توصيف المرض اثناء التحكم الألى بالأوكسجين مع تدرج الأكسجين

Summary

هنا ، ونحن نقدم الأكسجين التدرج ektacytometry ، وهي طريقه سريعة وقابله للتكرار لقياس خلايا الدم الحمراء الخلايا في عينات من المرضي الذين يعانون من مرض الخلية المنجلية تحت الأوكسجين الخاضعة للرقابة وأعاده الأوكسجين. توفر هذه التقنية طريقه لدراسة مرض خلايا الدم الحمراء ولمراقبه فعاليه علاج امراض الخلايا المنجلية.

Abstract

في مرض الخلايا المنجلية (SCD) ، طفرة نقطه واحده في الترميز الجيني لبيتا جلوبين يسبب إنتاج الهيموغلوبين غير طبيعي S (HbS). عندما deoxygenated ، يمكن ان تتبلمر HbS ، وتشكيل قضبان جامده من الهيموغلوبين ، مما ادي إلى مرض خلايا الدم الحمراء (RBCs). وقد خفضت هذه RBCs المسببة للخلايا بشكل كبير ، مما تسبب في انسداد فاسو ، مما يؤدي إلى العديد من المضاعفات السريرية المتعلقة SCD ، بما في ذلك الم والسكتة الدماغية ، وتلف الجهاز. كما يتم تقليل الخلايا ار بي سي بسبب الجفاف ار بي سي ، مما ادي إلى خلايا الدم الحمراء الكثيفة التي من المرجح ان المنجل. وحتى الآن ، لا يوجد فحص مختبري واحد متاح علي نطاق واسع وسريع وقابل للتكرار قادر علي التنبؤ بشده المرض أو الرصد المباشر للآثار العلاجية لعلاجات الهيموغلوبين المبتكرة غير الجنينية. في هذه الدراسة ، ونحن وصف بروتوكول لقياس ار بي سي الخلايا كوظيفة من pO₂ التي تسمح لكميه من السلوك المقزز في المرضي scd. يقيس [اكتاكيوتومتري] أكسجين تدرج [ربك] الخلايا, يعبر كالاستطالة فهرسه ([اي]), كداله من [بو]₂. وتتعرض RBCs للإجهاد القص ثابته من 30 باسكال خلال جولة واحده من الأوكسجين وأعاده الأوكسجين. يتم إنتاج سته معلمات قراءات. من هذه, نقطه المقززة (PoS), تعرف باسم pO₂ الذي الحد الأقصى EI (ei_ماكس) يظهر انخفاض 5%, والحد الأدنى ei خلال الأوكسجين (ei_min) هي الأكثر بالمعلومات, مما يعكس المريض الفرد₂ في الذي يبدا المرض والخلايا الحد الأدنى من خلايا الدم الحمراء للمريض ، علي التوالي. ويرتبط نقاط البيع مع تقارب الهيموغلوبين المريض الفردية للأكسجين, بينما EI_min يظهر ارتباط قوي مع مستويات الهيموغلوبين الجنينية. نستنتج ان الأكسجين التدرج اكتاكيتومتري هو تقنيه واعده لرصد علاج المرضي الذين يعانون من SCD ، كمؤشر حيوي للعوامل المضادة للمرض في التجارب السريرية والسريرية ، وأداه هامه لدراسة السلوك المقزز من RBCs من الافراد مع SCD وسمات الخلية المنجلية.

Introduction

في SCD ، الطفرة نقطه واحده النتائج في إنتاج HbS ، والتي يمكن ان تتبلمر علي الاكسده. يسبب البلمره HbS مرض RBCs ويقلل من الخلايا الكريات الكروية. ان الجمع بين الاصابه بالمرض والتصاق بالبطانة يؤدي إلى مضاعفات SCD مختلفه ، بما في ذلك ألازمات المزمنة (VOC) ، والسكتة الدماغية ، وتلف الأعضاء ، وفقر الدم الانحلالي. حتى في ظروف نورموكسيك ، الخلايا ار بي سي يتعرض للخطر في المرضي الذين يعانون من SCD. كما انخفض الخلايا في تركيزات الأكسجين المنخفضة. اللاعبون الرئيسيون الذين يحددون الخلايا في normoxia هم خلايا كثيفه ، خلايا مصابه بالمرض بشكل لا رجعه فيه ، والخلايا المجففة ، وكلها لها انخفاض نسبه سطح إلى حجم^1،2،3.

اكتاكيتومتري هو أسلوب راسخ لقياس الخلايا ار بي سي ، وتستخدم علي نطاق واسع لتشخيص الأنيميا الانحلالية الوراثية ، ولا سيما ميمبرانوباثيس⁴. ويمكن أيضا ان تستخدم لدراسة هيمورهيولوجي^5,6,7,8,9. وقد استخدمت اوسموتيك التدرج ektacytometry ، والتي يتم فيها قياس ار بي سي الخلايا خلال التغيير المستمر في العلاقة العامة ، لدراسة SCD لأكثر من عقد^10،11. النسبة المئوية من الهيموغلوبين الجنيني (HbF) هي واحده من اقوي مثبطات البلمره Hbf لأنه لا HbF ولا رباعيه هجين مختلطة (∝ 2βSγ) يمكن ان تدخل المرحلة البوليمر deoxyHbS¹². تشير الدراسات الاخيره إلى ان زيادة مستويات HbF في مرضي SCD يؤدي إلى نسبه أفضل من سطح إلى حجم ، التالي تحسين حاله الترطيب التالي الخلايا في المرضي غير المتحولين¹¹.

وقد درست الخلايا ار بي سي في الماضي كمؤشر حيوي لمضاعفات SCD ، ولكن مع نتائج متضاربة. في الدراسات التي أجريت عبر سيكتيونالي وفي حاله مستقره ، تم العثور علي الافراد الذين لديهم مستويات اعلي من الخلايا الكروية لديهم نسبه اعلي من الاصابه بالعظام والمزيد من أزمات الم^13،14،15. وعلي النقيض من هذه النتائج ، بالمقارنة مع قيم الدولة الثابتة خلال الحاده المتطايرة ، انخفضت الخلايا الكريات الكروية في الدراسات الطولية داخل نفس الافراد¹⁶. قد يكون هذا التباين نتيجة لدراسة الخلايا ار بي سي تحت ظروف مختلفه (اي اثناء الحالة الثابتة مقابل VOC). النسبة المئوية للخلايا المريضة مرتفعه في بداية الخلايا المتطايرة ويتم تدميرها بسرعة مع تقدم ألازمه ، وهو ما قد يفسر الفرق بين بيانات الحالة الثابتة عبر القطاعات والبيانات الطولية التي يتم الحصول عليها اثناء الصمام المتطاير. ومع ذلك ، قد تكون عوامل أخرى ، مثل الانضمام إلى السكان الفرعيين ار بي سي إلى السطح البطانية ، أيضا مهمة في حدوث VOC. في SCD ، فمن أكثر اهميه سريريا لقياس الخلايا اثناء الاكسده ، لان الانسداد فاسو يحدث عاده في الحويصلات الشعرية اللاحقة لنقص الأكسجين وليس في اقل نقص الأكسجين المجهرية شبكه¹⁷. بالاضافه إلى ذلك ، قد يغير وجود ISCs قدره ektacytometer لقياس الخلايا في normoxia. ويتسبب تشويه نمط الانكسار من قبل iscs ، والذي ينتج عن عدم المحاذاة اثناء التدفق^1،2،3.

وتشمل النهج البديلة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لل VOC قياسات الانضمام إلى الخلايا الخلوية الاصطناعية¹⁸، خليه واحده مقاومه الكهربائية الخلوية التدفق الحجمي¹⁹، النماذج القائمة علي microfluidic الجمع بين الكمية قياسات الخلية المريضة والمصابة بالسيلان مع خليه واحده ريولوجي²⁰، والليزر المستحث البلمره²¹. وعلي الرغم من ان هذه التقنيات واعده ، فانها مكلفه وكثيفه العمالة وتتطلب تدريبا مكثفا للمشغلين. الاضافه إلى ذلك ، فان المقايسات التي تستند إلى المورفولوجية تفتقر إلى القدرة علي دراسة السلوك الخلوي ، مثل الخلايا ، كداله لتدرج الأكسجين.

في هذه الدراسة ، ونحن وصف الفحص الوظيفي السريع واستنساخه التي أجريت مع ektacytometer. هذا هو الجيل القادم من قياس ektacytometry الذي يقيس الجوانب النوعية المختلفة للخلايا ار بي سي وأعرب عن EI خلال الأوكسجين (1,300 s) وسريعة الأوكسجين (280 s). هذه الفواصل الزمنيه تسمح لتشكيل البوليمر HbS ، التالي حدوث التغييرات المورفولوجية ومن ثم الانتعاش. يحدث الاكسده عن طريق إدخال غاز النيتروجين ، الذي يقلل ببطء من توتر الأكسجين في عينه الدم في الفجوة بين بوب وكوب من ektacytometer. يتم قياس الخلايا ار بي سي بشكل مستمر في حين يتم قياس التوتر الأوكسجين كل 20 ثانيه عن طريق الصغيرة O₂-بقعه الحاضر في جدار الكاس. اثناء الاختبار, تقريبا 80 [بو]₂ اقترنت قياسات إلى ال [اي] يقاس [آت ي فور]. ينخفض ضغط الأكسجين إلى اقل من 20 مم زئبق اثناء الاكسده ، ويتم تسهيل أعاده الأوكسجين من خلال الانتشار السلبي للهواء المحيط. يتم وصف الاعداد التجريبي للوحدة النمطية اكتاكيتومتري وتدرج الأكسجين في الشكل 1 والشكل 2. ويستند مبدا ektacytometry علي نثر المستحثة بالاشعه السينية من الضوء من شعاع الليزر. وينتج عن ذلك نمط انكسار اهليلجيه عند تطبيق الضغط القص في نفس الوقت (الشكل 1).

Protocol

تمت الموافقة علي جميع الإجراءات من قبل اللجنة الاخلاقيه للمركز الطبي الجامعي اوترخت (UMCU) ووفقا لإعلان هلسنكي. تمت الموافقة علي المرضي المسجلين في مركز امراض الدم في تكساس للأطفال (تشج) من قبل الهجرة المحلية ووفقا لإعلان هلسنكي.

1-اعتبارات عامه

1. تبدا من خلال اجراء قياس اختبار لتسخين بوب والكاس. تاكد من ان درجه حرارة بوب وكوب هو 37 درجه مئوية. وهذا أمر مهم لاستنساخ الجيدة.
2. التاكد من ان الحل بوليفينيلبيروليدون (PVP) اللزج يقع ضمن الحدود الصارمة لل الاسموليه (282-286 mosm/kg) ، pH (7.35) واللزوجة (27.5-32.5 MPa) في درجه حرارة الغرفة (22 درجه مئوية).
   ملاحظه: يجب استخدام PVP في درجه حرارة الغرفة. إذا تم تخزينها في درجه حرارة اقل ، تاكد من انها قد استعدت لدرجه حرارة الغرفة قبل اتخاذ اي قياسات.

2. بدء التشغيل من اكتاكيتومتر

1. التبديل علي الكمبيوتر و ektacytometer من الخلف. بدء تشغيل البرنامج (جدول المواد) علي الكمبيوتر.
2. تاكد من ان النيتروجين هو متاح لديوكسيجيناتي العينة عن طريق فتح اسطوانه النيتروجين.
3. خفض بوب في الكاس وتاكد من ان الكاس يمكن ان تتحول بحريه. تنظيف الكاس من الداخل والخارج مع قطعه قماش ناعمه والماء المقطر ، لان الحطام يمكن ان تعيق قياسات EI.
4. عند تشغيل البرنامج ، تحقق من الرسالة التالية علي الشاشة: "تاكد منفتح صمام الغاز" وانقر فوق OK.
5. تاكد من ان ektacytometer يبدا عمليه التحقق الذاتي₂ pO التي ستظهر علي الشاشة. حدد البدء (enter). إذا فشل ذلك ، أعد تشغيل التحقق الذاتي بالنقر فوق التحقق من الاجهزه | pO₂ | التحقق الذاتي.
   ملاحظه: إذا فشل الاختيار الذاتي مره أخرى ، خذ بالاعتبار استبدال O₂-الموضعية. يتم استبدال البقعة O₂عن طريق دفع بلطف بقعه من داخل الكاس مع الاصبع. يتم وضع بقعه جديده عن طريق دفع بلطف بقعه من الخارج إلى الكاس.
6. اختر المسح الضوئي ل pO₂ من الاختبارات المختلفة المسرودة علي اليسار. اختر الإعدادات علي يمين الشاشة وتاكد من تعيينها وفقا للمعلمات المدرجة في الجدول 1. احتفظ بنفس الإعدادات لكل قياس.
7. من أجل حفظ هذه الإعدادات ، اضغط OK | حسنا.
   ملاحظه: يتم سرد الإعدادات المفضلة في الجدول 1 ولكن يمكن تعديلها وفقا لتفضيلات المستخدم والأغراض البحثية. علي سبيل المثال ، لدراسة السلوك مقزز أكثر علي نطاق واسع ، ويمكن تغيير سرعه الأوكسجين ومدتها.

3-جمع العينات واعدادها

ملاحظه: بالنسبة للتحقق من صحة هذه التقنية ، فان الدم المعالج بحمض ايثيل الصوديوم (أدتا) من 38 مريض SCD و 5 ضوابط صحية مدرجه في مركز الجامعة الطبي في اوترخت أو مركز تكساس لامراض الدم للأطفال ، في دراسات سريريه مختلفه ( واستخدمت الهوية الهولندية للسجل الابتدائي [NTR] ، و NTR 6779 و NTR 6462) ، فضلا عن عينات الدم المتبقية المجهولة الهوية من المرضي الذين زاروا عيادة العيادات الخارجية أو المستشفيات.

1. جمع عينات الدم بواسطة بزل (الحد الأدنى من 300 μl/عينه) في أنبوب يحتوي علي أدتا. تاكد من تخزين الدم لمده لا تقل عن 30 دقيقه في 4 درجه مئوية ، ولكن لم يعد من 24 ساعة.
   ملاحظه: الفوسفات سيترات السكر اللحمية (CPDA) أو الهيبارين يمكن أيضا ان تستخدم ، ولكن تاثير هذه الكواشف علي حفظ العينة فيما يتعلق بالأكسجين التدرج اكتاكيتومتري ليس معروفا.
2. خلط العينة بلطف عن طريق عكس إلى تجانس. لا تهز العينة. السماح للعينه الإحماء إلى درجه حرارة الغرفة علي مقاعد البدلاء الاسطوانه قبل القياس.
   ملاحظه: أنبوب عينه (9 – 10 مل) التي يتم تخزينها لأكثر من 1 ح في 4 درجه مئوية يجب الإحماء لمده 15 دقيقه. عند تخزينها لأقل من 1 ساعة في 4 درجه مئوية ، يجب ان تسخن لمده 10 دقائق. أنبوب عينه (2-6 مل) التي يتم تخزينها لأكثر من 1 ح في 4 ° c يجب ان الإحماء لمده 10 دقيقه. عند تخزينها لأقل من 1 ساعة في 4 درجه مئوية ، يجب ان تسخن لمده 5 دقائق.
3. قياس عدد الدم الكامل علي محلل امراض الدم. للقيام بذلك ، خذ 20-200 μL من الدم كله في أنبوب يحتوي علي أدتا. ضع ابره الشفط في الأنبوب واضغط علي الزر الموجود خلف ابره محلل الدم لبدء القياس.
   ملاحظه: في تعداد الدم الكامل ، يتم قياس عدد ار بي سي ، وهو عامل مهم لتوحيد قياسات الأكسجين التدرج اكتاكيتومتري. يتم احتساب عدد الكريات الكروية من الامام ومبعثر الجدار الجانبي بواسطة قياس التدفق الخلوي. العد الطبيعي لل ربك في الضوابط الصحية هو 3.7 – 5.0 × 10¹²/لتر للإناث و 4.2 – 5.5 × 10¹²/لتر للذكور. انخفاض عدد الكريات الكروية في المرضي الذين يعانون من SCD عموما. بعض محللات امراض الدم وسوف تقيس أيضا في المئة خلايا الدم الحمراء الكثيفة (٪ DRBC) التي يمكن ان تكون ذات قيمه اضافيه في تفسير منحنيات الأكسجين الفردية التدرج ektacytometry.
4. توحيد عينه الدم بأكملها إلى عدد الكريات العرب العرب من 200 x 10⁶ rbcs في 5 مل PVP (200 x 10⁶ rbcs/فيال) عن طريق ضبط حجم العينة التي ستضاف. إذا كان العدد الإجمالي لل ار بي سي اقل من 200 × 10⁶، سيتاثر نمط الانكسار و EI.
   1. استخدم المعادلة أدناه لاجراء عمليه العد.
      4.0/xx (x 10¹²/L) x 50 = Yy μl الدم الكامل/قارورة PVP
      حيث xx هو حساب ربك المحسوبة التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.3 و yy هو مقدار الدم الكامل المطلوب للقياس الفعلي. اعتمادا علي درجه فقر الدم وغيرها من العوامل التي تؤثر علي التهم ار بي سي ، كميه الدم الكامل المطلوب هو 40-90 μL.

4. قياس الأكسجين التدرج اكتاكيتومتري

1. ماصه حجم عينه محسوبة (yy μL من الدم) في PVP للحصول علي حجم الكلي من 5 مل. Prewet الطرف عن طريق أعاده تعليق برفق الدم 3x. استخدم طرف ماصه مع فتحه واسعه لتجنب الضغط الإضافي علي RBCs. خلط برفق العينة يدويا عن طريق عكس حتى انها متجانسة.
   ملاحظه: فتح قارورة PVP لأقصر وقت ممكن لتجنب الاتصال الجوي.
2. ببطء رسم 2.0 مل من خليط الدم/PVP في حقنه 3 مل دون الابره. دفع المكبس لأزاله اي فقاعات الهواء المرئية والإفراط في حل العينة حتى 1.5-1.8 مل يترك في الحقنه (اعتمادا علي حجم كوب).
3. حقن إجمالي حجم العينة ببطء التساوي في بوب من خلال الموصل. تاكد من ان مستوي العينة فوق مستشعر الأكسجين (البقعة الوردية) وفوق ثقب الشفط الصغير. لا تترك اي محلول عينه في الحقنه.
4. انقر فوق جديد وأملا نموذج المعرف والملاحظات وتاريخ التبرع ولزوجه PVP. انقر فوق موافق | الاسبرين. بعد 60 s ، سيتم تدوير الكاس ويستنشق العينة ل 15 ثانيه. انقر فوق "موافق " عند توقف الاستدارة. اغلق غطاء الجهاز. انقر فوق متابعه | تبدا الآن، كما يتم الأكسجين التدرج ektacytometry مع مكاسب ثابته. وسوف يستغرق القياس حوالي 28 دقيقه.
5. بعد القياس ، اطبع التقرير الذي يظهر المنحني والمعلمات التي يتم حسابها تلقائيا بواسطة البرنامج. تاكد من تخزين البيانات الاوليه تلقائيا في المجلد المعين في الإعدادات. الحد الأقصى EI (EI_max) ، الحد الأدنى EI (ei_Min) ، pO₂@ 95% ei (PoS) ، والمنطقة (المنطقة تحت المنحني) يتم احتسابها تلقائيا وأضافها إلى التقرير المطبوع والبيانات الخام.
6. الحصول علي ΔEI يدويا عن طريق حساب الفرق بين EI_max و ei_min. حساب النسبة المئوية للاسترداد عن طريق أخذ الفرق في يعني EI قبل الأوكسجين (pO₂ 100-120 مم زئبق) ويعني القيم ei اثناء أعاده الأوكسجين في 100-120 مم زئبق.

5. تنظيف اكتاكيتوميتر

1. قم بازاله حقنه العينة واستبدلها بحقنه مملوءة بالماء المقطر أو الماء منزوع الأيونات.
2. اضغط نظيفه، ببطء تنظيف الموصل اثناء الشطف. تاكد من تدفق في كلا الاتجاهين.
3. أزاله الحقنه ورفع بوب. جفف البوب والكوب والموصل جيدا بقطعه قماش ناعمه.
4. استخدام حقنه كبيره (10-50 مل) لمسح الموصل من أجل أزاله اي المياه المتبقية في الأنابيب وبوب. منع انخفاض مدخل/مخرج من بوب للحصول علي الضغط مره أخرى في الأنابيب ، التالي أزاله المياه المتبقية.
5. اخفض البوب في الكاس الجهاز جاهز الآن للقياس التالي.

6. إغلاق الجهاز

1. تاكد من شطف الجهاز بشكل صحيح بعد القياس الأخير ، كما هو موضح أعلاه. تاكد من ان الأنابيب المناسبة تتعلق بمحلول التنظيف.
2. اغلق البرنامج ، واضغط علي إغلاق ، واضغط علي أبدا لبدء تشغيل برنامج التنظيف في نهاية اليوم.
3. بعد الانتهاء من برنامج التنظيف كله ، وأزاله حقنه ورفع بوب. امسح الموصل بحقنه كبيره.
4. إفراغ زجاجه النفايات وتجفيف بوب وكوب مع قطعه قماش ناعمه. مسح الموصل من أجل أزاله المياه المتبقية في الأنابيب وبوب. منع انخفاض مدخل/مخرج من بوب للحصول علي الضغط مره أخرى في الأنابيب ، التالي أزاله اي المياه المتبقية.
5. اغلق غطاء الجهاز. اغلق اسطوانه النيتروجين. قم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر والجهاز.

النتائج

يمكن استخدام الأكسجين المتدرج اكتاكيتومتري لتوصيف السلوك المقزز في المرضي الذين يعانون من SCD. في هذه الدراسة ، تم تضمين عينات من الدم من إجمالي المرضي SCD 38 وخمسه ضوابط صحية. في الضوابط الصحية ، ونمط الانكسار هو التعميم في بقية وبيضاوي الشكل في ارتفاع القص الإجهاد⁴. ومن نمط الانكسار الاهليلجيه ، يحسب مؤشر الاستطالة (EI) استنادا إلى ارتفاع وعرض نمط الانكسار. في الأكسجين التدرج ektacytometry ، ويتبع الأوكسجين بطيئه ومستمرة من العينة بغاز النيتروجين عن طريق أعاده الأوكسجين السريع بواسطة الهواء المحيط. وفي ظل هذه الظروف ، يمكن ملاحظه مرض الكريات المنجلية تحت الأكسجين. سيؤدي هذا إلى تشويه نمط الانكسار لان الخلايا الحمراء المريضة لن تتم محاذاتها بشكل صحيح تحت ضغط القص المطبق. التالي ، فانها تبدو اقل تشوه بدلا من RBCs صحية (الشكل 2).

يظهر الشكل 3ا كيف تغير المنجل المنجلي في الشكل عند الاكسده ، والتي تحاكي الظروف اثناء الأكسجين التدرج ektacytometry ، في حين ان السيطرة المنجل rbcs دون الاكسده تظهر اي تغيير في الشكل. ينتج هذا عمليه في تشويه من الانكسار نمط اثناء أكسجين تدرج [اكتاكيوتومتري], ولذلك في تناقص في [اي]. ويبين الشكل 3باء أنماط الانكسار المختلفة التي تولد منها معلمات مختلفه.

ويظهر منحني تمثيلي تم الحصول عليه من قبل ektacytometer في الشكل 3ج. المعلمات الستة تعكس خصائص مختلفه من سلوك مقزز من RBCs: EI_max هو الحد الأقصى ei في بداية القياس قبل الاكسده. وتمثل هذه المعلمة الموقف الأساسي وتعكس الخلايا الاجماليه لمجموع السكان في الهواء المحيط. EI_min هو الحد الأدنى ei ، الذي يمثل الحد الأدنى الخلايا بعد الاكسده. تعكس هذه المعلمة التغييرات في شكل واتجاه RBCs (المنجل) عند الاكسده. ΔEI هو الفرق بين EI_max و ei_min، مما يشير إلى عدد الخلايا التي يمكن ان المنجل خلال جولة واحده من الاكسده. 5% نقطه من المرض (PoS_5%) هو أمر الشراء₂ (زئبق) حيث يتم قياس 5% انخفاض EI_ماكس اثناء الاكسده. وهذا يمثل توتر الأكسجين حيث تبدا عمليه الغثيان. منطقه يعكس المنطقة تحت المنحني, اي يكون حددت بحساب متكاملة من [اي] و [بو]₂ قياسات بين 100 [زئبق] و [بو]₂[مين] ([مم]). وهذا هو نتيجة المعلمات الموصوفة سابقا EI_max، ei_Min، ونقطه البيع يمثل الفرق من ei خلال الجزء الأخير من أعاده الأوكسجين مقارنه مع ei في خط الأساس. يتم قياس كل من القيم EI في pO₂ من 100-120 مم زئبق. تعكس هذه المعلمة قدره RBCs ان المنجل اثناء الاكسده لعكس المرض اثناء أعاده الأوكسجين²². المعلمات من القياسات المكررة عموما كان معامل الاختلاف (CV) < 5 ٪ (المتوسط 1.83 ٪). وفي حاله الحصول علي السيرة الذاتية > 5 ٪ ، تم اجراء قياس ثالث. المعلمات EI_max والانتعاش هي الأكثر استنساخه مع وسيط السير الذاتية < 1 ٪.

المنحنيات التمثيلية من RBCs من الضوابط الصحية ، والمرضي الذين يعانون من الصفات HbS (HbS غير المتجانسة) ، والمريض SCD المتماثلة وتظهر في الشكل 4ا. ويظهر المنحني التمثيلي لمريض HbSC انخفاضا في الانتعاش ، مما قد يشير إلى عمليه مرضيه مختلفه (الشكل 4ب). ويبين الشكل 4(ج ) والشكل 4(د) المنحنيات التمثيلية لمرضي hbss الذين عولجوا مع هيدروكسي يوريا (HU) ونقل الدم. من الواضح ان هناك فرقا كبيرا بين المنحنيات التمثيلية لسمات النظام المنسق (خلايا HbAS) و RBCs لمرضي HbSS الذين عولجوا بنقل الدم (يتكون من خليط من المنجل المنجلي (HbSS) والخلايا الطبيعية العادية (Hbas) ، الشكل 4ا ،دال). وتبرز الاختلافات الواضحة في منحنيات المريض scd غير المعالج والمرضي المعالجين بنقل الدم فائده هذا الفحص (الشكل 4ج،د). مستويات HbF و Hbf مرتبطة بشكل كبير مع EI_min و, إلى حد اقل, مع نقاط البيع (الشكل 5ا–د). وهذا يشير إلى ان هذه المعلمات المختبرية التي هي مهمة في تقييم المريض تنعكس أيضا في الأكسجين التدرج اكتاكيتومتري. عدد الخلايا المريضة في normoxia والنسبة المئوية من RBCs الكثيفة (DRBCs) كلا التاثير علي قيم EImax ، كما انها ترتبط بشكل كبير (الشكل 5E-F) ، الذي يشير إلى ان eimax يعكس عاملا هاما آخر في عمليه مقززة. تظهر هذه النتائج كيف خصائص مختلفه مثل% HbS ،% Hbs ، الخلايا المريضة في normoxia ، و% DRBCs تؤثر علي المعلمات المختلفة.

الشكل 1 الاعداد التخطيطي لل ektacytometer. يستخدم ektacytometer نظام Couette لتطبيق الضغط القص علي الخلايا. يتم استخدام اسطوانه التناوب الخارجي (كوب) واسطوانه داخلية ثابته (بوب) للحث علي الإجهاد القص عن طريق خلق تدفق الصفي 37 درجه مئوية. بين بوب وكوب هناك فجوه صغيره فيها يتم حقن تعليق الدم. شعاع الليزر يضيء من بوب من خلال تعليق الدم ومتناثرة بوجود RBCs. ويتم إسقاط نمط الانكسار وتحليله بواسطة كاميرا. ويحسب مؤشر الاستطالة (EI) مع ارتفاع (ا) وعرض (ب) من نمط الانكسار⁴. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 الاعداد التخطيطي لل ektacytometer مع الأكسجين التدرج ektacytometer وحده. الرسم التخطيطي للوحدة التي تظهر الأوكسجين من تعليق الدم ببطء مع ضخ غاز النيتروجين (N₂). يقاس توتر الأكسجين بمقدار التبريد لاشاره الاناره المرسلة من ألياف الضوئية إلى النقطة O₂. عند الاكسده ، والمنجل RBCs سوف تبدا في المنجل ، وسوف تنخفض الخلاياهم ، وانها لن تعود محاذاة مع RBCs بيضاوي الشكل. ستشوه RBCs المقززة نمط الانكسار ، وتغير شكلها من قطع ناقص إلى معين أو شكل شبيه بالماس. ويؤدي هذا التغيير في شكل نمط الانكسار إلى انخفاض في الناتج العام المعدل. لا يتم اجراء قياسات pO₂ و EI في نفس الارتفاع في الكاس. وهذا يضمن تمييزا أفضل بين منحنيات الاكسده وأعاده الأوكسجين ، التالي ، تفسيرا أفضل للمنحني. تم تعديل هذا الرقم من Rab et al.²²الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 الأكسجين الممثل منحني الانحدار ektacytometry وأنماط الانكسار. (ا) عند أزاله الأوكسجين في ظروف مشابهه لمقياس الأكسجين المتدرج ، تم إصلاح المنجل rbcs. في السيطرة المنجل RBCs ، استخدمت نفس الشروط ، ولكن من دون غاز النيتروجين. المنجل المنجلي RBCs تظهر تغيير في الشكل علي النقيض من السيطرة RBCs. (ب) عند أزاله الأوكسجين وإجهاد القص (30 باسكال) ، يتغير نمط الانكسار من قطع ناقص إلى معين. (ج) المنحني التمثيلي لتدرج الأكسجين اكتاكيتومتري. يمثل الحد الأقصى لمؤشر الاستطالة (EI_max) الموضع الأساسي ويظهر الخلايا إجماليا لإجمالي عدد السكان في الفئة السكانية. الحد الأدنى EI (EI_min) يمثل الحد الأدنى من الخلايا ، والذي يحدث بسبب التغيير في الشكل والاتجاه من rbcs عند الاكسده. ΔEI (dEI ، والفرق في EI بين EI_max و ei_min) يبين كم عدد الخلايا التي يمكن ان المنجل خلال جولة واحده من الاكسده. نقطه من مرض (PoS, pO₂ في 5% EI انخفاض) يظهر التوتر الأكسجين عندما يبدا rbcs الاولي إلى المنجل. يتم حساب المنطقة تحت المنحني (من pO_2min = 100 مم زئبق) في منطقه المعلمة. هذا يلخص EI_max، ei_Min، ونقاط البيع. ويتم تمثيل قدره الخلايا المريضة علي الوخز اثناء أعاده الأوكسجين في المعلمة الاسترداد (النسبة المئوية لل EI_ماكس التي تم التوصل اليها اثناء أعاده الأوكسجين). وللمساعدة في التفسير ، كانت جميع نقاط البيانات متصلة في كل تجربه فرديه بخط لتقديم النتائج بشكل بياني. تم تعديل هذا الرقم من Rab et al.²²الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 الأكسجين التدرج المعلمات ektacytometry ترتبط مع النمط الجيني والعلاج النظم من المرضي SCD مع SCD. (ا) الرسم البياني التمثيلي لشركات النقل الجوي (hbs) والضوابط الصحية فيما يتعلق بمرضي hbss غير المعالجين. (ب) الرسم البياني التمثيلي ل rbcs للمرضي الذين يعانون من مرض الهيموغلوبين Sc (hbsc) فيما يتعلق بمرضي hbsc غير المعالجة. (ج) الرسم البياني التمثيلي ل rbcs من هيدروكسي يوريا معالجه مرضي scd (HBSS HU) فيما يتعلق بمرضي hbss غير المعالجة. (د) الرسم البياني التمثيلي لمرضي الامراض المنقولة عن بعد الذين عولجوا بنقل الدم بالنسبة لمرضي hbss غير المعالجين. تم تعديل هذا الرقم من Rab et al.²²الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5 وترتبط معلمات الأكسجين التدرج ektacytometry مع% HbF,% Hbf,% الخلايا المريضة في normoxia و% RBCs الكثيفة. (ا) الارتباط الخطي لمؤشر استطاله الحد الأدنى (EI_min) و% Hbf من 15 Hbss أو hbf/β-مرضي الثلاسيميا دون نقل الدم. (ب) الارتباط الخطي لل ei_Min و% hbs. (ج) الارتباط الخطي لنقاط البيع و% hbs. (د) الارتباط الخطي لنقاط البيع و% hbs. (ه) الارتباط الخطي للحد الأقصى ei (ei_max) والنسبة المئوية للخلايا المريضة في نورموسيا يقاس بالمجهر الرقمي. (و) الارتباط الخطي لل EI_max والنسبة المئوية الكثيفة Rbcs (٪ drbcs) من 21 مريضا مع hbss. تم تعديل هذا الرقم من Rab et al.²²الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

اعدادات
الملفات	دليل التخزين
الخيارات العامة	اللزوجة المتوسطة الافتراضية	اللزوجة من PVP
pO2 المسح الضوئي	الحد الأدنى من الوقت الطموح (ق)	60
	pO2 الضغط القص المسح الضوئي (Pa)	30
	تحديد pO2 كل (S)	20
	متوسط الحجم المتحرك	2
	pO2 المسح الضوئي خطوه; تحرير	0-إيقاف; 60. 1360-إيقاف; 1640-OFF
	المنطقة بين (زئبق)	10 و 100
	pO2 التحكم	إيقاف التشغيل (غير محدد)

الجدول 1 الاعداد المفضل لل ektacytometer.

Discussion

هنا نحن وصف الأكسجين التدرج ektacytometry ، وهي الطريقة التي يمكن استخدامها لدراسة سلوك مقزز من خلايا الدم الحمراء من المرضي SCD تحت مجموعه من تركيزات الأكسجين (الشكل 4 والشكل 5). من أجل الحصول علي نتائج قابله للتكرار ، من المهم تحديد العوامل التي تؤثر علي النتائج. علي سبيل المثال ، درجه الحرارة لها تاثير كبير علي الخلايا ار بي سي ، ويرجع ذلك في الغالب إلى اثارها علي سمك محلول لزج (PVP). نوصي باجراء قياس اختبار في بداية اليوم لتسخين الجهاز بدقه إلى 37 درجه مئوية. سيؤدي ذلك إلى تحسين استنساخ النتائج. يجب ان يكون المحلول اللزج داخل نطاق ضيق (282 – 286 mOsm/kg لPVP) ، لان الطحالب تؤثر علي حاله الترطيب ، والتي تؤثر بدورها علي الخلايا الخلوية. وينبغي أيضا ان الأس الهيدروجيني واللزوجة من PVP ينظم باحكام. الاختلافات في الأس الهيدروجيني ودرجه الحرارة يمكن ان تؤثر علي منحنيات بشكل كبير²². بالاضافه إلى ذلك ، المياه المتبقية في الكاس ، بوب ، والأنابيب ، قد يسبب تحلل RBCs ، مما يؤدي إلى بيانات غير صحيحه ، لأنه سيتم قياس اقل من RBCs سليمه الموجودة في الكاس.

يمكن تعديل إعدادات لأداء الأكسجين التدرج ektacytometry لمعالجه الاسئله البحثية محدده. يتم سرد الإعدادات المفضلة في الجدول 1. تم اختيار وقت دياوكسجين من 1,300 s استنادا إلى الملاحظات التي تبين ان تمديد الأوكسجين لم يسفر عن انخفاض الحد_الأدنى EI لمعظم المرضي. وعلي النقيض من ذلك ، فان تقصير وقت الأوكسجين من شانه ان يعوق القوه التمييزية لمقياس الأكسجين المتدرج. تم تعيين الوقت لأعاده الأوكسجين إلى 280 s بسبب البوليمرات HbS حل بسرعة اثناء أعاده الأوكسجين ، ويصاحب ذلك استعاده EI نحو القيم التي تقاس قبل الاكسده. تم تعيين الإجهاد القص إلى 30 باسكال ، وهو ما يماثل التدرج اللوني العثماني. خفض هذه المعلمة يمكن ان يعوق السلطة التمييزية. يمكن استخدام التحكم في الاكسده إذا تم تطبيق مجموعه من سرعه الأوكسجين علي كل عينه مريضه. في الإعدادات المفضلة لدينا ، تم إيقاف هذا الخيار لان معدل الاكسده هو محدد المريض بسبب منحني التفكك الهيموغلوبين فريدة من نوعها. التالي ، فان التحول علي السيطرة علي أزاله الأوكسجين القضاء علي هذه الخاصية من الفحص. ومع ذلك ، هذه الميزة من الأكسجين التدرج اكتاكيتومتري لا يزال قيد التحقيق.

العديد من العوامل المعروفة تؤثر علي المعلمات التدرج الأكسجين اكتاكيتومتري ، وهي الأس الهيدروجيني ، ودرجه الحرارة ، و osmolarity. [اكتاكيتومتري], بشكل خاص [بوس], أثرت ب 2, 3-[ديفوسغليسرريت] (2, 3-دبغ])²². أيضا ، هناك ارتباط واضح بين% HbF و EI_min، والي حد اقل نقاط البيع (الشكل 5ا–د). ويرتبط EI_max مع الخلايا المنجلية في normoxia ، والتي يمكن ان تفسر الملاحظة التي بعد فتره وجيزة من VOC ، الخلايا ار بي سي في NORMOXIA (EI_max) ، هو اعلي. والسبب الأخير هو تدمير الخلايا الأكثر مرضا ، التالي اقل تشوه RBCs خلال VOC¹⁶. كما هو مبين في الشكل 5و, اعلي ٪ rbcs الكثيفة (تعرف باسم rbcs مع تركيز الهيموغلوبين ≫ 1.11 مغ/مل) ترتبط بقوة مع انخفاض EI_max. وهذا يشير إلى ان الخلايا الكثيفة هي عامل مهم في الخلايا ار بي سي في normoxia, مماثله للنتائج المبلغ عنها سابقا¹.

توحيد العينات مهم جدا للحصول علي نتائج قابله للتكرار والتمييز بين مختلف الأنماط الجينية والعلاجات. التصحيح لعدد الكريات الكروية مهم ، حيث ان عدد RBCs يؤثر علي شده نمط الانكسار. إذا كانت أرقام ار بي سي اقل موجودة في الفجوة بين بوب والكاس ، فان منحني التحول إلى الأعلى والي اليسار. بالاضافه إلى ذلك ، ستتقلب المنحني ، مما يعوق الحساب الدقيق للمعلمات ، وخاصه نقاط البيع.

والحد من هذه التقنية هو ان قيمه EI تمثل متوسطا لجميع الخلايا ، بما في ذلك الفئات الفرعية المختلفة. وقد تم بشكل مكثف دراسة التغاير من السكان ار بي سي في المرضي SCD وتاثيره علي قياس اكتاكيتومتري. وادي ذلك إلى التوحيد القياسي حيث تم تعديل حجم نمط الانكسار إلى قيمه ثابته بدلا من تصحيحها لعدد الكريات^23،24. وما إذا كانت هذه الطريقة للتوحيد القياسي ينبغي ان تطبق أيضا علي قياسات الأكسجين المتدرج التدرج قيد الدراسة حاليا.

تم تطوير العديد من التقنيات لقياس ار بي الخلايا تحت ظروف نقص الأكسجين علي أساس خطوه الاكسده التي وقعت خارج ektacytometer^25,26,27. في ظل هذه الظروف ، لم يلاحظ الاختلافات في السلوك الخلوي بين المرضي الذين يعانون من الصفات HbS والضوابط الصحية تحت pH الفسيولوجية²⁵. الأكسجين التدرج ektacytometry ، ومع ذلك ، يظهر بوضوح نقاط البيع منخفضه ولكن واضحة في الافراد مع الصفات HbS (الشكل 4ا). حتى الآن ، في الممارسة السريرية الروتينية ، والطرق البديلة الوحيدة لقياس الميل من RBCs المريض الفردية إلى المنجل في المختبر وتشمل فحص المورفولوجية القائم علي التشكل: يتم احتضان RBCs تحت الظروف التي تعزز البلمره HbS ، مثل انخفاض التوتر الأكسجين أو انخفاض درجه الحموضة. يتم أضافه المثبت بعد الحضانة والنسبة المئوية للخلايا المريضة يتم احتسابها يدويا أو رقميا باستخدام المجهر الضوئي. العديد من التجارب الدوائية قبل السريرية والمرحلة المبكرة استخدام فحص مقزز لتوليد متغير النتيجة الثانوية لتكون قادره علي التنبؤ بالفعالية السريرية في scd^{28,29,30,31 ،32}. ومع ذلك ، فمن مضيعه للوقت ، وتقلب عاليه وحساسية منخفضه ، وتقنيه ليست مؤتمتة ، التالي ، والعمالة المكثفة. وعلاوة علي ذلك ، فان التغييرات المورفولوجية الناجمة عن المرض قد لا ترتبط بشكل جيد مع المعلمات الفسيولوجية ، مثل الخلايا ار بي سي ، لأنها اختبار ثابت ثنائي الابعاد².

الأكسجين التدرج ektacytometry يوفر فحص وظيفية من المرض الذي هو سريع واستنساخه. هذا هو اختبار في المختبر الذي لا يعتبر سطح بطانية. ومع ذلك ، فانه يوفر جوانب وظيفية من السلوك المقزز وخصائص ار بي سي ، مما يجعلها تقنيه واعده للدراسات الخلايا المنجلية. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية رصد فعاليه العلاج في المرضي SCD ، بمثابه الحيوية لاستراتيجيات العلاج الجديدة ، ودراسة السلوك المقزز ، ورصد تشيميريسم بعد زرع الخلايا الجذعية في SCD.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADVIA 120 Hematology Analyzer	Siemens	067-A004-14	Instrument
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer	Abbott	8H00-01	Instrument
Lorrca	RR Mechatronics	LORC109230 or LORC109110	Instrument
Lorrca Software version V5.08	RR Mechatronics	-	Software
Nitrogen gas 4.8 or 5.0	Local	-
O2-spot	RR Mechatronics	PO2S020153	O2 measurement
Oxygenscan module (pO2scan)	RR Mechatronics	PO2S109000	Add-on
Oxy-ISO	RR Mechatronics	QRR 030905	Viscous solution
X-Clean	RR Mechatronics	QRR 010946	Cleaning solution Lorrca