JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем оксигенный градиент эктацитометрии, быстрый и воспроизводимый метод измерения деформации красных кровяных телец в образцах у пациентов с серповидно-клеточной болезнью под контролируемой дезоксигенацией и реоксигенциацией. Этот метод обеспечивает способ изучения красных кровяных клеток серпового и для мониторинга эффективности лечения серповидно-клеточных заболеваний.

Аннотация

При серповидно-клеточной болезни (SCD) одноточечная мутация в кодировании генов для бета-глобина вызывает выработку аномального гемоглобина S (HbS). При дезоксигенировании, HbS может полимеризировать, образуя жесткие стержни гемоглобина, в результате чего серп красных кровяных телец (РБК). Эти серповые РБК значительно снизили уродственность, вызывая вазо-окклюзию, что приводит к многочисленным клиническим осложнениям, связанным с SCD, включая боль, инсульт и повреждение органов. Деформация РБК также снижается за счет обезвоживания РБК, что приводит к плотным эритроцитам, которые с большей вероятностью серповые. На сегодняшний день не существует ни одного широко доступного, быстрого и воспроизводимого лабораторного анализа, способного предсказывать тяжесть заболевания или непосредственно контролировать последствия лечения новых, нефетальных гемоглобинов, вызывающих терапию. В этом исследовании мы описываем протокол для измерения деформации РБК как функции PO2, что позволяет количественно ймеповидного поведения у пациентов SCD. Градиент кислорода эктацитометрия измеряет рбк деформацию, выраженную в виде индекса удлинения (EI), как функция pO2. РБК подвергаются фиксированному стрессу сдвига 30 Pa во время одного раунда дезоксигенации и реоксигенации. Производится шесть параметров считываемого. Из них точка серпового (PoS), определяется как PO2, при котором максимальный EI (EImax) показывает снижение на 5%, а минимальный EI во время дезоксигенации (EIмин)являются наиболее информативными, отражающими PO2 отдельного пациента, при котором серпотые начинается и минимальная деформация красных кровяных телец пациента, соответственно. PoS связано с гемоглобина сродство отдельных пациентов к кислороду, в то время как EIмин показывает сильную корреляцию с уровнями гемоглобина плода. Мы заключаем, что градиент кислорода эктачитометрия является перспективным методом для мониторинга лечения пациентов с SCD, как биомаркер для противобольных агентов в клинических и доклинических испытаниях, и важным инструментом для изучения серповидного поведения РБК от лиц с SCD и серповидно-клеточной черты.

Введение

В SCD, одна точка мутации приводит к производству HbS, которые могут полимеризации при дезоксигенации. Полимеризация HbS вызывает серп РБК и снижает деформацию РБК. Сочетание серпа РБК и приверженности РБК эндотелии приводит к различным осложнениям SCD, включая вазо-окклюзионные кризисы (ЛОС), инсульт, повреждение органов и хроническую гемолитическую анемию. Даже при нормокиси, деформация РБК скомпрометирована у пациентов с SCD. Унижаемость еще больше снижается при низких концентрациях кислорода. Ключевыми игроками, определяющими деформацию в normoxia являются плотные клетки, необратимо серотистые клетки (ISC), и обезвоженные клетки, все из которых имеют снижение поверхностного к объему соотношение1,2,3.

Эктачитометрия является устоявшимся методом измерения деформации РБК, широко используемым для диагностики наследственных гимолитических анемий, в частности мембранопатий4. Он также может быть использован для изучения геморхеологии5,6,7,8,9. Осмотический градиент эктацитометрии, в котором РБК деформации измеряется во время непрерывного изменения осмолальности, был использован для изучения SCD на протяжении более десяти лет10,11. Процент гемоглобина плода (HbF) является одним из сильнейших ингибиторов полимеризации HbS, потому что ни HbF, ни его смешанный гибридный тетрамер (No2'S) не могут войти в полимерную фазу deoxyHbS12. Недавние исследования показывают, что повышение уровня HbF у пациентов СКЗ приводит к лучшему соотношению поверхности к объему, тем самым улучшая состояние гидратации и, таким образом, умышленность у нетрансграниченных пациентов11.

