Infettare i topi con Malassezia spp. per studiare l'interazione Fungus-Host

Riepilogo

Questo protocollo delinea l'istituzione di un modello murino per studiare le interazioni -ospite di Malassezianella pelle. Descrive la coltivazione di Malassezia in vitro, l'infezione della pelle murina con Malasseziae la successiva analisi dell'infiammazione e del carico fungino nel tessuto cutaneo.

Abstract

I modelli animali sono fondamentali per la ricerca sulle malattie infettive. Forniscono una base importante per analizzare l'intero spettro delle interazioni che si verificano tra i microbi e il loro ospite in vivo in modo specifico. I funghi patogeni sono sempre più riconosciuti come una grave minaccia per gli esseri umani e lo sfruttamento di tali modelli di infezione hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione della patogenicità fungina. Le specie del genere Malassezia sono i funghi più abbondanti del microbiota della pelle umana e sono anche associate allo sviluppo di gravi disturbi infiammatori della pelle come la dermatite seborrheica e la dermatite atopica. Tuttavia, un legame causale tra Malassezia e la patogenesi della malattia rimane sconosciuto, un fatto che può essere attribuito alla scarsa conoscenza del complesso incrocio di Malassezia con il sistema immunitario della pelle. Questo protocollo descrive l'istituzione di un modello di topo sperimentale che permette di studiare l'interazione di Malassezia con la pelle dei mammiferi in vivo. Descrive il metodo per coltivare Malassezia spp. in condizioni di laboratorio, come infettare la pelle murina con Malassezia spp. e come valutare l'esito dell'infezione attraverso l'infiammazione della pelle e analisi fungine. Il modello qui descritto funziona in animali completamente immunocompetenti e non si basa sul pretrattamento immunosoppressivo o antibiotico degli animali. È inoltre adattabile a praticamente tutti i ceppi di topi geneticamente modificati e può essere combinato con altri modelli di malattia della pelle. Queste caratteristiche rendono questo modello di infezione uno strumento molto potente per studiare in dettaglio la risposta immunitaria innata e adattativa dell'ospite contro Malassezia nella pelle in vivo.

Introduzione

La pelle è popolata da molti microbi diversi. La costante esposizione della pelle al microbiota contribuisce a plasmare ed educare il sistema immunitario dell'ospite. I funghi sono sempre più riconosciuti come una parte vitale del microbiota e svolgono un ruolo importante per la fisiologia e l'immunità dell'ospite, simile a batteri e virus¹. Le specie del genere Malassezia sono di gran lunga i funghi più abbondanti colonizzando la pelle dei vertebrati a sangue caldo e costituiscono oltre il 90% del micobioma della pelle umana^2,3. Diciotto diverse specie di Malassezia sono state finora identificate dalla pelle umana e animale⁴.

Si pensa che varie patologie della pelle si presentino, almeno in parte, a causa di una composizione microbiota sbilanciata. La disbiosi può portare alla crescita eccessiva di specie con potenziale patogeno con conseguente infezioni opportunistiche e malattia^{5 .} Coerentemente, vi è una prova crescente che Malassezia, oltre al suo stile di vita commensale, contribuisce allo sviluppo di varie patologie cutanee, che vanno dalla forfora e pieriarsis versicolor a disturbi infiammatori più gravi come come dermatite seborrheica e dermatite atopica^4,6. Mentre è stato stabilito un legame causale tra Malassezia e pityriarsis versicolor, il ruolo patofisiologico del fungo nelle patologie cutanee più gravi rimane in gran parte sconosciuto.

Determinare il ruolo di Malassezia nell'omeostasi della pelle e nella malattia richiede una conoscenza più approfondita dell'interazione del fungo con la pelle e del sistema immunitario cutaneo. Da notare che la ricerca su Malassezia è, rispetto ad altri patogeni fungini umani (ad esempio, Candida albicans o Aspergillus fumigatus), ancora in fase nascente. Ciò può essere attribuito alla difficoltà nella coltivazione di Malassezia in condizioni di laboratorio e alla mancanza di modelli sperimentali adeguati per studiare il fungo a contatto con l'ospite in vivo. Precedenti esperimenti con cellule isolate in coltura hanno indicato un'ampia gamma di interazioni dirette e indirette tra Malassezia e varie cellule immunitarie e non immunitarie⁷. Tuttavia, questi esperimenti in vitro riassumono solo parzialmente la situazione del complesso ambiente cutaneo in vivo, dove numerosi eventi cellulari e molecolari si verificano in modo concomitante tra il fungo e vari tipi di cellule.

