типы клеток, ESCs высвобождают небольшие мембранные везикулы, такие как экзосомы, во внеклеточную среду. Экзосомы служат важнейшими медиаторами межклеточной коммуникации и играют основную роль во многих (пато)физиологических процессах. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) функционирует как цитокин для модуляции иммунного ответа. Присутствие GM-CSF в экзосомах может повысить их иммунорегукрепительную функцию. Здесь GM-CSF стабильно переэкспрессировался в мышиной клеточной линии ESC ES-D3. Был разработан протокол для выделения высококачественных экзосомных внеклеточных везикул (EV) из клеток ES-D3, чрезмерно экспрессировающих GM-CSF. Изолированные экзосомные ev были характеризованы различными экспериментальными подходами. Важно отметить, что было обнаружено, что значительное количество GM-CSF присутствует в обогащенных экзосомами EV. В целом, обогащенные ГМ-CSF экзосомами EV из ЭСК могут функционировать как бесклеточные везикулы для осуществления своей иммунорегуляторной деятельности.

Введение

ESCs получены из стадии бластоцисты предимплантационного эмбриона1. Как плюрипотентные стволовые клетки, ESCs обладают способностью самообновляться и дифференцироваться в любой тип эмбриональных клеток. Благодаря своему замечательному потенциалу развития и долгосрочной пролиферативной способности, ЭСЦ чрезвычайно ценны для биомедицинских исследований1. Текущие исследовательские усилия в основном сосредоточены на терапевтическом потенциале ESCs для различных основных патологических расстройств, включая диабет, болезни сердца и нейродегенеративные заболевания2,3,4.

Известно, что клетки млекопитающих, включая ЭСК, высвобождают везикулы с переменными размерами во внеклеточную среду, и эти EV обладают многими физиологическими и патологическими функциями из-за их роли в межклеточной связи5. Среди различных подтипов EV экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы, высвобождаемые из различных типов клеток во внеклеточное пространство при слиянии промежуточных эндоцитарных компартментов, мультивезикулярных тел (MVB), с плазматической мембраной6. Сообщалось, что экзосомы опосредовывают межклеточную коммуникацию и критически участвуют во многих (пато)физиологических процессах7,8. Экзосомы наследуют некоторые биологические функции от своих собственных родительских клеток, потому что экзосомы содержат биологические материалы, полученные из цитозола, включая белки и нуклеиновые кислоты. Таким образом, ассоциированные антигены или факторы, стимулирующие иммунный ответ, специфичный для данного заболевания, инкапсулируются в экзосомах из определенных типов клеток9. Это проложило путь к клиническим испытаниям, изучающим экзосомы, полученные из опухолей, в качестве противораковой вакцины10.

GM-CSF представляет собой цитокин, секретируемый различными типами иммунных клеток11. Новые данные свидетельствуют о том, что GM-CSF активирует и регулирует иммунную систему и играет важную роль в антиген-презентационно-презентационном процессе12. Например, клинический отчет предполагает, что GM-CSF стимулирует иммунный ответ на опухоли в качестве адъюванта вакцины13. Несколько стратегий иммунотерапии рака на основе GM-CSF для использования мощной иммуностимулирующей активности GM-CSF были исследованы в клинических испытаниях14. Среди них противораковая вакцина, состоящая из облученных ГМ-CSF-секреторных опухолевых клеток, показала некоторые перспективы у пациентов с прогрессирующей меланомой, индуцируя клеточные и гуморальные противоопухолевые ответы и последующий некроз в метастазированных опухолях15.

Поскольку экзосомы, полученные из ESCs, обладают аналогичной биологической активностью, что и исходные ESCs, возможно, экзосомы, несущие GM-CSF из ESCs, могут функционировать как бесклеточные везикулы для регулирования иммунного ответа. В данной работе описан подробный способ получения высококачественных обогащенных экзосомами EV из ЭСК, экспрессивующих GM-CSF. Эти обогащенные экзосомами электромобили могут служить иммунорегуляционными везикулами для модуляции иммунного ответа.