Деформация РБК изучалась в прошлом как биомаркер для осложнений SCD, но с противоречивыми результатами. В исследованиях, проведенных поперечным и в стабильном состоянии, лиц с более высоким уровнем деформации РБК было установлено, что более высокая частота остеонекроза и более боли кризисов13,14,15. В отличие от этих выводов, по сравнению с устойчивыми значениями состояния во время острого ЛОС, деформация РБК была снижена в продольных исследованиях в рамках тех же лиц16. Это несоответствие может быть результатом изучения деформации РБК в различных условиях (т.е. при стабильном состоянии против ЛОС). Процент серсовых клеток высок в начале ЛОС, и клетки быстро разрушаются по мере развития кризиса, что может объяснить разницу между устойчивыми данными о поперечном сечении состояния и продольными данными, полученными во время ЛОС. Однако другие факторы, такие как присоединение субпопуляций РБК к эндотелиальной поверхности, также могут иметь важное значение для возникновения ЛОС. В SCD, это более клинически актуальной для измерения деформации во время дезоксигенации, потому что вазо-окклюзия обычно происходит в гипоксических postcapillary венулей, а не в менее гипоксической микрокапиллярной сети17. Кроме того, наличие МСЦ может изменить способность эктацитометра измерять деформацию при нормоксии. Искажение дифракционного шаблона вызвано МСК, что является результатом невыравнивания во время потока1,2,3.

Альтернативные подходы к изучению патофизиологии ЛОС включают измерения прилипания РБК к искусственной поверхности18, одноклеточной электрической импеданс микропотокции19, микрофлюидные модели, сочетающие количественные измерения серпа клетки и unsickling с одноклеточной реологией20,и лазер-индуцированной полимеризации21. Хотя эти методы являются перспективными, трудоемкими и требуют обширной подготовки операторов. Кроме того, анализы, основанные на морфологии, не обладают способностью изучать клеточное поведение, например, деформацию, как функцию градиента кислорода.

В этом исследовании мы описываем быстрый и воспроизводимый функциональный ассс, выполненный с помощью эктакитометра. Это следующее поколение эктацитометрии измерения, которое измеряет различные качественные аспекты деформации РБК, выраженные как EI во время дезоксигенации (1300 с) и быстрой реоксигенации (280 с). Эти временные интервалы позволяют hbS полимерного образования, и, таким образом, возникновение морфологических изменений, а затем восстановления. Дезоксигенация происходит путем введения азотного газа, который медленно снижает кислородное напряжение в образце крови в зазоре между бобом и чашкой эктакитометра. Деформация РБК постоянно измеряется, в то время как кислородноенапряжение измеряется каждые 20 с с помощью небольшого O 2-пятна, присутствуют в стене чашки. Во время теста, около 80 pO2 измерений связаны с EI измеряется в этот момент. При дезоксигенации давление кислорода падает ниже 20 мм рт. мг, а реоксигенации способствует пассивная диффузия окружающего воздуха. Экспериментальная установка эктацитометра и кислородного градиента эктацитометрии описана на рисунке 1 и рисунке 2. Принцип эктацитометрии основан на индуцированном РБК рассеянии света от лазерного луча. Это приводит к эллиптической дифракции картины, когда сдвига стресс применяется в то же время (Рисунок 1).

протокол

Все процедуры были одобрены этическим комитетом Университетского медицинского центра Утрехта (UMCU) и в соответствии с Хельсинкской декларацией. Пациенты, зачисленные в Техасский детский гематологический центр (TCHC), были одобрены местным IRB и в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Общие соображения

  1. Начните с выполнения тестового измерения для разогрева боба и чашки. Убедитесь, что температура боба и чашки составляет 37 градусов по Цельсию. Это важно для хорошей воспроизводимости.
  2. Убедитесь, что вязкий поливинилпирролидон (PVP) раствор подпадает под строгие пределы для осмоляритности (282-286 мОзм/кг), рН (7,35-7,45) и вязкости (27,5-32,5 МПа) при комнатной температуре (22 градуса по Цельсию).
    ПРИМЕЧАНИЕ: PVP должны быть использованы при комнатной температуре. При хранении при более низкой температуре убедитесь, что он прогрелся до комнатной температуры до проведения каких-либо измерений.