Qui, illustreremo il protocollo per un modello sperimentale di infezione cutanea di Malassezia nei topi, che abbiamo recentemente stabilito, per studiare l'interazione fungo-ospite in vivo⁷. Ciò include le procedure per (1) il successo della coltivazione di Malassezia in vitro, (2) l'applicazione epicutanea di Malassezia sulla pelle dell'orecchio murino e (3) i dettagli tecnici su come analizzare la pelle indotta da Malassezia infiammazione e il peso fungino della pelle infetta. È importante sottolineare che questo modello non si basa sull'immunosoppressione (ad esempio, da corticosteroidi) o sul trattamento antibiotico dei topi prima dell'infezione, come è praticato in altri modelli murini di infezione fungina^8,9. A sua volta, permette di studiare l'intero spettro della risposta immunitaria innata e adattativa contro Malassezia nella pelle normale. Da notare che i topi selvatici inbred tenuti in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF) non sono colonizzati naturalmente con Malassezia e, pertanto, la loro esposizione al fungo non provoca una colonizzazione persistente, ma viene cancellata dall'ospite all'interno circa 1,5 settimane. Tuttavia, il modello consente di studiare i meccanismi di inizio e regolazione della risposta dell'ospite antifungina che, a sua volta, è alla base di come viene generata la memoria immunitaria. Il modello è versatile in quanto può essere facilmente applicato a un'ampia varietà di ceppi di topi geneticamente modificati e può essere combinato con altri modelli di malattia della pelle esistenti, come i modelli di carenza di barriere, per studiare l'impatto di Malassezia sotto patologico e infiammatorio condizioni cutanee⁷. Pertanto, il modello descritto dell'infezione sperimentale della pelle di Malassezia nei topi fornisce un alto grado di flessibilità per studiare l'interazione del fungo con il sistema immunitario della pelle nel contesto dell'omeostasi e della malattia.

Questo protocollo descrive l'infezione sperimentale della pelle dei topi con Malassezia spp. A causa del suo potenziale patogeno, Malassezia spp. sono classificati come patogeni BSL2 in alcuni paesi, tra cui la Svizzera. Si prega di controllare le linee guida locali e seguire le normative delle autorità locali. Gli organismi classificati BSL2 devono essere gestiti da personale qualificato nell'ambito di un armadio di biosicurezza certificato BSL2 (BSC). I rifiuti biologici contaminati da organismi classificati BSL2, nonché le carcasse di topi infettati da tali organismi devono essere autoclati prima dello smaltimento. Per gli esperimenti con i topi, tutti gli sforzi dovrebbero essere fatti per ridurre al minimo la sofferenza e garantire i più alti standard etici e umani secondo i principi 3R (sostituire, affinare, ridurre)¹⁰. Gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati effettuati con M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) e M. simpodi (ATCC 42132)⁷.

Protocollo

Tutte le procedure descritte nel presente protocollo sono state eseguite conformemente all'ordinanza sulla manipolazione degli organismi nei sistemi contenuti dell'Ufficio federale dell'ambiente, Svizzera (www.bafu.admin.ch). Gli esperimenti sui topi sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida della legge svizzera sulla protezione degli animali e sono stati condotti secondo i protocolli approvati dall'Ufficio veterinario del Cantone svizzero (numero di licenza 168/2018).

1. Coltivazione di Malassezia in condizioni di laboratorio

NOTA: Conservare tutti i reagenti e i supporti utilizzati per questo protocollo a temperatura ambiente (RT, 20 – 25 gradi centigradi), salvo diversa indicazione, in quanto la temperatura più bassa può inibire la crescita fungina.

1. Preparare il mezzo Liquido Dixon (mDixon) per la crescita di Malassezia. Per preparare 500 mL di mezzo liquido mDixon, sciogliere 18 g di Estratto di malto, 10 g distillato H₂O (dH₂O). Regolare il medio al pH 6 con HCl e autoclave. Memorizzare il supporto in RT.
2. Preparare piastre di agar mDixon aggiungendo 7,5 g di agar a 500 mL mDixon medio prima di autoclaving. Raffreddare lentamente l'agar mDixon dopo l'autoclaving utilizzando una barra di sterzo e una piastra di riscaldamento magnetico per evitare la solidificazione parziale del mezzo durante il raffreddamento.
3. Una volta che l'agar si è raffreddato fino a 50 – 60 gradi centigradi, erogare il liquido nei piatti Petri in un cappuccio a flusso laminare e lasciarli asciugare a RT durante la notte.
   NOTA: Le piastre di agar possono essere conservate a 4 gradi centigradi per diverse settimane quando sono avvolte e tenute a testa in giù per evitare l'evaporazione.
4. Ottenere Malassezia isola e far rivivere gli stock di lofilazione di Malassezia secondo le istruzioni fornite dal fornitore.
5. Inoculare 10 mL di mezzo liquido mDixon in un fiascheta sterile di 100 mL Erlenmeyer con la sospensione Malassezia rianimata secondo le istruzioni ottenute dal fornitore. Incubare la coltura in un incubatore agitazione a 30 e 180 giri/min.
6. Ispezionare regolarmente la crescita della cultura Malassezia controllando l'aspetto del colore crema e torbidità. La cinetica della crescita dipende dalla specie e dal ceppo di Malassezia e può essere particolarmente lenta quando Malassezia viene appena rianimata da uno stock di lofilofilazione. (Figura 1A).
7. Preparare gli stock di glicerolo mescolando 3 parti della coltura Malassezia densamente coltivata nel mezzo mDixon con 1 parte di glicerolo sterile 99%. La miscela Dimazia/glycerol in sterili tubi a vite e conservare a -80 gradi centigradi.
8. Per la propagazione in vitro, piastra Malassezia dalla coltura liquida in mDixon o dal brodo di glicerolo congelato su una piastra di agar mDixon (portato a RT da 4 gradi centigradi) utilizzando un ciclo di inoculazione.
   NOTA: Trasferire le piastre di agar mDixon a RT da 4 gradi centigradi prima dell'uso, poiché l'agar mDixon freddo inibisce la crescita fungina.
9. Incubare le placche di agar con Malassezia capovolta in un incubatore (non shaking) a 30 gradi centigradi. Ispezionare regolarmente la crescita delle colonie di Malassezia.
   NOTA: le colonie di Malassezia sulle piastre di agar mDixon appaiono entro 3 - 5 giorni e sono opache color crema, lisce con elevazione convessa (Figura 1B).
10. Conservare le colonie di Malassezia su piastre di agar mDixon a RT per 2 settimane. Successivamente, preparare una nuova piastra di agar mDixon striando Malasse dal brodo di glicerolo congelato come descritto nel 1.7.

2. Preparazione dell'inoculo per l'infezione sperimentale di Malassezia dei topi

1. Inoculare 10 mL di mezzo liquido mDixon in una fiaschetta sterile di Erlenmeyer da 100 mL con 3 - 5 colonie individuali di Malassezia da un bacino di agar mDixon (vedere passo 1, Figura 1B).
2. Incubare la cultura Malassezia per 48 a 96 h a 30 e 180 giri/min fino a quando la coltura è color crema e torbida (Figura 1A).
   NOTA: Il tempo necessario per la crescita di Malassezia dipende dalla specie e dalla tensione di Malassezia e dalla quantità di funghi utilizzati per l'inoculazione.
3. Trasferire 2 mL della coltura di Malassezia in un sterile tubo di microcentrifuga da 2 mL e centrifugare per 1 min a 10.000 x g.
4. Scartare il supernatante e lavare il pellet sospendendolo in 1 mL di soluzione di sale tampone fosfato (PBS). Centrifuga di nuovo per 1 min a 10.000 x g.
5. Dopo il lavaggio, sospendere il pellet in 1 mL di PBS con un tubo vigoroso e misurare la densità ottica della soluzione a 600 nm (OD_A600) utilizzando uno spettrometro. Diluire la sospensione Malassezia 20 – 50 x con PBS per la misurazione OD per assicurare che la lettura sia compresa tra 0,1 e 1.
   NOTA: La densità di una coltura di 3 giorni di Malassezia varia generalmente tra 15 e 30 OD_A600, a seconda della specie e del ceppo di Malassezia e del numero di cellule di lievito utilizzate per l'inoculazione della coltura (passaggio 2.1). Malassezia tende a formare aggregati, quindi è necessario una vigorosa pipettatura per garantire l'omogeneità della sospensione.
6. un volume della sospensione Malassezia in PBS che corrisponde ad una densità di 4 OD_A600 in un tubo sterile da 2 mL. Preparare 1 tubo per animale da infettare.
7. Centrifugare i tubi contenenti Malassezia per 1 min a 10.000 x g.
8. Scartare il supernatante e sospendere il pellet di Malassezia in 200 l di olio d'oliva nativo (corrispondente a 2 celle di lievito OD_A600/100 l di olio d'oliva).
   NOTA: L'olio d'oliva è stato trovato per essere un buon veicolo per l'infezione epicutanea con Malassezia, come Malassezia è un lievito lipofilo e lipidico-dipendente. L'olio d'oliva viene assorbito meglio dalla pelle rispetto alla PBS. Tuttavia, essere consapevoli del fatto che non è facile sospendere Malassezia in olio d'oliva. Migliorare la sospensione Malassezia/ olio d'oliva vortice. Mantenere la sospensione a RT fino a quando non viene utilizzato per l'infezione.
9. Preparare i tubi con olio d'oliva da solo per l'infezione finta di animali di controllo.

3. Infettare i topi con Malassezia

1. Ordina topi c57BL/6 femminili all'età di 6 - 8 settimane e consenti loro di acclimatarsi nell'impianto sperimentale per animali per almeno una settimana. Calcola per 3 - 5 topi per gruppo, incluso un gruppo di controllo non infetto.
2. Preparare un cocktail anestetico sterile contenente 1,3 mg/mL Xylazine e 6,5 mg/mL di ketamina in PBS. 5 mL del cocktail anestetico è sufficiente per anestetizzare 20 animali. Regolare il volume del cocktail in base al numero di animali da anetizzare.
   1. Anestetizza gli animali iniettando inasti 10 l/g di peso corporeo anestetico intraperitamente (corrispondente a 65 mg di Ketamina e 13 mg di Xylazina per kg di peso corporeo) e posizionare gli animali anestetizzati su un pad di riscaldamento a 37 .
      NOTA: Alla dose indicata, gli animali di solito rimangono anestesizzati per 30 - 60 min.
3. Controllare i riflessi pizzicando il piede posteriore con pinze per assicurare che gli animali siano completamente anestesizzati.
4. Applicare una crema per gli occhi sugli occhi per prevenire la disidratazione durante l'anestesia.
5. Facoltativamente, misurare lo spessore dell'orecchio di entrambe le orecchie utilizzando una calibro (0 - 5 mm di autonomia). Misurare due aree diverse di ogni orecchio e calcolare lo spessore medio dell'orecchio per orecchio.
   NOTA: la misurazione dello spessore dell'orecchio è facoltativa e dipende dalla domanda di ricerca. Tuttavia, se lo spessore dell'orecchio viene utilizzato come lettura per l'infiammazione della pelle, è necessario misurare lo spessore dell'orecchio della linea di base prima dell'infezione. (vedere il passaggio 4).
6. Facoltativamente, interrompere la barriera epidermica della pelle dell'orecchio dorsale con lo stripping del nastro delicato: applicare manualmente un piccolo pezzo di nastro sulla pelle e rimuoverlo di nuovo. Ripetere per 5 colpi consecutivi utilizzando un pezzo di nastro fresco per ogni round.
   NOTA: Malassezia induce un'infiammazione cutanea più pronunciata nella pelle con barriera interrotta rispetto alla pelle imperturbabile (Figura 2A)⁷.
7. Applicare topicamente 100 luna (2 OD_A600) della sospensione Malassezia/olio d'oliva sul lato dorsale di ciascun orecchio utilizzando una pipetta sterile. Includere un gruppo di controllo di animali trattati solo con olio d'oliva (gruppo di controllo trattato con veicolo).
   NOTA: Vorticare vigorosamente la sospensione dell'olio di Malassezia/olio d'oliva per garantire una sospensione Malassezia omogenea immediatamente prima dell'applicazione.
8. Lasciare gli animali anestesizzati sul pad di riscaldamento per evitare l'ipotermia fino a quando non mostrano segni di recupero (movimento del baffo, aumento della frequenza respiratoria, ecc.).
9. Iniettare nella piega del nuchal una soluzione sterile e preriscaldata del 2% di glucosio per supportare il metabolismo e la reidratazione.
   NOTA: Per preparare una soluzione sterile a 2% di glucosio, sciogliere 1 mg di glucosio in PBS da 50 mL e filtrarlo utilizzando un filtro da 0,2 m. La soluzione può essere immagazzinata a 4 gradi centigradi.
10. Trasferisci gli animali nella loro gabbia.

4. Analisi dell'infiammazione cutanea indotta da Malassezia

NOTA: Questa procedura descrive l'analisi del gonfiore dell'orecchio indotto da Malasseziadurante l'infezione che funge da parametro di infiammazione della pelle. Un prerequisito per l'analisi del gonfiore dell'orecchio indotto dal fungo è misurare lo spessore dell'orecchio basale prima della striscia a nastro e/o dell'infezione (passaggio 3.5).

1. Preparare camera isoflurane per l'anestesia a breve termine di Malassezia-infettato e controllare gli animali.
2. Trasferire un animale alla volta alla camera e attendere che l'animale sia completamente anetizzato.
   NOTA: I segni di un'anestesia adeguata includono il completo rilassamento del corpo e la respirazione lenta e pesante (fianco). Monitorare attentamente l'anestesia poiché l'esposizione prolungata all'isoflurane può essere fatale.
3. Rimuovere l'animale dalla camera e posizionarlo su un tessuto.
4. Misurare lo spessore degli auricolari utilizzando una pinza (gamma da 0 a 5 mm). Misurare due aree diverse di ciascun orecchio e calcolare lo spessore medio per orecchio (vedere il punto 3.5).
5. Trasferire l'animale nella gabbia.
   NOTA: L'anestesia dell'Isoflurano è di breve durata e gli animali si riprendono entro 30 dollari dopo la rimozione dalla camera dell'isoflurano.
6. Calcolare l'aumento dello spessore dell'orecchio sottraendo lo spessore medio dell'orecchio della linea di base, misurato prima della striscia del nastro e/o dell'infezione, dallo spessore medio dell'orecchio misurato in ogni momento dopo l'infezione.
7. Tracciare i valori calcolati come aumento dello spessore dell'orecchio o, in alternativa, come spessore totale dell'orecchio nel tempo per ogni animale o gruppo di animali (Figura 2B).

5. Analisi del carico di lefarè nella pelle infetta

1. Preparare un tubo sterile di microcentrifuga da 2 mL per ogni orecchio da raccogliere, contenente 0,5 mL di sterile 0,05% NP40 in dH₂O e una palla d'acciaio autoclaved (5 mm di diametro).
2. Pesare i tubi utilizzando un equilibrio di precisione e annotare il peso preciso.
3. Eutanasia i topi per asfissia di CO_2.
4. Rimuovere gli auricolari alla base e trasferirli nel tubo contenente 0,5 mL di sterile 0,05% NP40 in dH₂O, come descritto nei passaggi 5.1 - 5.2.
5. Pesare il tubo contenente il tessuto dell'orecchio e calcolare il peso effettivo di ogni campione sottraendo il peso del tubo senza l'organo dal peso del tubo con l'organo.
6. Omogeneizzare il tessuto ocra per 6 min a 25 Hz utilizzando un omogeneizzatore del tessuto. Assicurarsi che il tessuto sia ben omogeneizzato.
7. Piastra 100 L di ogni campione (corrispondente a 1/5 di ogni omogeneità, fattore di diluizione 5) su piastre di agar mDixon e incubare le piastre a testa in giù in un'incubatrice di 30 gradi centigradi.
   NOTA: La quantità di placcato omogeneo deve essere regolata in base al carico fungino previsto. Assicurarsi di piastra abbastanza omogeneo per ottenere almeno 10 e non più di 250 colonie per piastra per consentire una facile enumerazione. Facoltativamente, piastrare più piastre per campione con diverse diluizioni di omogeneo.
8. Ispezionare regolarmente la crescita delle colonie di Malassezia.
   NOTA: Le colonie di solito diventano visibili dopo 2 - 3 giorni. Il tempo necessario per la crescita delle colonie di Malassezia dipende dalle specie e dal ceppo di Malassezia.
9. Conta le colonie per piatto.
10. Calcolare il numero di tessuto CFU/g utilizzando la seguente formula:
    CFU/g tissuee (numero di colonie/piastra) x (fattore di diluizione) / (peso del campione di pelle in g).
    NOTA: il limite minimo di rilevamento approssimativo può essere valutato utilizzando la seguente formula: limite minimo di rilevamento: (1 colonia/piastra) x (fattore di diluizione) / (peso medio di tutti i campioni di pelle in g).
11. I carichi fungini sono di solito tracciati su una scala logaritmica (Figura 2C).

Risultati

Coltivazione in vitro di Malassezia
Rispetto ad altri patogeni del modello fungino più comunemente usati come C. albicans o A. fumigatus, Malassezia è più difficile da coltura in vitro. Ciò può essere attribuito al fatto che Malassezia si basa su fonti di lipidi esogeni per i suoi requisiti nutritivi, a causa della sua incapacità di sintetizzare gli acidi grassi¹¹. Il mezzo mDixon è adatto per la coltura di diverse specie di Malassezia tra cui M. pachydermatis, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa e M. yamatoensis in vitro^{7 ,12}. Figura 1 Mostra immagini rappresentative per la crescita di M. simpodi nel mezzo mDixon liquido e su mDixon agar come descritto nei passaggi 1 e passaggio 2.

Analisi dell'infiammazione cutanea e del carico fungino dell'infiammazione della pelle di Malassezia
L'esposizione di Malassezia alla pelle dell'orecchio del topo che era barriera interrotta da nastro-stripping prima dell'infezione si traduce in un'infiammazione esacerbata della pelle, caratterizzata da iperplasia epidermica e dermica e sviluppo di edema⁷. I passaggi 4 e 5 delineano i metodi per analizzare il gonfiore dell'orecchio indotto da Malasseziae il carico fungino della pelle. Entrambi i parametri rappresentano letture chiave per il monitoraggio del corso dell'infezione. Figura 2A illustra l'aumento dello spessore dell'orecchio che può essere osservato dopo l'esposizione di Fupizio alla pelle che è stata interrotta dalla barriera rispetto alla pelle imperturbabile dei topi WT C57BL/6. Figura 2B mostra un grafico di riepilogo rappresentativo dell'aumento dello spessore dell'orecchio nel tempo. Figura 2C visualizza il carico di fungine nella pelle dell'orecchio il giorno 2 dopo l'infezione da M. pachydermatis.

Figura 1: Coltivazione in vitro di Malassezia.
(A) Ceppo dei simpodi M. ceppo ATCC 42132 coltivato per 3 giorni a 30 e 180 rpm in mezzo mDixon liquido (a sinistra) accanto a un pallone di controllo Erlenmeyer contenente mezzo mDixon che non è stato inoculato (a destra). (B) Colonie di M. ceppo di simpodi ATCC 42132 su mDixon agar dopo 5 giorni di incubazione a 30 gradi centigradi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dell'infezione cutanea di Malassezia sulla base dello spessore dell'orecchio e del carico fungino.
(A) Istologia delle sezioni auricolari ottenute da topi C57BL/6 trattati con olio d'oliva (veicolo, sinistro) o infettati da ceppo di pelliccia M. JPLK23 per 5 giorni (medio e destro). Sulla destra, la pelle dell'orecchio era priva di nastro prima dell'infezione. Le sezioni erano colorate con ematossina e eosina (H&E). (B) Grafici di riepilogo che mostrano l'aumento dello spessore dell'orecchio nel tempo per i topi C57BL/6 esposti a Malassezia o lasciati non infetti come controlli. Lo spessore assoluto del ceppo di M. pachydermatis ATCC 14522-esposto o veicolo-trattato pelle dell'orecchio in ogni punto di tempo è visualizzato a sinistra; l'aumento dello spessore dell'orecchio nei punti temporali indicati rispetto alla linea di base del giorno 0 è mostrato a destra. (C) Il carico di funghi nella pelle dei topi C57BL/6 che sono stati infettati da M. ceppo pahydermatis ATCC 14522 o trattati con olio d'oliva come un controllo (veicolo). In entrambi i casi, la pelle è stata spogliata del nastro. Ogni simbolo nei grafici di riepilogo B e C rappresenta un animale. Il significato statistico delle differenze tra i gruppi è stato calcolato utilizzando ANOVA (B) unidirezionale o il test t di Student (C). p <0.001, 'p <0.0001, D.L.: Limite di rilevamento Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo descrive l'infezione della pelle del ceppo murino inbred comunemente usato C57BL/6 di Malassezia spp. ceppi possono richiedere la regolazione della dose di infezione, il tempo (s) di analisi, ecc. Per garantire la riproducibilità, i gruppi di topi devono essere sempre della stessa età e del sesso. La fonte dei topi dovrebbe essere mantenuta stabile, poiché anche lievi cambiamenti nel background genetico e differenze nel microbiota, che esistono tra i venditori e possono esistere anche tra diverse unità di un unico impianto di allevamento, possono avere un impatto imprevedibile sul corso dell'infezione. Quando si imposta il modello di infezione di Malassezia descritto in questo protocollo, si consiglia di eseguire uno studio pilota per monitorare attentamente il corso dell'infezione, compresa l'entità della colonizzazione, la cinetica della clearance fungina e il grado di infiammazione e patologia che potrebbero essere indotte (ad esempio, se la pelle dell'orecchio è perturbata dalla barriera prima dell'infezione) per determinare le condizioni ottimali del saggio.

Per garantire la riproducibilità e rilevare in modo affidabile le differenze tra i gruppi sperimentali, il numero di animali utilizzati per gruppo deve essere calcolato sulla base dell'analisi statistica. La dimensione del campione è calcolata in base alla dimensione dell'effetto, al tasso di errore e alla potenza, che considerano le variazioni biologiche e sperimentali (ad esempio, a causa delle variazioni nel sistema immunitario). Per motivi etici evitare di utilizzare un numero inutilmente elevato di animali. Per quanto riguarda l'infezione della pelle Malassezia, trattando solo un orecchio con il fungo e utilizzando l'altro orecchio come controllo all'interno dello stesso mouse, non è consigliato perché i topi possono diffondere il fungo a entrambe le orecchie durante la toelettatura. Tuttavia, l'uso di un orecchio 1/2 per diverse letture metodologiche come la determinazione del carico fungino, l'isolamento delle cellule immunitarie o l'analisi istologica è spesso sufficiente e si traduce in una significativa riduzione del numero di animali utilizzati per gli esperimenti.

Sono state descritte 18 diverse specie di Malassezia. Variazioni tra e intraspecie all'interno del genere Malassezia possono influenzare l'interazione con l'ospite, come abbiamo imparato anche da studi su altri funghi patogeni umani¹³. Diverse specie e ceppi di Malassezia differiscono nella loro origine (ad esempio, M. pachydermatis è la specie più frequente isolata dagli animali, mentre M. restricta, M. globosa e M. spodialis sono i più membri prominenti del microbioma cutaneo micolaneglio negli esseri umani con distribuzione variabile di queste specie tra diverse aree della pelle). Alcune specie sono state associate al commensalismo, mentre altre sono considerate più patogene, anche se le prove dettagliate rimangono relativamente deboli. È importante sottolineare che alcune specie e ceppi sono intrinsecamente più difficili da coltivare rispetto ad altre. Pertanto, la decisione di quale specie/ceppo utilizzare per l'infezione deve basarsi sulla domanda di ricerca.

L'infezione sperimentale della pelle murina con alcuni organismi microbici come Candida albicans o Staphylococcus aureus richiede l'interruzione della barriera epidermica prima dell'infezione, ad esempio con carta vetrata^{14, 15,16}. Al contrario, il modello di infezione di Malassezia descritto qui è altrettanto efficiente con e senza perturbazione barriera⁷. Il grado di infiammazione indotta dal fungo è massicciamente migliorata se la pelle è nastro spogliato prima dell'infezione⁷. Pertanto, se la pelle deve essere manipolata prima dell'applicazione di Malassezia dipende dalla domanda di ricerca. Esistono vari modelli di infiammazione cronica e acuta della pelle (ad esempio, modelli per l'ipersensibilità del tipo ritardato (DTH) e ipersensibilità del contatto (CHS)) e modelli di carenza di barriera che possono essere di interesse per studiare il contributo del lievito commensale alle patologie della pelle.

I topi inbred mantenuti in condizioni specifiche di senza agenti patogeni (SPF) non sono (a nostra conoscenza) colonizzati naturalmente con Malassezia. Pertanto, l'applicazione sperimentale di Malassezia alla pelle dell'orecchio del topo rappresenta un'esposizione primaria al fungo che induce una risposta acuta nell'ospite, che a sua volta porta alla clearance fungina entro 1 - 2 settimane⁷. Mentre il modello descritto in questo protocollo riflette quindi solo in parte la situazione negli esseri umani immunocompetenti o in altri organismi ospiti che vengono colonizzati permanentemente con Malassezia, l'infezione sperimentale consente un'ampia finestra di l'opportunità di studiare l'immunità antifungina e i meccanismi cellulari e molecolari alla base di questa risposta. Permette inoltre di studiare le variazioni nella risposta a diverse specie e ceppi di Malassezia in diverse condizioni sperimentali (ad esempio, con e senza interruzione della barriera della pelle).

Lo studio di Malassezia - le interazioni con gli ospiti sono stati limitati in passato agli esperimenti in vitro con tipi di cellule isolate nelle colture (ad esempio, linee cellulari cheratinociti, PbMC). Anche se questi studi hanno fatto luce sui determinanti fungini e ospiti che modellano l'interazione tra Malassezia e l'ospite¹⁷, non consentono di ottenere una comprensione completa del fungo - interazione host nel complesso ambiente della pelle, che coinvolge più tipi di cellule che sono in costante comunicazione, come cheratinociti, fibroblasti e cellule immunitarie residenti nei tessuti, ma anche popolazioni di leucociti che si infiltrano nel tessuto solo in caso di incontro microbico Pelle. Questa rete multicellulare non può essere completamente riprodotta nei modelli in vitro, anche con i sistemi organoidi più avanzati. Pertanto, l'infezione sperimentale dei topi rappresenta ancora il gold standard nella ricerca sull'immunologia e sulle malattie infettive, e la disponibilità del modello qui descritto rappresenta una svolta nel campo della ricerca malassezia. È importante sottolineare che questo modello si basa sull'applicazione epicutanea di Malassezia sulla pelle dell'orecchio del topo altrimenti imperturbabile, e non implica l'inoculazione del fungo per iniezione nel tessuto, ad esempio sottocutaneamente o intraperitonealmente, come studi precedenti hanno riportato¹⁸, entrambi più distanti dalla situazione negli ospiti colonizzati naturalmente.

La possibilità di combinare il modello di infezione di Malassezia descritto in questo protocollo con altri modelli murini disponibili aumenta notevolmente l'ambito e la flessibilità dell'applicazione. Questi ultimi includono vari modelli di disturbi specifici della pelle, come il modello di carenza di barriera che imita caratteristiche importanti della dermatite atopica, una malattia associata a Malassezia sia nell'uomo che nei cani. Inoltre, l'infezione epicutanea della pelle con Malassezia può essere facilmente applicata ai topi con difetti genetici nei geni ospiti di interesse, o ai topi in cui un tipo di cellula di interesse viene geneticamente eliminato o può essere impoverito farmacologicamente (ad esempio, con mezzi, con mezzi, della somministrazione di tossina della diftheria nei topi che esprimono il recettore della diftheria). Tali modelli rappresentano uno strumento inevitabile per analizzare la risposta dell'ospite a microbi commensali e patogeni, tra cui Malassezia, e per valutare il ruolo di questi geni e il tipo di cellula nell'interazione fungo-ospite. Le analisi dell'interazione cutanea ospite di Malasseziapossono essere ampliate ben oltre quanto descritto in questo protocollo. Queste includono analisi per istologia (ad esempio, per determinare il grado di patologia cutanea o l'ispessimento epidermico indotta dal fungo), mediante immunohistochimica o colorazione immunofluorescente di sezioni di tessuto che utilizzano anticorpi diretti contro il tipo di cellula marcatori specifici o altre molecole di interesse. Può anche comportare l'isolamento delle cellule (ad esempio, sottosottoinsiemi di leucociti residenti nei tessuti o infiltrati di tessuto) dal tessuto cutaneo infetto per studiare in grande profondità la polarizzazione, la regolazione e la dinamica della risposta immunitaria a Malassezia.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG
Attane Isoflurane	Piramal Healthcare	-
Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe	DASIT GROUP	TEC 5594	BSL2 certified
Centrifuge	Eppendorf	5415D	compatible with 2ml Eppendorf tubes
Dessicated Ox-bile	Sigma-Aldrich	70168-100G
Eppendorf Tubes (2 ml)	Eppendorf	0030 120.094
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-5KG
Gylcerol (99 %)	Honeywell	10314830
Heating pad	Eickenmeyer	648048
Incubator Hereaus B20	Heraeus	412047753	BSL2 certified
Ketasol (100 mg)	Graeub AG	6680416
Magentic heating plate MR Hei-Standard	Heidolph Instruments	442-1355
Malassezia spp.	ATCC	14522, 14521, 42132
Malt extract	Sigma-Aldrich	70167-500G
Multiply Biosphere Tubes (200 µl)	Sarstedt AG	7084211	Safelock
Native olive oil	-	-	commerc. available
Nonidet P40	Axon Lab	A1694,0250
Oditest measurment devise	Kroeplin	S0247	range 0-5 mm
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	75090-5ML
Peptone	Oxoid	LP0037
Petri dishes	Sarstedt AG	82.1473
Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x)	Amimed/Bioconcept	3-05F39
Rompun (2 %)	Bayer	KP0BFHR
Shaking incubator Infors Minitron	Infors	-	BSL2 certified
Spectrometer	Jenway	20308	optical density measurement at 600nm
Spectrometer Cuvettes	Greiner Bio-One	613101
Stainless Steel balls (5mm)	ABF	KU.5G80 1.3541
Syringes 1 ml Sub-Q	BD Bioscience	305501
Tissue Lyzer II	Quiagen	85300
Transpore Hypoallergic Tape	3M	1527-1
Tween 40	Sigma-Aldrich	P1504-100ML
Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream	BAUSCH & LOMB		commerc. available