протокол

1. Культивирование клеток ES-D3

  1. Для получения фетальной бытовой сыворотки без экзосом (FBS) загрузите FBS в ультрацентрифугу и центрифугу при 100 000 х г в течение 16 ч при 4 °C. После центрифугирования соберите супернатант сыворотки в виде FBS без экзосом для культивирования мышиной клеточной линии ESC ES-D3 и получения обогащенных экзосомами EV.
  2. Перед обшивкой клеток ES-D3 обмойте посуду культурой ткани 15 см желатином (0,1%) при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Следуя ранее описаннойпротоколе 16,культивируйте клетки ES-D3 без питательного слоя клеток в покрытых желатином 15 см тканевых культурных посудах. Среда клеточной культуры ES-D3 состоит из DMEM, FBS без экзосом (15%), несущественных аминокислот (0,1 мМ), L-глутамина (2 мМ), β-меркаптоэтанола (0,1 мМ), пенициллина (50 единиц / мл), стрептомицина (50 мкг / мл) и фактора ингибиции лейкемии (LIF; 100 единиц / мл). Культивирует клетки ES-D3 при 37 °C в 5% увлажненный инкубаторCO2.
  4. Как только клетки ES-D3 достигнут около 90% слияния в 15 см тканевых культурных посудах, удалите среду путем аспирации. Промывайте клетки с помощью трипсина (5 мл; 0,05%). Добавить в посуду трипсин (5 мл) и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Соберите клетки с посуды.
  5. Добавьте свежую культурную среду (5 мл) к собранным клеткам, чтобы инактивировать трипсин. Центрифугировать ячейки при 390 х г в течение 5 мин. Повторно суспендирует клетки в свежей среде и определите количество клеток с помощью гемоцитометра.
  6. Для пассажа клеток нанесите клетки ES-D3 (5 х 106)в желатиновую (0,1%) 15 см чашку для культивирования тканей свежей средой (15 мл) и культивируем в течение 3 дней перед субкультурация клеток.
  7. Чтобы собрать супернатант клеточной культуры для выделения обогащенных экзосомами EV, обложите клетки ES-D3 (1 х 107)в покрытую желатином (0,1%) 15 см чашку для культуры тканей со свежей средой (15 мл) в течение 3 дней до сбора супернатанта клеточной культуры.

2. Генерация плазмиды экспрессии GM-CSF

ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация трансфекционной плазмиды pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP для сверхэкспрессии GM-CSF в клетках ES-D3. В этой плазмиде экспрессия мышиной ГМ-CSF кДНК вместе с маркерным белком гуманизированным Renilla reniformis GFP (hrGFP) обусловлена фактором удлинения полипептидной цепи человека 1α (EF1α)промотором 17,18.

  1. Сгенерируйте векторную магистраль.
    1. Переваривайте плазмиду pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 мкг ДНК) с помощью фермента рестрикции EcoRI (100 единиц) при 37 °C в течение 2 ч для генерации двух фрагментов ДНК: векторной магистрали (6,0 кб) и вставки FD3ER (2,5 кб).
    2. Переложить 50% переваренной плазмидной ДНК (10 мкг) в одну микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и обработать щелочной фосфатазой (20 единиц) при 37 °C в течение 1 ч. Рецируются как необработанная, так и дефосфорилированная ДНК с помощью электрофореза агарозного геля (2%).
    3. Очистите векторные фрагменты ДНК позвоночника (6,0 кб) с помощью набора для экстракции ДНК-геля. В то время как необработанная векторная основа будет служить пустым вектором (pEF1α-IRES-hrGFP), дефосфорилированная векторная основа будет использоваться для генерации GM-CSF-экспрессирующей плазмиды (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
  2. Сгенерируйте вставку кДНК GM-CSF.
    1. Переваривайте плазмиду pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 мкг) с помощью фермента рестрикции EcoRI (100 единиц) при 37 °C в течение 2 ч для получения двух фрагментов ДНК: векторной основы (6,5 кб) и мышиной вставки гм-ликвора кДНК (474 бп).
    2. Рассасывать переваренные ДНК с помощью электрофореза агарозного геля (2%). Очистите фрагмент кДНК GM-CSF в мыщах (474 bp) с помощью набора для экстракции ДНК-геля.
  3. Генерация экспрессии плазмид.
    1. Настройте 2 реакции лигирования (общий объем 10 мкл) с помощью набора для лигирования ДНК.
      1. Чтобы сгенерировать пустой вектор pEF1α-IRES-hrGFP, сложи необработанный векторный костяк с шага 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).
      2. Для генерации pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP сшифруйте следующие фрагменты ДНК: (1) дефосфорилированную векторную основу с шага 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) и (2) фрагмент кДНК mGM-CSF, сгенерированный на шаге 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
    2. Лигат при 25 °C в течение 5 мин. Преобразование лигированной ДНК в DH5α-компетентные клетки E. coli. Накладываем преобразованные клетки E. coli на пластины LB-агара, содержащие карбенициллин (50 мкг/мл).
    3. Очищайте плазмиды от одиночных колоний E. coli с помощью набора для изоляции ДНК. Проверка идентичности плазмид путем секвенирования ДНК.

3. Генерация клеток ES-D3, чрезмерно экспрессивных GM-CSF

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфектировать клетки ES-D3 плазмидой pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP для сверхэкспрессии GM-CS. Котрансфектировать плазмиду pBabe-Neo в клетки ES-D3 для облегчения отбора стабильно трансфектированных клеток18,20.

  1. Трансфектирует плазмиды в клетки ES-D3.
    1. Выкладываем клетки ES-D3 (1,4 х 106)в желатиновую (0,1%) 10 см тканевую культурную чашку с культурной средой (10 мл) для трансфекции. Культивируется покрывая клетками ES-D3 при 37 °C в течение 24 ч.
    2. Готовят две плазмидные смеси в микроцентрифужных пробирках по 1,5 мл: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 мкг, контроль векторов) с pBabe-Neo (4 мкг) и (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 мкг, экспрессирующий GM-CSF) с pBabe-Neo (4 мкг). Проводите трансфекцию с помощью трансфекционного комплекта в соответствии с протоколом производителя.
    3. Добавляют трансфекционную среду (1 мл) и трансфекционный реагент (64 мкл) в каждую трубку, содержащую плазмидные смеси, и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    4. Добавьте трансфекционные смеси в соответствующие 10 см тарелки из клеток ES-D3. Инкубировать при 37 °C в течение 5 ч.
    5. Заменить среду в 10 см посуде свежей питательной средой (10 мл). Инкубировать при 37 °C в течение 24 ч.
  2. Генерировать объемные популяции стабильно трансфекированных клеток ES-D3.
    1. Удалите среду из трансфекированных клеток ES-D3. Промыть клетки трипсином (2 мл; 0,05%). Добавьте трипсин (2 мл) и инкубируют при 37 °C в течение 5 мин. Переложите клетки в 15 мл центрифужную трубку и добавьте 2 мл свежей питательной среды для нейтрализации трипсина. Центрифуга при 390 х г в течение 5 мин.
    2. Повторно суспендирует трансфекцию клеток в свежей питательной среде (10 мл). Оцените интенсивность флуоресценции GFP в трансфекированных ячейках ES-D3 с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) в соответствии с протоколом производителя.
    3. Переложите трансфектированные клетки в две 10 см посуды, содержащие свежую питательную среду (10 мл). Добавьте неомицин (0,5 мг/мл) для устранения нетрансферазированных клеток.
    4. Продолжают культивирование трансфефедированных клеток в культуральная среда, содержащая неомицин (0,5 мг/мл). Когда трансфектированные ES-D3 достигнут 90% конфюентности, снова переложите клетки на 15 см тканевую культуру посуды. Повторяют процедуру в течение 2 недель.
  3. Генерация клонов стабильно трансфекированных клеток ES-D3.
    1. Как только будут сформированы массовые популяции стабильно трансфекированных клеток ES-D3, соберите клетки, как и раньше. Определите номера клеток с помощью гемоцитометра. Центрифугировать ячейки при 390 х г в течение 5 мин. Повторное суспендирование клеток (1 х 107 клеток/мл) в свежей питательной среде.
    2. Фильтруйте клетки через стерильный клеточный сетчатый фильтр 40 мкм. Очищайте GFP-положительные ячейки ES-D3 с помощью FACS, следуя протоколу производителя.
    3. Поместить одну отсортированную клетку ES-D3 в одну скважину желатиновой (0,1%) 96-скважинной тканевой культурной пластины, содержащей родительские клетки ES-D3 (1 x 103)в среде, свободной от неомицина (200 мкл). Совместное культивирование трансфектированных клеток ES-D3 с их нетрансфектными родительскими аналогами гарантирует, что стабильно трансфектированные одиночные клетки ES-D3 выживают и размножаются как один клон.
    4. Культивировать клетки в течение 48 ч, а затем добавлять неомицин (0,5 мг/мл) в 96-щеточные пластины для устранения нетрансфексированных родительских клеток ES-D3.
    5. Продолжают культивирование GFP-положительных ES-D3 клеток в 96-скважинных тканевых культурных пластинах со средой, содержащей неомицин (0,5 мг/мл) в течение 1 недели. Перенос клональных клеточных линий ES-D3 в покрытые желатином (0,1%) 6 см блюда для посева тканей с культуральной средой (5 мл), содержащей неомицин (0,5 мг/мл) в течение 1 недели.
    6. Определите интенсивность флуоресценции GFP в каждом из трансфекированных клонов клеток ES-D3 с помощью FACS, следуя протоколу производителя. Выберите клоны ES-D3, выражающие либо GM-CSF, либо пустой вектор с высоким уровнем зеленой флуоресценции.
    7. Определите количество GM-CSF, секретируемого клетками ES-D3, используя мышиный набор GM-CSF ELISA, следуя протоколу производителя.

4. Выделение экзосомных внеклеточных везикул

  1. Культивирование клеток ES-D3 (1 х 107)в 15 см тканевых культурных посудах в течение 72 ч при 37 °C. Соберите супернатант клеточной культуры. Хранить собранный супернатант при 4 °C до 1 недели для поддержания экзосомальной целостности.
  2. Центрифугируют супернатант клеточной культуры при 5000 х г в течение 60 мин при 4 °C с помощью центрифуги для осаждения крупных фрагментов клеток.
  3. Соберите супернатант и центрифугу при 100 000 х г в течение 90 мин при 4 °C с помощью ультрацентрифуги.
  4. Удалите супернатант. Осторожно промыть каждую гранулу дважды фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS; 1 мл) для удаления остаточного супернатанта культуры.
  5. Повторно суспендирует каждую гранулу в PBS. Количественная оценка обогащенных экзосомами EV по содержанию белка5.
    1. Измерьте концентрацию белка в обогащенных экзосомами EV с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA). Ожидаемый выход обогащенных экзосомами EV из клеток ES-D3 составляет приблизительно 4 мкг белка/мл супернатанта клеточной культуры. Ресуспендированных экзосомами EV в PBS (концентрация белка: ~6 мкг/мкл). Храните обогащенные экзосомами электромобили при -80 °C.

5. Характеристика экзосомных внеклеточных везикул методом просвечивательной электронной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Исследовать состав и структуру обогащенных экзосомами EV, выделенных из ЭСК, с помощью просвечивающих электронных микроскопий(ТЭМ)5.

  1. Фиксируют обогащенные экзосомами EV (3-5 мкг/мкл) конечной концентрацией 2% параформальдегида ЭМ-класса при комнатной температуре в течение 2 ч.
  2. Загрузите фиксированные образцы (10 мкл) на медные решетки с углеродной поддерживающей пленкой. Инкубируют образцы медными сетками в течение 1 мин, а затем сливают сетки фильтровальной бумагой.
  3. Окрашивают сетки окрашивающим раствором по протоколу производителя.
  4. Переложите сетки на лист фильтровальной бумаги с помощью пинцетса. Дайте сеткам высохнуть ночью при комнатной температуре.
  5. Получение изображений электронной микроскопии с помощью просвечивающих электронных микроскопов (увеличение 50 000x) в соответствии с протоколом производителя.

6. Оценка экзосомных внеклеточных везикул методом вестерн-блот-анализа

  1. Приготовьте экстракты цельных клеток.
    1. Удалите среду из клеток ES-D3, культивированных в посуде по 15 см. Промыть клетки трипсином (5 мл; 0,05%). Добавьте трипсин (5 мл) в клетки. Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Соберите клетки и добавьте свежую культурную среду (5 мл) для нейтрализации трипсина. Центрифугировать ячейки при 390 х г в течение 5 мин. Повторное суспендирование ячеек в PBS.
    2. Определите количество клеток с помощью гемоцитометра. Центрифугировать ячейки снова при 390 х г в течение 5 мин. Повторное суспендирование ячеек в буфере загрузки SDS-PAGE, содержащем 0,5% SDS (5 000 ячеек/мкл).
    3. Облицовка образцов ультразвуком в течение 10 с помощью ультразвукового аппарата с амплитудой 10% (мощность: 500 Вт; ультразвуковая частота: 20 кГц). Нагревать образцы при 100 °C в течение 5 мин.
  2. Приготовьте лизаты обогащенных экзосомами электромобилей.
    1. Повторное суспендирование обогащенных экзосомами EV в буфере загрузки SDS-PAGE, содержащем 0,5% SDS в концентрации 1,2 мкг/мкл.
    2. Облицовка образцов ультразвуком в течение 10 с помощью ультразвукового аппарата с амплитудой 10% (мощность: 500 Вт; ультразвуковая частота: 20 кГц). Нагревать образцы при 100 °C в течение 5 мин.
  3. Обнаружение белков с помощью вестерн-блотта.
    1. Экстракты целых клеток нагрузки (10 мкл; 5000 клеток/мкл) и обогащенные экзосомами ЛИЗАТЫ ЭВ (10 мкл; 1,2 мкг/мкл) попадают в каждую скважину геля Bis-Tris PAGE (4-20%). Перенос белков на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF).
    2. Инкубировать мембраны с соответствующими первичными и вторичными антителами. Разбавляют антитела (в концентрациях, указанных ниже) в промокательном буфере, содержащем PBS, Tween-20 (0,2%) и ожиренное сухое молоко (10% мас./об.).
      1. Используйте следующие первичные антитела: анти-Аннексин V (200 нг/мл), анти-CD81 (50 нг/мл), анти-Флотиллин-1 (200 нг/мл), антицитохром c (100 нг/мл), антибелокдисульфид изомераза (200 нг/мл), анти-GAPDH (33 нг/мл) и анти-Оксфос COX IV-субъединица IV (600 нг/мл).
      2. Используйте следующие вторичные антитела: пероксидаза-конъюгированная козья анти-кролик IgG (20 нг/мл) и пероксидаза-конъюгированная козья антимышка IgG (20 нг/мл).
    3. Обнаружение белков с помощью усовершенствованной установки для детектирования хемилюминесценции.

7. Определение концентраций GM-CSF во внеклеточных везикулах, обогащенных экзосомами, с помощью ИФА

ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените количества GM-CSF в обогащенных экзосомами EV с помощью ИФА с использованием набора для мышиного GM-CSF в соответствии с протоколом производителя с некоторыми изменениями.

  1. Покрывайте пластину ИФА захватным антителом. Обрабатывайте обогащенные экзосомами ЭЛЕКТРОМОБИЛИ (0,6 мкг) только в PBS или PBS + 0,05% Tween-20 (100 мкл) при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавьте обработанные образцы в ИФА-пластину с покрытием и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч. Вымойте тарелку только PBS или PBS + 0,05% Tween-20.
  2. Добавьте к образцам антитела обнаружения. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч. Вымойте тарелку только PBS или PBS + 0,05% Tween-20. Добавьте avidin-HRP в образцы. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Вымойте тарелку только PBS или PBS + 0,05% Tween-20.
  3. Определение концентраций GM-CSF в обогащенных экзосомами EV путем измерения поглощения при 450 нм на считывателе микропластин.

Результаты

GM-CSF чрезмерно экспрессируется в мышиных ESCs.
Чтобы стабильно сверхэкспрессировать GM-CSF в клетках ES-D3, мышиную ГМ-ликворную кДНК клонировали в трансфекционный вектор для генерации вектора экспрессии pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(рисунок 1A). GM-CSF был ч...

Обсуждение

Это исследование показывает высокоэффективный метод производства обогащенных экзосомами EV, несущих иммуностимулирующий белок GM-CSF, который может быть использован для изучения иммуномодулирующих эффектов обогащенных экзосомами EV. Несколько исследований показывают, что экзосомы про?...

Раскрытие информации

Кавита Ядданапуди, Чи Ли и Джон У. Итон подали заявку на патент США «Композиции, содержащие инженерные экзосомы, полученные из эмбриональных стволовых клеток, и способы их использования».

Благодарности

Мы благодарны г-ну Аркадиузу Слюсарчику и Сети биомедицинских исследований Кентукки (KBRIN, P20GM103436) за получение изображений просвечивающих электронных микроскопов. Эта работа была частично поддержана грантами NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 и CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) и Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Alkaline phosphate, Calf IntestinalNew England BiolabsM0290SDephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAbSanta Cruz Biotechnologyclone H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAbSanta Cruz Biotechnologyclone A-8, sc-13156Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone C-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAbThermo Fisherclone 20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31460Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assayThermo Fisher23223Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015Western blot
Carbenicillin, Disodium SaltThermo Fisher10177012Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterLow speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10Beckman Coulter09U1597Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKLow speed centrifugation
Cu grids with carbon support filmElectron Microscopy SciencesFF200-CuAcquiring electron microscopy images
EcoRINew England BiolabsR0101Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection systemThermo Fisher32106Western blot
FACScalibur flow cytometerBecton DickinsonExamining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serumATCCSCRR-30-2020Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μmThermo Fisher22-363-547Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%)Thermo FisherES006BCulturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kitThermo Fisher88733422Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumThermo Fisher10-829-018Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory FactorThermo FisherESG1106Medium for ES-D3 cells
L-glutamineVWRVWRL0131-0100Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagentThermo Fisher11668019Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XSBioTekDetermining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorterBeckman CoulterIsolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2988JGenerating GM-CSF expression plasmid
NeomycinThermo Fisher10-131-035Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acidsThermo FisherSH3023801Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milkThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher31985062Transfecting ES-D3 cells
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycinVWRsc45000-652Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranesMillipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation KitNew England BiolabsM2200SGenerating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscopeHitachiHT7700Acquiring electron microscopy images
TrypsinVWR45000-660Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHigh speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45TiBeckman Coulter09U4454High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottleBeckman Coulter355622High speed centrifugation
UranyLess staining solutionElectron Microscopy Sciences22409Acquiring electron microscopy images

Ссылки

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?. Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?. PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

177GM CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены