أصابه الفئران مع Malassezia spp. لدراسة التفاعل بين الفطريات والمضيف

Summary

هذا البروتوكول يحدد إنشاء نموذج الماوس لدراسة Malassezia-التفاعلات المضيف في الجلد. وهو يصف زراعه malassezia في المختبر ، والعدوى من الجلد murine مع malassezia، والتحليل اللاحق للالتهاب والعبء الفطري في انسجه الجلد.

Abstract

نماذج الحيوانية هي حاسمه للبحوث الامراض المعدية. وهي توفر أساسا هاما لتحليل الطيف الكامل للتفاعلات التي تحدث بين الميكروبات ومضيفها في الجسم المجري بطريقه خاصه بالانسجه. ويتزايد الاعتراف الفطريات المسببة للامراض باعتبارها تهديدا خطيرا للبشر واستغلال مثل هذه النماذج العدوى تحسنت إلى حد كبير فهمنا للامراضيه الفطرية. أنواع من جنس Malassezia هي الفطريات الأكثر وفره من الكائنات المجهرية الجلد البشري وانها ترتبط أيضا مع تطور اضطرابات جلديه التهابيه شديده مثل التهاب الجلد الدهني والتهاب الجلد التاتبي. ومع ذلك ، لا تزال العلاقة السببية بين malassezia والامراض المرضية غير معروفه ، وهي الحقيقة التي يمكن ان تعزي إلى المعرفة السيئة من الساق المعقدة من malassezia مع الجهاز المناعي الجلد. يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج الماوس التجريبية التي تسمح بدراسة تفاعل Malassezia مع الجلد الثدييات في الجسم الخارجي. فانه يحدد طريقه لزراعه Malassezia spp. في ظل الظروف المختبرية ، وكيفيه أصابه الجلد murine مع malassezia spp. وكيفيه تقييم نتيجة العدوى عن طريق التهاب الجلد وتحليلات عبء الفطرية. النموذج الموصوف هنا يعمل في الحيوانية المناعية تماما ولا يعتمد علي المعالجة المناعية أو المعالجة بالمضادات الحيوية للحيوانات. وعلاوة علي ذلك قابله للتكيف مع جميع سلالات الماوس المعدلة وراثيا تقريبا ويمكن الجمع بينها وبين نماذج أخرى للامراض الجلدية. هذه الميزات تجعل هذا النموذج العدوى أداه قويه جدا للدراسة بالتفصيل استجابه المناعية الفطرية والمتكيفة للمضيف ضد Malassezia في الجلد في الجسم المجري.

Introduction

يتم ملء الجلد من قبل العديد من الميكروبات المختلفة. التعرض المستمر للجلد إلى الجراثيم يساهم في تشكيل وتثقيف الجهاز المناعي للمضيف. ويتزايد الاعتراف بالفطريات كجزء حيوي من الجراثيم وانها تفي بدور هام لفسيولوجيا المضيف والحصانة, مماثله للبكتيريا والفيروسات¹. الأنواع من جنس malassezia هي إلى حد بعيد الفطريات الأكثر وفره استعمار الجلد من الفقاريات ذوات الدم الحار وانها تشكل لأكثر من 90 ٪ من الجلد البشري المتفيسوم^2،3. وقد تم حتى الآن تحديد ثمانيه عشر نوعا مختلفا من Malassezia من الجلد البشري والحيواني⁴.

ويعتقد ان الامراض المختلفة للجلد تنشا ، علي الأقل جزئيا ، نتيجة لتركيب الجراثيم الدقيقة ديستوازن. قد يؤدي ديسبيوسيس إلى فرط نمو الأنواع مع المحتملة المسببة للامراض مما يؤدي إلى العدوى الانتهازية والمرض⁵. باستمرار ، هناك أدله متزايدة علي ان Malassezia، بالاضافه إلى نمط الحياة المعلقة ، ويسهم في تطوير مختلف الامراض الجلدية ، بدءا من القشرة والمبرقشة فيرسيكولور إلى اضطرابات التهابيه أكثر شده مثل كما التهاب الجلد الدهني والتهاب الجلد التاتبي^4،6. في حين تم تاسيس العلاقة السببية بين Malassezia والمبرقشة فيرسيكولور ، فان الدور الفسيولوجي للفطريات في امراض الجلد الأكثر شده لا يزال غير معروف إلى حد كبير.

تحديد دور Malassezia في التوازن الجلد والمرض يستدعي المزيد من المعرفة المتعمقة حول تفاعل الفطريات مع الجلد والجهاز المناعي الجلدي. من الملاحظة ، والبحوث علي Malassezia هو ، بالمقارنة مع غيرها من مسببات الامراض الفطرية البشرية (علي سبيل المثال ، المبيضات الbicans أو التبخير الرشاشيات) ، لا يزال في مرحله الوليدة. ويمكن ان يعزي هذا إلى صعوبة في زراعه Malassezia تحت الظروف المختبرية وعدم وجود نماذج تجريبية مناسبه لدراسة الفطريات في اتصال مع المضيف في الجسم المجري. التجارب السابقة مع الخلايا المعزولة في الثقافة أشارت إلى مجموعه واسعه من التفاعلات المباشرة وغير المباشرة بين Malassezia ومختلف الخلايا المناعية وغير المناعية⁷. ومع ذلك ، هذه التجارب في المختبر فقط يلخص جزئيا حاله بيئة الجلد المعقدة في الجسم الذي يحدث فيه العديد من الاحداث الخلوية والجزيئية بشكل متزامن بين الفطريات وأنواع الخلايا المختلفة.

هنا ، ونحن الخطوط العريضة للبروتوكول لنموذج تجريبي من العدوى Malassezia الجلد في الفئران ، والتي انشانا مؤخرا ، لدراسة الفطريات-التفاعل المضيف في الجسم الخارجي⁷. وهذا يشمل إجراءات (1) الزراعة الناجحة لل malassezia في المختبر ، (2) تطبيق وخز من malassezia علي جلد الاذن murine ، و (3) التفاصيل التقنية لكيفيه تحليل الجلد المستحث malassezia التهاب والعبء الفطري للجلد المصاب. الأهم من ذلك ، هذا النموذج لا يعتمد علي كبت المناعة (علي سبيل المثال ، بواسطة الكورتيكوستيرويدات) أو العلاج بالمضادات الحيوية للفئران قبل العدوى ، كما انه يمارس في نماذج الماوس الأخرى من العدوى الفطرية^8،9. المقابل ، فانه يسمح بدراسة الطيف الكامل للاستجابة المناعية الفطرية والمتكيفة ضد الملاسزيا في الجلد الطبيعي. من الملاحظة ، الفئران نوع البرية التي يتم الاحتفاظ بها تحت ظروف محدده خاليه من العوامل الممرضة (SPF) ليست مستعمره بطبيعة الحال مع Malassezia ، التالي ، تعرضها للفطريات لا يؤدي إلى الاستعمار المستمر ولكن يتم مسح من المضيف داخل حوالي 1.5 أسابيع. ومع ذلك ، فان النموذج يسمح لدراسة أليات لمكافحه الإيدز المضيف البدء والتنظيم الذي ، بدوره ، هو أساس كيفيه توليد الذاكرة المناعية. النموذج هو تنوعا في انه يمكن بسهوله تطبيقها علي مجموعه واسعه من سلالات الماوس المعدلة وراثيا ، ويمكن الجمع بينها مع غيرها من نماذج الامراض الجلدية القائمة ، مثل نماذج من نقص الحاجز ، لدراسة تاثير Malassezia تحت الامراض الجلدية المرضية والتهابات⁷. ولذلك ، فان النموذج الموصوف من العدوى الجلدية Malassezia التجريبية في الفئران يوفر درجه عاليه من المرونة للتحقيق في تفاعل الفطريات مع الجهاز المناعي الجلد في سياق التوازن والمرض.

يصف هذا البروتوكول العدوى الجلدية التجريبية للفئران مع Malassezia spp. ونظرا لإمكاناتها المسببة للامراض ، تصنف malassezia SPP علي انها BSL2 مسببات الامراض في بعض البلدان ، بما في ذلك سويسرا. يرجى التحقق من المبادئ التوجيهية المحلية واتباع اللوائح من قبل السلطات المحلية. وينبغي التعامل مع الكائنات BSL2 المصنفة من قبل موظفين مدربين في اطار مجلس السلامة البيولوجية BSL2 المعتمدة (BSC). وينبغي ان تكون النفايات البيولوجية الملوثة بالكائنات الحية المصنفة BSL2 ، وكذلك الجثث التي تصيب الفئران المصابة بهذه الكائنات ، معقمه قبل التخلص منها. لاجراء تجارب مع الفئران ، ينبغي بذل كل الجهود للتقليل من المعاناة وضمان اعلي المعايير الاخلاقيه والانسانيه وفقا لمبادئ 3R (استبدال ، صقل ، خفض)¹⁰. وأجريت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول مع باتشيديرماتيس (atcc 14522) ، m. نخاله (atcc 14521) و m. سمبوديليس (atcc 42132)⁷.

Protocol

وقد نفذت جميع الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول وفقا للمرسوم المتعلق بمناوله الكائنات الحية في النظم الواردة في المكتب الاتحادي للبيئة ، سويسرا (www.bafu.admin.ch). وأجريت تجارب الفئران بما يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية لقانون حماية الماشية السويسرية وأجريت ببموجب البروتوكولات التي وافق عليها المكتب البيطري لكانتون زيورخ ، سويسرا (رقم الترخيص 168/2018).

1-زراعه الملاسزيا تحت الظروف المختبرية

ملاحظه: تخزين جميع الكواشف ووسائل الاعلام المستخدمة لهذا البروتوكول في درجه حرارة الغرفة (RT ، 20-25 درجه مئوية) ما لم يذكر خلاف ذلك ، وانخفاض درجه الحرارة يمكن ان تمنع نمو الفطريات.

1. اعداد السائل المعدلة ديكسون (mDixon) المتوسطة للنمو Malassezia . لاعداد 500 مل من السائل mDixon المتوسطة ، تذوب 18 غرام استخراج الشعير ، 10 غرام المجففة الثور الصفراء ، 5 مل توين-40 ، 3 غرام Peptone ، 1 مل الجلسرين و 1 مل حمض الاوليك في 500 mL المقطر H₂o (dH₂o). ضبط المتوسطة إلى الأس الهيدروجيني 6 مع HCl والاوتوكلاف. تخزين الوسيطة في RT.
2. اعداد لوحات الاجار mDixon عن طريق أضافه 7.5 g أجار إلى 500 mL mDixon المتوسطة قبل التعقيم. تهدئه ببطء أجار mDixon بعد التعقيم باستخدام شريط التوجيه ولوحه التسخين المغناطيسي لتجنب التصلب الجزئي من المتوسطة في حين تهدئه.
3. مره واحده وقد يبرد أجار وصولا إلى 50-60 درجه مئوية ، والاستغناء عن السائل في اطباق بيتري في غطاء المحرك الرقائقي تدفق والسماح لهم تجف في RT بين عشيه وضحيها.
   ملاحظه: يمكن تخزين لوحات أجار في 4 درجه مئوية لعده أسابيع عندما ملفوفه وابقي راسا علي عقب لتجنب التبخر.
4. الحصول علي العزلات malassezia واحياء المخزونات بالتجميد من malassezia وفقا للتعليمات التي حصل عليها مقدم الخدمة.
5. تطعيم 10 مل من السائل mDixon المتوسطة في قارورة معقمه 100 mL Erlenmeyer مع احياء التعليق Malassezia وفقا للتعليمات التي حصل عليها مقدم الخدمة. احتضان الثقافة في حاضنه تهتز في 30 درجه مئوية و 180 لفه في الدقيقة.
6. فحص نمو الثقافة Malassezia بانتظام عن طريق التحقق من ظهور لون كريم والتعكر. حركيه النمو تعتمد علي الأنواع وسلاله من malassezia وقد تكون بطيئه بشكل خاص عندما يتم احياء malassezia طازجه من المخزون المجفف بالتجميد. (الشكل 1ا).
7. اعداد الأسهم الجلسرين عن طريق خلط 3 أجزاء من الثقافة Malassezia نمت بكثافة في mdixon المتوسطة مع 1 جزء من الجلسرين 99 ٪ العقيمة. Aliquot الخليط Malassezia/الجلسرين في أنابيب معقمه المسمار الغطاء وتخزين في-80 درجه مئوية.
8. للانتشار في المختبر ، لوحه Malassezia من الثقافة السائلة في mdixon أو من الأسهم المجمدة الجلسرين علي لوحه أجار mdixon (جلبت إلى RT من 4 درجه مئوية) باستخدام حلقه التلقيح.
   ملاحظه: نقل لوحات أجار mDixon إلى RT من 4 درجه مئوية قبل الاستخدام ، منذ أجار mDixon الباردة يمنع نمو الفطريات.
9. احتضان لوحه أجار (ق) مع Malassezia راسا علي عقب في حاضنه (عدم الاهتزاز) في 30 درجه مئوية. تفقد نمو المستعمرات Malassezia بانتظام.
   ملاحظه: المستعمرات Malassezia علي لوحات الاجار mdixon تظهر في غضون 3-5 يوما وهي كريم اللون مملة ، علي نحو سلس مع ارتفاع محدب (الشكل 1ب).
10. تخزين المستعمرات Malassezia علي لوحات الاجار MDIXON في RT ل ~ 2 أسابيع. وبعد ذلك ، واعداد لوحه أجار mDixon جديده من خلال ينثر Malassezia من الأسهم المجمدة الجلسرين كما هو موضح في 1.7.

2. اعداد الاصابه بعدوي الفئران التجريبية

1. تطعيم 10 مل من السائل mDixon المتوسطة في قارورة معقمه 100 mL Erlenmeyer مع 3-5 المستعمرات Malassezia الفردية من لوحه أجار mdixon (انظر الخطوة 1 ، الشكل 1ب).
2. احتضان الثقافة Malassezia ل ~ 48 إلى 96 ح في 30 درجه مئوية و 180 دوره في الدقيقة حتى الثقافة هي كريم اللون وعكر (الشكل 1ا).
   ملاحظه: الوقت اللازم للنمو malassezia يعتمد علي الأنواع malassezia وسلاله وكميه من الفطريات المستخدمة للتلقيح.
3. نقل 2 مل من الثقافة Malassezia إلى العقيمة 2 مل أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي لمده 1 دقيقه في 10 ، 000 x ز.
4. تجاهل ماده طافي وغسل بيليه عن طريق تعليقه في 1 مل من محلول الملح الفوسفات مخزنه (تلفزيوني). الطرد المركزي مره أخرى لمده 1 دقيقه في 10 ، 000 x ز.
5. بعد الغسيل ، وتعليق بيليه في 1 مل من تلفزيوني بواسطة الأنابيب قويه وقياس الكثافة البصرية للحل في 600 nm (OD_A600) باستخدام مطياف. تمييع التعليق Malassezia 20-50 x مع تلفزيوني لقياس OD لضمان ان القراءة بين 0.1 و 1.
   ملاحظه: كثافة الثقافة 3 أيام من malassezia عموما يختلف بين 15 و 30 OD_A600، اعتمادا علي الأنواع malassezia وسلاله وعلي عدد من خلايا الخميرة المستخدمة لتلقيح الثقافة (الخطوة 2.1). Malassezia يميل إلى تشكيل المجاميع ، التالي ، التنضيد القوي ضروري لضمان تجانس التعليق.
6. Aliquot حجم التعليق Malassezia في الاذاعه التلفزيونية التي تتوافق مع كثافة من 4 OD_A600 إلى أنبوب معقم 2 مل. اعداد 1 أنبوب لكل الحيوانية للاصابه.
7. الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي علي Malassezia لمده 1 دقيقه في 10 ، 000 x ز.
8. تجاهل ماده طافي وتعليق malassezia بيليه في 200 ميكرولتر من زيت الزيتون الأصلي (المقابلة 2 OD_A600 خلايا الخميرة/100 ميكرولتر زيت الزيتون).
   ملاحظه: تم العثور علي زيت الزيتون لتكون وسيله جيده للعدوى وخز مع malassezia، كما malassezia هو الخميرة الدهنية والتي تعتمد علي الدهن. يتم امتصاص زيت الزيتون بشكل أفضل من قبل الجلد من الاذاعه التلفزيونية. ومع ذلك ، يجب ان تدرك انه ليس من السهل تعليق Malassezia في زيت الزيتون. تحسين Malassezia/تعليق زيت الزيتون من قبل vortexing. الحفاظ علي تعليق في RT حتى يتم استخدامه للعدوى.
9. اعداد أنابيب مع زيت الزيتون وحدها للعدوى وهميه من السيطرة علي الماشية.

3. أصابه الفئران مع Malassezia

1. تامر الإناث C57BL/6 الفئران في سن 6-8 أسابيع والسماح لهم التاقلم في منشاه الحيوانية التجريبية لمده أسبوع واحد علي الأقل. حساب 3-5 الفئران لكل مجموعه ، بما في ذلك مجموعه التحكم غير المصابة.
2. اعداد كوكتيل التخدير العقيمة التي تحتوي علي 1.3 ملغ/مل اكسيليازين و 6.5 ملغ/مل الكيتامين في الاذاعه التلفزيونية. 5 مل من الكوكتيل المخدر يكفي لتخدير 20 الحيوانية. ضبط حجم الكوكتيل وفقا لعدد من الكائنات التي يتم تخديرها.
   1. تخدير الماشية عن طريق حقن 10 μL/g وزن الجسم من كوكتيل مخدر داخل الصفاق (المقابلة 65 ملغ الكيتامين و 13 ملغ اكسيليازين لكل كيلوغرام من وزن الجسم) ووضع المخدرات التخدير علي وساده التدفئة في 37 درجه مئوية.
      ملاحظه: في الجرعة المشار اليها ، وعاده ما تبقي الكائنات التخدير لمده ~ 30-60 دقيقه.
3. التحقق من ردود الفعل عن طريق معسر القدم الخلفية مع ملقط للتاكد من ان الكائنات تخدير كامل.
4. ضعي كريم العين علي العينين لمنع الجفاف اثناء التخدير.
5. اختياريا ، قياس سمك الاذن من كلا الاذنين باستخدام الفرجار (0-5 mm نطاق). قياس اثنين من مناطق مختلفه من كل اذن وحساب متوسط سمك الاذن في الاذن.
   ملاحظه: قياس سماكه الاذن هو اختياري ويعتمد علي سؤال البحث. ومع ذلك ، إذا كان سمك الاذن يستخدم كقراءات للتهاب الجلد ، فمن الضروري قياس سمك الاذن الأساسي قبل العدوى. (انظر الخطوة 4).
6. بشكل اختياري ، تعطيل حاجز البشرة من جلد الاذن الظهرية عن طريق تجريد شريط خفيف: يدويا تطبيق قطعه صغيره من الشريط علي الجلد وأزاله مره أخرى. كرر لمده 5 جولات متتالية باستخدام قطعه جديده من الشريط لكل جولة.
   ملاحظه: Malassezia يحفز التهاب الجلد أكثر وضوحا في الجلد تعطل الحاجز مقارنه مع الجلد غير المضطربة (الشكل 2ا)⁷.
7. يطبق موضعيا 100 μL (2 OD_A600) من التعليق الخاص بزيت الملاسزيا/الزيتون علي الجانب الظهري من كل اذن باستخدام ماصه معقمه. وتشمل مجموعه التحكم من الكائنات التي يتم التعامل مع زيت الزيتون فقط (مجموعه التحكم المركبة المعالجة).
   ملاحظه: دوامه التعليق malassezia/زيت الزيتون بقوة لضمان التعليق malassezia متجانسة مباشره قبل التطبيق.
8. ترك الكائنات التخدير علي وساده التدفئة لتجنب انخفاض حرارة الجسم حتى تظهر علامات الانتعاش (حركه الخفق ، وزيادة معدل التنفس ، وما إلى ذلك).
9. حقن 200 μl من محلول الجلوكوز المعقمة وقبل الحرارة 2 ٪ جلد إلى حظيرة القفويه لدعم الأيض والاماهه.
   ملاحظه: لاعداد محلول الجلوكوز 2 ٪ معقمه ، حل 1 ملغ الجلوكوز في 50 mL التلفزيونية وتصفيتها باستخدام فلتر 0.2 μm. يمكن تخزين الحل في 4 درجه مئوية.
10. نقل الماشية إلى قفصهم.

4. تحليل التهابات الجلدية الناجمة عن مالاسسيزيا

ملاحظه: هذا الاجراء يصف تحليل Malassezia-الناجمة عن تورم الاذن اثناء العدوى التي تعمل كمعلمه من التهاب الجلد. ومن الشروط الاساسيه لتحليل تورم الاذن الناجم عن الفطريات قياس سمك الاذن الأساسي قبل تجريد الشريط و/أو العدوى (الخطوة 3.5).

1. اعداد غرفه ايزوفلواني للتخدير علي المدى القصير من Malassezia-المصابة والسيطرة علي الماشية.
2. نقل أحد الحيوانية في وقت واحد إلى الغرفة وانتظر الحيوانية ليتم تخديرها بالبالكامل.
   ملاحظه: تتضمن علامات التخدير السليم استرخاء كامل للجسم بالاضافه إلى التنفس البطيء والثقيل (الجنب). مراقبه التخدير بعناية كما التعرض الموسعة ايزوفلواني يمكن ان تكون مميته.
3. أزاله الحيوانية من الغرفة ووضعها علي الانسجه.
4. قياس سماكه الاذن (ق) باستخدام الفرجار (مجموعه 0-5 mm). قياس اثنين من مناطق مختلفه من كل اذن وحساب متوسط سمك في الاذن (انظر الخطوة 3.5).
5. نقل الحيوانية مره أخرى إلى القفص.
   ملاحظه: التخدير ايزوفلوان قصير الأمد جدا ، والكائنات الشفاء داخل ~ 30 ثانيه بعد أزاله من غرفه ايزوفلواني.
6. احسب الزيادة في سماكه الاذن عن طريق طرح متوسط سمك الاذن الأساسي ، يقاس قبل تجريد الشريط و/أو العدوى ، من متوسط سماكه الاذن يقاس في كل نقطه الوقت بعد الاصابه.
7. ارسم القيم المحسوبة كزيادة في سماكه الاذن أو ، بدلا من ذلك ، كاجمالي سمك الاذن مع مرور الوقت لكل حيواني أو مجموعه من الكائنات (الشكل 2ب).

5. تحليل العبء الفطري في الجلد المصاب

1. اعداد العقيمة 2 مل أنبوب الطرد المركزي لكل الاذن ليتم حصادها ، التي تحتوي علي 0.5 مل من العقيمة 0.05 ٪ NP40 في dH₂O والكره الفولاذية الاوتوكلاف (قطرها 5 ملم).
2. تزن الأنابيب باستخدام التوازن الدقيق وكتابه الوزن بدقه.
3. موت ببطء الفئران من قبل CO₂ خنق.
4. أزاله الاذن (ق) في القاعدة ونقلها إلى الأنبوب الذي يحتوي علي 0.5 مل من معقم 0.05 ٪ NP40 في dH₂O ، كما هو موضح في الخطوات 5.1-5.2.
5. تزن الأنبوب الذي يحتوي علي انسجه الاذن ويحسب الوزن الفعلي لكل عينه عن طريق طرح وزن الأنبوب دون الجهاز من وزن الأنبوب مع العضو.
6. تجانس انسجه الاذن لمده 6 دقائق في 25 هرتز باستخدام الخالط الانسجه. تاكد من ان الانسجه متجانسة جيدا.
7. لوحه 100 μL من كل عينه (المقابلة 1/5 من كل متجانس ، عامل التخفيف = 5) علي لوحات أجار mDixon واحتضان لوحات راسا علي عقب في حاضنه 30 درجه مئوية.
   ملاحظه: يجب تعديل كميه متجانسة مطلي وفقا لحموله الفطرية المتوقع. تاكد من لوحه متجانسة كافيه للحصول علي ما لا يقل عن 10 وليس أكثر من 250 مستعمرات لكل لوحه للسماح التعداد سهله. اختياريا ، لوحه لوحات متعددة لكل عينه مع المخففات المختلفة من المتجانس.
8. تفقد نمو المستعمرات Malassezia بانتظام.
   ملاحظه: عاده ما تصبح المستعمرات مرئية بعد 2-3 يوما. الوقت اللازم لمستعمرات malassezia لتنمو يعتمد علي الأنواع وسلاله من malassezia.
9. عد المستعمرات لكل صحن.
10. حساب عدد الانسجه كفو/g باستخدام الصيغة التالية:
    CFU/ز الانسجه = (عدد من المستعمرات/لوحه) x (عامل التخفيف)/(وزن عينه الجلد في ز).
    ملاحظه: يمكن تقييم الحد الأدنى التقريبي للكشف باستخدام الصيغة التالية: حد ادني للكشف = (1 مستعمره/لوحه) x (عامل التخفيف)/(متوسط الوزن لجميع عينات الجلد في g).
11. وعاده ما يتم رسم الأحمال الفطرية علي مقياس لوغاريتمي (الشكل 2ج).

النتائج

في المختبر زراعه Malassezia
بالمقارنة مع غيرها من مسببات الامراض نموذج الفطرية أكثر شيوعا مثل c. مبيض أو ا. تبخير، malassezia هو أكثر صعوبة للثقافة في المختبر. ويمكن ان يعزي هذا إلى حقيقة ان Malassezia تعتمد علي مصادر الدهون الخارجية لمتطلباتها الغذائية, نظرا لعدم قدرتها علي توليف الأحماض الدهنية¹¹. و mdixon المتوسطة هي مناسبه لزراعه عده أنواع malassezia بما في ذلك m. باتشيديرماتيس, m. نخاله, m. سمبوديليس, m. slooffiae, m. جلوبوزا و m. ياماتونسيس في المختبر^{7 ،12}. الشكل 1 يظهر الصور التمثيلية لنمو m. سمبوديليس في السائل mdixon المتوسطة وعلي أجار mdixon كما هو موضح في الخطوة 1 والخطوة 2.

تحليل التهاب الجلد وعبء الفطرية من التهاب الجلد Malassezia
التعرض Malassezia إلى الاذن الماوس الجلد الذي كان حاجزا تعطلت من قبل تجريد الشريط قبل العدوى يؤدي إلى تفاقم التهاب الجلد ، والتي تتميز بفرط تنسج البشرة والجلد وتطور وذمه⁷. الخطوة 4 و 5 الخطوط العريضة لطرق تحليل Malassezia-الناجمة عن تورم الاذن والعبء الفطري للجلد. وتمثل كلتا المعلمتين القراءات الرئيسية لرصد مسار العدوى. الشكل 2ا يوضح الزيادة في سماكه الاذن التي يمكن ملاحظتها بعد التعرض m. الفراء للجلد الذي كان حاجزا معطلا بالمقارنة مع الجلد غير المضطربة من الفئران WT C57BL/6. ويبين الشكل 2باء رسما بيانيا تمثيليا للزيادة في سماكه الاذن مع مرور الوقت. يعرض الشكل 2ج العبء الفطري في جلد الاذن في اليوم الثاني بعد الاصابه بالباتشيديرماتيس.

الشكل 1: زراعه الملاسزيا في المختبر.
(ا) M. سمبوديليس سلاله atcc 42132 نمت لمده 3 أيام في 30 درجه مئوية و 180 دوره في الدقيقة في السائل mdixon المتوسطة (اليسار) بجوار قارورة erlenmeyer التحكم التي تحتوي علي mdixon المتوسطة التي لم تطعيم (الحق). (ب) مستعمرات m. سمبوديليس سلاله atcc 42132 علي أجار mdixon بعد 5 أيام من الحضانة في 30 درجه مئوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحليل العدوى الجلدية الملاسيزيا علي أساس سمك الاذن والعبء الفطري.
(ا) الانسجه من أقسام الاذن التي تم الحصول عليها من الفئران C57BL/6 التي عولجت مع زيت الزيتون (السيارة ، اليسار) أو المصابة بسلاله m. نخاله JPLK23 لمده 5 أيام (الأوسط واليمين). علي اليمين ، تم تجريد جلد الاذن من الشريط قبل الاصابه. وكانت المقاطع ملطخه بالخلايا الدموية واليوسين (H & E). (ب) الرسوم البيانية الموجزة التي تبين الزيادة في سمك الاذن مع مرور الوقت بالنسبة للفئران C57BL/6 التي تعرضت ل Malassezia أو تركت غير مصابه كعناصر تحكم. يتم عرض سمك المطلق باتشيديرماتيس سلاله atcc 14522 المكشوفة أو الجلد الاذن المركبة المعالجة في كل نقطه زمنيه علي اليسار; الزيادة في سماكه الاذن في النقاط الزمنيه المشار اليها بالنسبة إلى خط الأساس في اليوم 0 يظهر علي اليمين. (ج) العبء الفطري في الجلد من C57BL/6 الفئران التي كانت مصابه باتشيديرماتيس سلاله الام atcc 14522 أو التعامل مع زيت الزيتون كعنصر تحكم (السيارة). في كلتا الحالتين ، تم تجريد الجلد الشريط. كل رمز في ملخص الرسوم البيانية B و C يمثل واحد الحيوانية. تم حساب الدلالة الاحصائيه للاختلافات بين المجموعات باستخدام الطريقة الواحدة ANOVA (B) أو اختبار t للطالب (C). p < 0.001 ، * * * * p < 0.0001 ، دي: حد الكشف يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يصف هذا البروتوكول عدوي الجلد من سلاله الماوس التي يشيع استخدامها C57BL/6 من قبل Malassezia Spp. تكييف هذا البروتوكول مع سلالات الماوس الأخرى مع خلفيه وراثيه مختلفه (علي سبيل المثال ، balb/c) أو إلى الماوس المعدلة وراثيا سلالات قد تحتاج إلى تعديل جرعه العدوى ، والنقطة الزمنيه (ق) من التحليل ، الخ. لضمان استنساخ ، يجب ان تكون مجموعات الفئران دائما من نفس العمر والجنس. وينبغي إبقاء مصدر الفئران مستقرا ، حيث ان التغيرات الطفيفة في الخلفية الجينية والاختلافات في الكائنات المجهرية ، الموجودة بين البائعين والتي قد توجد حتى بين الوحدات المختلفة لمنشاه تكاثر واحده ، يمكن ان يكون لها تاثير لا يمكن التنبؤ به علي مسار العدوى. عند اعداد نموذج العدوى Malassezia الموصوفة في هذا البروتوكول ، ينصح باجراء دراسة تجريبية لرصد بعناية مسار العدوى ، بما في ذلك مدي الاستعمار ، وحركيه التطهير الفطرية ودرجه التهاب وعلم الامراض التي قد تكون مستحثه (علي سبيل المثال ، إذا كانت بشره الاذن معطله قبل الاصابه) لتحديد ظروف الفحص الأمثل.

ولضمان الاستنساخ والكشف الموثوق عن الاختلافات بين المجموعات التجريبية ، يجب حساب عدد الماشية المستخدمة لكل مجموعه استنادا إلى التحليل الإحصائي. يتم احتساب حجم العينة استنادا إلى حجم التاثير ومعدل الخطا والطاقة ، والتي تعتبر الاختلافات البيولوجية والتجريبية (علي سبيل المثال ، بسبب الاختلاف في الجهاز المناعي). لأسباب اخلاقيه تجنب استخدام اعداد عاليه بدون داع من الماشية. وفيما يتعلق بعدوي الجلد Malassezia ، وعلاج الاذن واحد فقط مع الفطريات واستخدام الاذن الأخرى كعنصر تحكم داخل الماوس نفسه ، لا ينصح لان الفئران قد تنتشر الفطريات لكلا الاذنين عند الاستمالة. ومع ذلك ، باستخدام 1/2 الاذن لمختلف وسائل القراءة المنهجية مثل تحديد عبء الفطرية ، وعزل الخلايا المناعية أو التحليل النسيجي هو في كثير من الأحيان ما يكفي ويؤدي إلى انخفاض كبير في اعداد الحيوانية المستخدمة للتجارب.

وقد وصفت 18 نوعا مختلفا من Malassezia حتى الآن. الاختلافات بين والاستقراء داخل جنس Malassezia يمكن ان تؤثر علي التفاعل مع المضيف ، كما تعلمنا أيضا من الدراسات علي الفطريات الأخرى المسببة للامراض البشرية¹³. مختلف أنواع malassezia وسلالات تختلف في أصلها (علي سبيل المثال ، باتشيديرماتيس هو الأنواع الأكثر شيوعا معزولة عن الماشية ، في حين m. التقييدية، m. جلوبوزا و m. سمبوديليس هي الأكثر أعضاء بارزين من الجلد الفطري الميكروبيوم في البشر مع توزيع متغير من هذه الأنواع بين مناطق الجلد المختلفة). وقد ارتبطت بعض الأنواع بالعلاقات المعلقة ، في حين يعتقد ان البعض الآخر أكثر تعرضا للامراض ، رغم ان الادله المفصلة لا تزال ضعيفه نسبيا. والاهم من ذلك ، ان بعض الأنواع والسلالات هي بطبيعتها أكثر صعوبة في النمو من غيرها. التالي ، فان القرار الذي الأنواع/سلاله لاستخدامها للعدوى يجب ان تستند إلى مساله البحث.

العدوى التجريبية من الجلد murine مع بعض الكائنات الميكروبية مثل المبيضات الbicans أو المكورات العنقودية الذهبية تتطلب تعطيل حاجز البشرة قبل العدوى ، علي سبيل المثال ، مع ورقه الرمل^{14، 15و16}. وعلي النقيض من ذلك ، فان نموذج العدوى Malassezia الموصوفة هنا هو فعال علي قدم المساواة مع وبدون انقطاع حاجز⁷. يتم تعزيز درجه التهاب الناجم عن الفطريات علي نطاق واسع إذا تم تجريد الجلد من الشريط قبل الاصابه⁷. ولذلك ، ما إذا كان ينبغي التلاعب الجلد قبل تطبيق Malassezia يعتمد علي سؤال البحث. نماذج مختلفه من التهاب الجلد المزمن والحاد (علي سبيل المثال ، نماذج لفرط الحساسية نوع تاخر (دث) والاتصال فرط الحساسية (CHS)) ونماذج من نقص الحاجز الموجودة التي قد تكون ذات فائده للتحقيق في مساهمه الخميرة المعلقة للامراض الجلدية.

الفئران التي تم الاحتفاظ بها تحت ظروف محدده الممرض الحرة (SPF) هي (علي حد علمنا) لا استعمرت بطبيعة الحال مع Malassezia. ولذلك ، فان التطبيق التجريبي من Malassezia إلى الاذن الماوس الجلد يمثل التعرض الاولي للفطريات التي تدفع استجابه حاده في المضيف ، والتي بدورها يؤدي إلى أزاله الفطرية في غضون 1-2 أسابيع⁷. في حين ان النموذج الموصوف في هذا البروتوكول يعكس جزئيا فقط الوضع في البشر المناعي أو غيرها من الكائنات المضيفة التي استعمرت بشكل دائم مع Malassezia, العدوى التجريبية يسمح نافذه وافره من فرصه لدراسة المناعة المضادة للفطريات واليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء هذه الاستجابة. كما انه يسمح بالتحقيق في الاختلافات في الاستجابة للأنواع المختلفة من الملاسزيا والسلالات في ظل ظروف تجريبية مختلفه (علي سبيل المثال ، مع وبدون انقطاع حاجز الجلد).

وكانت دراسة Malassezia -التفاعلات المضيف محدوده في الماضي إلى التجارب في المختبر مع أنواع الخلايا المعزولة في الثقافات (علي سبيل المثال ، خطوط الخلايا الكيراتينيه ، pbmcmcmcccmcccccc). علي الرغم من ان هذه الدراسات قد تسلط بعض الضوء علي العوامل الفطرية والمضيفة التي تشكل التفاعل بين Malassezia والمضيف¹⁷، فانها لا تسمح للحصول علي فهم شامل للتفاعل الفطريات-المضيف في المجمع بيئة الجلد ، والتي تنطوي علي أنواع متعددة من الخلايا التي هي في الاتصالات المستمرة ، مثل الخلايا الكيراتينيه ، الليفية والانسجه المقيمة في الخلية المناعية ، ولكن أيضا السكان الكريات البيضاء التي تخترق الانسجه فقط علي لقاء الميكروبية لل الجلد. هذه الشبكة متعددة الخلايا لا يمكن استنساخها بالبالكامل في النماذج في المختبر ، حتى مع الانظمه العضوية الأكثر تقدما. وهكذا ، فان العدوى التجريبية من الفئران لا تزال تمثل معيار الذهب في المناعة والبحوث الامراض المعدية ، وتوافر النموذج الموصوف هنا يمثل طفرة في مجال البحوث Malassezia . الأهم من ذلك ، يعتمد هذا النموذج علي التطبيق وخز من Malassezia علي الجلد الاذن الفاره غير مضطربة ، وانه لا توريط التلقيح من الفطريات عن طريق الحقن في الانسجه ، علي سبيل المثال ، جلد أو داخل الصفاق ، كما أفادت الدراسات السابقة عن¹⁸، وكلاهما أكثر بعدا عن الوضع في المضيفين المستعمرين بشكل طبيعي.

امكانيه الجمع بين نموذج من العدوى Malassezia الموصوفة في هذا البروتوكول مع غيرها من نماذج الماوس المتاحة يزيد كثيرا من نطاق ومرونة التطبيق. وتشمل هذه الاخيره نماذج مختلفه من الاضطرابات الجلدية المحددة ، مثل نموذج نقص الحاجز الذي يحاكي السمات الهامه من التهاب الجلد التاتبي ، وهو مرض يرتبط مع Malassezia في كل من البشر والقطط. وعلاوة علي ذلك ، يمكن بسهوله تطبيق العدوى وخز من الجلد مع Malassezia علي الفئران مع العيوب الوراثية في الجينات المضيفة من الفائدة ، أو الفئران التي يتم حذف نوع الخلية من الفائدة وراثيا أو يمكن ان تكون المنضب الدوائية (علي سبيل المثال ، من خلال وسائل أداره سموم الخناق في الفئران التي تعبر عن سموم الخناق. وتمثل هذه النماذج أداه حتمية لتشريح استجابه المضيف للميكروبات المعلقة والميكروبات المسببة للامراض ، بما في ذلك Malassezia، ولتقييم دور هذه الجينات ونوع الخلية في التفاعل بين الفطريات والمضيف. ويمكن توسيع التحليلات من التفاعل Malassezia-الجلد المضيف ابعد بكثير من ما هو موضح في هذا البروتوكول. وتشمل هذه التحليلات عن طريق علم الانسجه (علي سبيل المثال ، لتحديد درجه علم الامراض الجلدية أو سماكه البشرة الناجمة عن الفطريات) ، عن طريق مناعي أو تلطيخ المناعية من أقسام الانسجه باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد نوع الخلية علامات محدده أو جزيئات أخرى من الفائدة. وقد تنطوي أيضا علي عزل الخلايا (علي سبيل المثال ، الانسجه المقيمة أو التسلل الانسجه الكريات البيضاء مجموعات فرعيه) من انسجه الجلد المصابة لدراسة الاستقطاب ، والتنظيم ، وديناميكية الاستجابة المناعية إلى Malassezia في عمق كبير.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG
Attane Isoflurane	Piramal Healthcare	-
Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe	DASIT GROUP	TEC 5594	BSL2 certified
Centrifuge	Eppendorf	5415D	compatible with 2ml Eppendorf tubes
Dessicated Ox-bile	Sigma-Aldrich	70168-100G
Eppendorf Tubes (2 ml)	Eppendorf	0030 120.094
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-5KG
Gylcerol (99 %)	Honeywell	10314830
Heating pad	Eickenmeyer	648048
Incubator Hereaus B20	Heraeus	412047753	BSL2 certified
Ketasol (100 mg)	Graeub AG	6680416
Magentic heating plate MR Hei-Standard	Heidolph Instruments	442-1355
Malassezia spp.	ATCC	14522, 14521, 42132
Malt extract	Sigma-Aldrich	70167-500G
Multiply Biosphere Tubes (200 µl)	Sarstedt AG	7084211	Safelock
Native olive oil	-	-	commerc. available
Nonidet P40	Axon Lab	A1694,0250
Oditest measurment devise	Kroeplin	S0247	range 0-5 mm
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	75090-5ML
Peptone	Oxoid	LP0037
Petri dishes	Sarstedt AG	82.1473
Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x)	Amimed/Bioconcept	3-05F39
Rompun (2 %)	Bayer	KP0BFHR
Shaking incubator Infors Minitron	Infors	-	BSL2 certified
Spectrometer	Jenway	20308	optical density measurement at 600nm
Spectrometer Cuvettes	Greiner Bio-One	613101
Stainless Steel balls (5mm)	ABF	KU.5G80 1.3541
Syringes 1 ml Sub-Q	BD Bioscience	305501
Tissue Lyzer II	Quiagen	85300
Transpore Hypoallergic Tape	3M	1527-1
Tween 40	Sigma-Aldrich	P1504-100ML
Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream	BAUSCH & LOMB		commerc. available