2. Запуск эктацитометра

  1. Включите компьютер и эктакитометр со спины. Запустите программу (Таблица материалов) на компьютере.
  2. Убедитесь, что азот доступен для дезоксигенатного образца, открыв азотный цилиндр.
  3. Опустите боб в чашку и убедитесь, что чашка может повернуть свободно. Очистите чашку внутри и снаружи мягкой тканью и дистиллированной водой, потому что мусор может препятствовать измерениям EI.
  4. Когда программа работает, проверьте следующее сообщение на экране:"Убедитесь, что газовый клапан открыт" и нажмите OK.
  5. Убедитесь, что эктакитометр запускает процесс самопроверки pO2, который появится на экране. Выберите Начало (введите). Если это не удается, повторно проверить себя, нажав аппаратных проверить pO2 Самопроверка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если самопроверка снова не удается,рассмотреть вопрос о замене O 2-пятно. O2-пятнозаменяется мягко нажав пятно из внутренней части чашки с кончиком пальца. Новое место помещается, мягко толкая пятно снаружи в чашку.
  6. Выберите сканирование pO2 из различных тестов, перечисленных слева. Выберите настройки справа от экрана и убедитесь, что они установлены в рамках параметров, перечисленных в таблице 1. Сохраняйте одинаковые настройки для каждого измерения.
  7. Чтобы сохранить эти настройки, нажмите OK OK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительные настройки перечислены в таблице 1, но могут быть скорректированы в соответствии с предпочтениями пользователя и целями исследования. Например, для более широкого изучения серповидного поведения можно изменить скорость и продолжительность дезоксигенации.

3. Сбор и подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки метода, этиленедиамин тетраацетической кислоты (ЭДТА) обработанные крови от 38 пациентов SCD и 5 здоровых элементов управления, включенных в Университетский медицинский центр Утрехт или Техас Детский гематологический центр, в различных клинических исследованиях ( Использовался идентификатор Нидерландского пробного регистра « NTR», NTR 6779 и NTR 6462, а также анонимизированные образцы оставшейся крови у пациентов, которые посещали амбулаторную клинику или были госпитализированы.

  1. Сбор образцов крови путем венипунктуры (минимум 300 л/образец) в трубке, содержащей ЭДТА. Убедитесь, что кровь хранилась не менее 30 минут при 4 градусах Цельсия, но не более 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цитрат фосфат декстроза аденин (CPDA) или гепарин также может быть использован, но влияние этих реагентов на сохранение образца в отношении кислорода градиент эктацитометрии не очень хорошо известны.
  2. Смешайте образец осторожно инверсией для гомогенизации. Не встряхните образец. Пусть образец прогреется до комнатной температуры на роликовой скамейке перед измерением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец трубки (9-10 мл), которая хранится более 1 ч при 4 градусах Цельсия, должна прогреться в течение 15 мин. При хранении менее 1 ч при 4 градусах Цельсия он должен прогреться в течение 10 мин. Образец трубки (2-6 мл), который хранится более 1 ч при 4 градусах Цельсия, должен прогреться в течение 10 мин. При хранении менее 1 ч при 4 градусах Цельсия он должен прогреться в течение 5 мин.
  3. Измерьте полный анализатор крови на гематологическом анализаторе. Для этого возьмите 20-200 л цельной крови в трубке, содержащей ЭДТА. Поместите иглу аспирации в трубку и нажмите на кнопку за иглой гематологического анализатора, чтобы начать измерение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При полном анализе крови измеряется число РБК, что является важным фактором для стандартизации измерений градиента кислорода. Подсчет РБК рассчитывается из переднего и бокового рассеяния по цитометрии потока. Нормальный подсчет РБК в здоровых элементах управления составляет 3,7-5,0 х 1012/л для женщин и 4,2-5,5 х 1012/лдля мужчин. Количество РБК у пациентов с СКД, как правило, снижается. Некоторые гематология анализаторы будут также измерять процент плотных красных кровяных телец (% DRBC), которые могут иметь дополнительную ценность в интерпретации отдельных кривых градиента кислорода эктацитометрии.
  4. Стандартизуйте весь образец крови до 200 х 106 РБК в 5 мл PVP (200 x 106 RBCs/vial) путем корректировки объема образца, который будет добавлен. Если общее количество РБК меньше 200 х 106,то это повлияет на дифракционный узор и EI.
    1. Используйте уравнение ниже для выполнения подсчета.
      4.0/xx (x 1012/L) x 50 yy qL целая кровь/флаал PVP
      где хх является рассчитанным количеством РБК, полученным от шага 3.3 и yy является количество цельной крови, которая необходима для фактического измерения. В зависимости от степени анемии и других факторов, влияющих на количество РБК, количество необходимой цельной крови составляет 40-90 л.

4. Измерение градиента эктацитометрии кислорода

  1. Pipette вычислень том образца (yy l крови) в PVP для того чтобы получить общий том 5 mL. Prewet кончик, осторожно resuspending крови 3x. Используйте наконечник пипетки с широким отверстием, чтобы избежать дополнительной нагрузки на RBCs. Аккуратно смешивайте образец вручную путем инверсии, пока он не станет однородным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте флакон PVP как можно меньше времени, чтобы избежать воздушного контакта.
  2. Медленно нарисуйте 2,0 мл смеси крови/PVP в 3 мл шприца без иглы. Нажмите поршень, чтобы удалить любые видимые пузырьки воздуха и чрезмерного решения образца до 1,5-1,8 мл остается в шприц (в зависимости от объема чашки).
  3. Впрысните общий объем образца медленно и равномерно в боб через разъем. Убедитесь, что уровень образца выше датчика кислорода (розовое пятно) и выше небольшого всасывающего отверстия. Не оставляйте в шприцах образец решения.
  4. Нажмите Новый и заполните образец идентификатора, замечания, дата пожертвования, и вязкость PVP. Нажмите OK (ru) Аспират. После 60 с, чашка будет вращаться и аспирировать образец в течение 15 с. Нажмите OK, когда вращение останавливается. Закройте крышку машины. Нажмите Продолжить (ru) Начните сейчас,как кислородный градиент эктачитометрии делается с фиксированным усилением. Измерение займет около 28 минут.
  5. После измерения распечатайте отчет, отображающие кривую и параметры, автоматически вычисляемые программным обеспечением. Убедитесь, что исходные данные автоматически хранятся в указанной папке в настройках. Максимальный EI (EImax),минимальный EI (EImin),pO295%EI (PoS), а область (область под кривой) автоматически рассчитывается и добавляется в печатный отчет и необработанные данные.
  6. Вручную получить ЗЭИ, вычислив разницу междуEI макс и EIмин. Рассчитайте процентное восстановление, взяв разницу в среднем EI до дезоксигенации (pO2 100-120 мм рт. э.г.) и средние значения EI при реоксигенации на уровне 100-120 мм рт. мг.

5. Очистка эктакитометра

  1. Удалите образец шприца и замените его шприцем, наполненным дистиллированной водой или деионизированной водой.
  2. Нажмите чистый,медленно промывка разъема во время промывки. Убедитесь в том, чтобы промыть в обоих направлениях.
  3. Снимите шприц и поднимите боб. Высушите боб, чашку и разъем тщательно с мягкой тканью.
  4. Используйте большой шприц (10-50 мл) для промывки разъема, чтобы удалить любую воду, оставшуюся в трубах и бобе. Блок нижней входе / розетке Боб, чтобы получить обратно давление в трубах, тем самым удаляя оставшуюся воду.
  5. Опустите боб в чашку. Машина готова к следующему измерению.

6. Выключение машины

  1. Убедитесь, что машина правильно промыта после последнего измерения, как описано выше. Убедитесь, что надлежащие трубки относятся к очистке раствора.
  2. Закройте программное обеспечение, нажмите Закрыть, и нажмите Начало, чтобы начать конец дня программы очистки.
  3. После завершения всей программы очистки, удалить шприц и поднять боб. Промыть разъем большим шприцем.
  4. Очистите бутылку отходов и высушите боб и чашку мягкой тканью. Промыть разъем для того, чтобы удалить воду, оставшуюся в трубах и Боб. Блок нижней входе / розетке Боб, чтобы получить обратно давление в трубах, тем самым удаляя все оставшиеся воды.
  5. Закройте крышку машины. Закройте азотный цилиндр. Выключите компьютер и машину.

Результаты

Градиент кислорода эктачитометрия может быть использован для характеристики серповидного поведения у пациентов с SCD. В этом исследовании были включены образцы крови в общей сложности 38 пациентов SCD и пять здоровых элементов управления. При здоровом элементе управления дифракционный узор является круглым в состоянии покоя и эллиптической при более высоком стрессе сдвига4. Из эллиптической дифракции индекс (EI) рассчитывается на основе высоты и ширины дифракционного шаблона. При оксигенном градиенте эктацитометрии за медленной и непрерывной дезоксигенцией образца азотным газом следует быстрая реоксигенация окружающего воздуха. В этих условиях серпоты РБК можно наблюдать при дезоксигенации. Это приведет к искажению дифракции картины, потому что серпотые красные клетки не будут выравниваться должным образом под прикладным напряжением сдвига. Таким образом, они, как представляется, менее деформируемыми, в отличие от здоровых РБК(Рисунок 2).

На рисунке 3А показано, как серп РБК меняется в форме при дезоксигенации, которая имитировала условия во время кислородного градиента эктацитометрии, в то время как контроль СЕРПа РБК без дезоксигенации не показывает никаких изменений в форме. Этот процесс приводит к искажению дифракции картины во время газификационного градиента эктацитометрии, и, таким образом, в снижении ИИ. На рисунке 3B показаны различные модели дифракции, из которых генерируются различные параметры.

Репрезентативная кривая, полученная эктацитометром, показана на рисунке 3C. Шесть параметров отражают различные характеристики серповидного поведения РБК: EImax является максимальным EI в начале измерения до дезоксигенации. Этот параметр отражает базовое положение и отражает общую деформацию общей популяции РБК в окружающем воздухе. EIмин является минимальным EI, который представляет собой минимальную деформацию после дезоксигенации. Этот параметр отражает изменения формы и ориентации (серпа) РБК при дезоксигенации. Зеи является разница между EIмакс и EIмин, который показывает, сколько клеток может серп во время одного раунда дезоксигенации. 5% Точка Sickling (PoS5%) является PO2 (mmHg), при котором 5% снижениеEI макс во время дезоксигенации измеряется. Это представляет собой кислородное напряжение, где начинается процесс серпового. Область отражает область под кривой, которая определяется интегральным расчетом измерений EI и pO2 между 100 мм рт. ст. иpO 2мин (ммГг). Это результат ранее описанных параметров EImax,EIмини PoS. Восстановление представляет собой разницу EI во время заключительной части реоксигенации по сравнению с EI на базовом уровне. Оба значения EI измеряются на уровне2 o 100-120 мм рт. с. Этот параметр отражает способность РБК, что серп во время дезоксигенации обратить вспять серп во время реоксигенации22. Параметры из дубликатов измерений, как правило, имели коэффициент вариации (CV) зли;5% (средний 1,83%). В случае, если CV qgt; 5% было получено, третье измерение было выполнено. Параметры EImax и Recovery наиболее воспроизводимы со средними резюме.1%.

Представитель кривых RBCs здорового контроля, пациентов с HbS черты (гетерозиготhus HbS), и гомозиготный пациент SCD показаны на рисунке 4A. Репрезентативная кривая пациента HbSC показывает более низкое восстановление, что может указывать на другой процесс серпового(рисунок 4B). Репрезентативные кривые пациентов HbSS, получавших гидроксиурею (HU) и переливание крови, показаны на рисунке 4C и рисунке 4D. Очевидно, что существует большая разница между репрезентативными кривыми черт HS (клетки HbAS) и RBCs пациентов HbSS, получавших переливание (состоящий из смеси гомозиготного серпа (HbSS) и гомозигоусных нормальных (HbAA) клеток, Рисунок 4A ,D). Явные различия в кривых необработанных пациентов SCD и HU и переливания лечение пациентов подчеркивает полезность этого комитета (Рисунок 4C,D). Уровни HbF и HbS значительно коррелируют с EIмин и, в меньшей степени, с PoS(рисунок 5A-D). Это указывает на то, что те лабораторные параметры, которые важны при оценке пациента, также отражаются в градиенте кислорода эктацитометрии. Количество серотистых клеток в normoxia и процент плотных RBCs (DRBCs) оба влияют на значения EImax, так как они значительно коррелируют(рисунок 5E-F), что указывает на то, что EImax отражает еще один важный фактор в серпотый процесс. Эти результаты показывают, как различные характеристики, такие имеет %HbS, %HbF, серотные клетки в normoxia, и %DRBCs влияют на различные параметры.

figure-results-5430
Рисунок 1. Схематическая установка эктакитометра. Эктакитометр использует систему Couette для нанесения нагрузки на сдвига на клетки. Вращение внешнего цилиндра (чашка) и статического внутреннего цилиндра (боб) используются для индуцирования напряжения сдвига путем создания ламинара потока при 37 градусах Цельсия. Между бобом и чашкой есть небольшой зазор, в котором вводится кровоподвес. Лазерный луч светит от боба через кровяную подвеску и рассеивается наличием РБК. Шаблон дифракции проецируется и анализируется камерой. Индекс удлинения (EI) рассчитывается с высотой (a) и шириной (b) дифракционного шаблона4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-6428
Рисунок 2. Схематическая установка эктацитометра с модулем эктацитометрии кислородного градиента. Схематическая схема модуля, которая показывает дезоксигенацию суспензии крови медленно с настоем азотного газа (N2). Кислородное напряжение измеряется количеством закалки сигнала люминофора, посылаемого из светодиодного волокна в O2-пятно. После дезоксигенации серп РБК начнет серпировать, их уродоспособность уменьшится, и они больше не будут согласовываться с эллиптической РБК. Серпотые РБК искажают дифракционный узор, изменяя его форму от эллипса до ромбоида или ромбоида. Это изменение формы шаблона дифракции приводит к снижению EI. Измерения pO2 и EI не выполняются на той же высоте в чашке. Это обеспечивает лучшую дискриминацию между кривыми дезоксигенации и реоксигенации и, следовательно, лучшее толкование кривой. Эта цифра была изменена с Rab et al.22Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-7705
Рисунок 3. Представитель ный кислородный градиент эктацитометрии кривой и дифракционными моделями. ( A) При дезоксигенации в условиях, аналогичных оксигенциенционный эктацитометрия, серп РБК были зафиксированы. При управлении серповыми РБК использовались те же условия, но без азотного газа. Дезоксигенированный серп РБК показывают изменение формы в отличие от контроля RBCs. (B) При дезоксигенации и сдвига стресс (30 A), дифракционный шаблон изменения от эллипса к ромбоид. (C) Представитель кривой кислородного градиента эктацитометрии. Индекс максимального удлинения (EImax)представляет базовое положение и показывает общую деформацию общей популяции РБК. Минимальный EI (EImin)представляет собой минимальную деформацию, которая вызвана изменением формы и ориентации РБК при дезоксигенации. ЗЭИ (dEI, разница в EI между EIмакс и EIмин) показывает, сколько клеток может серп во время одного раунда дезоксигенации. Точка серпового (PoS, pO2 при 5% снижении EI) показывает кислородное напряжение, когда первые РБК начинают серп. Область под кривой (отPO 2min и 100 мм рт. ст.) рассчитывается в области параметра. Это суммирует EIмакс, EIмин, и PoS. Способность серсовых клеток рассеяться во время реоксигенации представлена в параметре Восстановления (процентEI max, достигнутый во время реоксигенации). Чтобы помочь в интерпретации, все точки данных были связаны в каждом отдельном эксперименте строкой, чтобы графически представить результаты. Эта цифра была изменена с Rab et al.22Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-9721
Рисунок 4. Параметры оксигенного градиента эктацитометрии коррелируют с генотипом и схемами лечения пациентов СКД с SCD. (A) Представитель график RBCs носителей HbS (HbS черта) и здорового контроля в отношении необработанных пациентов HbSS. (B) Представитель график RBCs пациентов с гемоглобином SC болезни (HbSC) по отношению к необработанным пациентам HbSS. (C) Представитель график RBCs гидроксиуреа лечение гомозиготных пациентов SCD (HbSS HU) в отношении необработанных пациентов HbSS. (D) Представитель график RBCs пациентов HbSS лечение с переливанием крови (HbSS переливания) в отношении необработанных пациентов HbSS. Эта цифра была изменена с Rab et al.22Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-10835
Рисунок 5. Параметры градиента кислорода эктацитометрии связаны с %HbF, %HbS, %sickled клетками при нормоксии и %dense RBCs. (A) Линейная корреляция минимального индекса удлинения (EIмин)и %HbF 15 HbSS или HbS / халасемии пациентов без переливания. (B) Линейная корреляция EIмин и %HbS. (C) Линейная корреляция PoS и %HbF. (D) Линейная корреляция PoS и %HbS. (E) Линейная корреляция максимального EI (EIмакс)и процентов серотовых клеток на normoxia измеряется с помощью цифровой микроскопии. (F) Линейная корреляция EIмакс и процент плотной РБК (%DRBCs) из 21 пациентов с HbSS. Эта цифра была изменена с Rab et al.22Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Параметры
ФайлыКаталог хранения данных
Общие опцииСредняя вязкость по умолчаниюВискозность PVP
pO2 сканированиеМинимальное время аспирации (ы)60
pO2 напряжение сдвига сдвига (Pa)30
Определить pO2 каждый (S)20
Перемещение среднего размера2
pO2 шаг сканирования; Редактировать0 -Off; 60 -ON; 1360 -OFF; 1640 -OFF
Cal. Площадь между (mmHg)10 и 100
pO2 управлениеВыключено (не контролируемо)

Таблица 1. Предпочтительная установка эктацитометра.

Обсуждение

Здесь мы описываем кислородный градиент эктачитометрии, метод, который может быть использован для изучения серповидного поведения красных кровяных телец от пациентов SCD в диапазоне концентраций кислорода(Рисунок 4 и Рисунок 5). Для того, чтобы получить воспроизводимые результаты, важно определить факторы, которые влияют на результаты. Например, температура оказывает большое влияние на деформацию РБК, в основном из-за ее влияния на толщину вязкой раствора (PVP). Мы рекомендуем проводить тестовые измерения в начале дня, чтобы тщательно нагреть машину до 37 градусов по Цельсию. Это позволит повысить воспроизводимость результатов. Осмолялярность вязкого раствора должна находиться в узком диапазоне (282-286 мОзм/кг для PVP), так как осмоляритность влияет на состояние гидратации, что, в свою очередь, влияет на деформацию РБК. рН и вязкость PVP также должны быть жестко регламентированы. Различия в рН и температуре могут сильно влиять на кривые22. Кроме того, оставшаяся вода в чашке, боб, и трубки, может вызвать лиза РБК, что приводит к неверным данным, потому что меньше нетронутыми РБК, присутствующих в чашке будет измеряться.

Настройки для выполнения кислородного градиента эктачитометрии могут быть скорректированы для решения конкретных исследуемых вопросов. Предпочтительные настройки перечислены в таблице 1. Время дезоксигенации 1300 с было выбрано на основе наблюдений, показывающих, что расширение дезоксигенации не привело к снижениюEI мин для большинства пациентов. В отличие от этого, сокращение времени дезоксигенации будет препятствовать дискриминационной мощности кислородного градиента эктацитометрии. Время реоксигенации было установлено до 280 с из-за быстроразрешающих полимеров HbS во время реоксигенации, и сопутствующей восстановления EI к значениям, измеренным до дезоксигенации. Сдвига стресс был установлен на 30 Па, который аналогично осмотического градиента эктазитометрии. Снижение этого параметра может затруднить дискриминационную мощность. Контроль дезоксигенации может быть использован, если набор скорости дезоксигенации применяется к каждому образцу пациента. В наших предпочтительных настройках, эта опция была выключена, потому что скорость дезоксигенации пациента специфична из-за уникальной кривой диссоциации гемоглобина. Таким образом, включение контроля дезоксигенации исключило бы эту характеристику из асссе. Тем не менее, эта особенность кислородного градиента эктачитометрии все еще расследуется.

Несколько известных факторов влияют на параметры градиента кислорода ektacytometry, а именно рН, температуру и осмолярность. Эктачитометрия, особенно PoS, находится под влиянием 2,3-дифоспоглицерат (2,3-DPG)22. Кроме того, существует четкая корреляция между %HbF и EIмин, и в меньшей степени PoS(рисунок 5-D). EImax связан с серповидно-клеток на normoxia, что может объяснить наблюдение, что вскоре после ЛОС, РБК деформации на normoxia (EIмакс), выше. Последнее вызвано разрушением самых серповых клеток, а значит, и менее деформируемых РБК во время VOC16. Как показано на рисунке 5F, более высокий %плотный РБК (определяется как РБК с концентрацией гемоглобина Это указывает на то, что плотные клетки являются важным фактором деформации РБК в normoxia, аналогичные ранее сообщалось результаты1.

Стандартизация образцов очень важна для получения воспроизводимых результатов и для разграничения между различными генотипами и методами лечения. Корректировка подсчета ГОЛОСОВ РБК важна, так как количество РБК влияет на интенсивность дифракционного шаблона. Если в зазоре между бобом и чашкой присутствуют более низкие цифры РБК, кривая сместится вверх и влево. Кроме того, кривая будет колебаться, препятствуя точному расчету параметров, особенно PoS.

Ограничение этого метода заключается в том, что значение EI представляет собой среднее значение всех клеток, включая различные субпопуляции. Интенсивно изучалась гетерогенность популяций РБК у пациентов СКД и ее влияние на измерение эктацитометрии. Это привело к стандартизации, при которой размер дифракционного шаблона корректируется на фиксированное значение вместо исправленного для подсчета РБК23,24. В настоящее время изучается вопрос о том, следует ли применять этот способ стандартизации к измерениям оксигенного градиента эктацитометрии.

Несколько методов измерения деформации РБК в гипоксических условиях были разработаны на основе шага дезоксигенации, который проходил за пределами эктацитометра25,26,27. В этих условиях, различия в клеточном поведении не наблюдались между пациентами с hbS черты и здоровый контроль при физиологических рН25. Кислородградиент эктачитометрии, однако, ясно показывает низкий, но очевидный PoS у людей с hbS черты(Рисунок 4A). На сегодняшний день, в обычной клинической практике, только альтернативные методы для измерения склонности отдельных РБК пациента к серпу в пробирке включают морфологии основе серпового анализа: РБК инкубируются в условиях, способствующих полимеризации HbS, таких как низкое кислородное напряжение или низкий рН. Фиксатор добавляется после инкубации, и процент серповых клеток подсчитывается вручную или цифрово с помощью световой микроскопии. Многие доклинические и ранние фармакологические испытания фазы используют анализ серпового для создания вторичной переменной исхода, чтобы быть в состоянии предсказать клиническую эффективность в SCD28,29,30,31 ,32. Однако это отнимает много времени, вариативность высока, а чувствительность низкая, техника не автоматизирована и, следовательно, трудоемкая. Кроме того, морфологические изменения из-за серпа могут не коррелировать хорошо с физиологическими параметрами, такими как деформация РБК, потому что это 2-мерный статический самописец2.

Кислородный градиент эктацитометрии обеспечивает функциональный анализ серпового, который является быстрым и воспроизводимым. Это тест in vitro, который не учитывает эндотелиальную поверхность. Тем не менее, он обеспечивает функциональные аспекты серповидного поведения и характеристики РБК, что делает его перспективным методом для исследования серповидно-клеточных клеток. Будущие применения метода включают мониторинг эффективности лечения у пациентов SCD, выступающей в качестве биомаркера для новых стратегий лечения, изучение серповидного поведения, и мониторинг химеризма после трансплантации стволовых клеток в SCD.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантом Eurostars estar18105 и неограниченным грантом, предоставленным RR Mechatronics. Авторы благодарят Систо Хендрикса и Яна де Зоэтена за техническую поддержку.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ADVIA 120 Hematology AnalyzerSiemens067-A004-14Instrument
Cell-Dyn Sapphire Hematology AnalyzerAbbott8H00-01Instrument
LorrcaRR MechatronicsLORC109230 or LORC109110Instrument
Lorrca Software version V5.08RR Mechatronics-Software
Nitrogen gas 4.8 or 5.0Local-
O2-spotRR MechatronicsPO2S020153O2 measurement
Oxygenscan module (pO2scan)RR MechatronicsPO2S109000Add-on
Oxy-ISORR MechatronicsQRR 030905Viscous solution
X-CleanRR MechatronicsQRR 010946Cleaning solution Lorrca

Ссылки

  1. Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
  2. Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
  3. Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
  4. DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
  5. Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
  6. Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
  7. Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
  8. Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
  9. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  10. Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
  11. Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
  12. Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
  13. Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
  14. Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
  15. Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
  16. Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
  17. Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
  18. Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).
  19. Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
  20. Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
  21. Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
  22. Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, 575-584 (2019).
  23. Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
  24. Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
  26. Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
  27. Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
  28. Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
  29. Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).
  30. Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
  31. Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
  32. Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены