في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر

Summary

نقدم هنا البروتوكول الذي يمكن تصوره قبل و/أو الكالسيوم بعد المتشابك في سياق التعلم والذاكرة دروفيفيا . في صور الكالسيوم المجرية باستخدام حساسات الكالسيوم المترجمة بالمشبك يتم الجمع بينها وبين النموذج الكلاسيكي لتكييف حاسة الشم بحيث يمكن تحديد اللدونة المتشابكة الكامنة وراء هذا النوع من التعلم النقابي.

Abstract

عقود من البحوث في العديد من الكائنات الحية النموذجية أدت إلى المفهوم الحالي للدونة متشابك الكامنة وراء التعلم وتكوين الذاكرة. وغالبا ما يتم توزيع التغييرات الناجمة عن التعلم في انتقال متشابك عبر العديد من الخلايا العصبية ومستويات المعالجة في الدماغ. ولذلك ، هناك حاجه إلى أساليب لتصور اللدونة متشابك تعتمد علي التعلم عبر الخلايا العصبية. وتمثل ذبابه الفاكهة الصباغية الحية نموذجا مناسبا لدراسة الدوائر العصبية الكامنة وراء التعلم. البروتوكول المعروض هنا يوضح الطريقة التي العمليات الكامنة وراء تشكيل الذكريات الشميه النقابية ، اي النشاط متشابك وتغييراتها ، يمكن رصدها في الجسم المجري. باستخدام المجموعة الواسعة من الاداات الجينية المتوفرة في دروفيسيلا، من الممكن التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا في مجموعات الخلايا المحددة وحتى الخلايا المفردة. من خلال إصلاح ذبابه في مكان ، وفتح كبسوله الراس ، فمن الممكن لتصور ديناميات الكالسيوم في هذه الخلايا في حين تقديم المحفزات حاسة الشم. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نثبت وجود اعداد يمكن ان يتعرض فيه الذبابة ، في الوقت نفسه ، للصدمات الكهربائية في الجسم. وهذا يوفر نظام الذباب التي يمكن ان تخضع لتكييف حاسة الشم الكلاسيكية-حيث يتم تعلم رائحة ساذجه سابقا ان تترافق مع عقوبة الصدمة الكهربائية-في نفس الوقت مثل تمثيل هذه الرائحة (وغيرها من الروائح غير المدربة) هو لوحظ في الدماغ عن طريق المجهر اثنين من الفوتون. وقد ابلغ مختبرنا في السابق عن توليد أجهزه استشعار الكالسيوم المترجمة بالمشبك ، والتي تمكن المرء من حصر إشارات الكالسيوم الفلورية في مقصورات ما قبل أو بعد المتشابك. يوفر المجهر ثنائي الفوتون وسيله لحل الهياكل الدقيقة مكانيا. ونحن مثال علي ذلك من خلال التركيز علي الخلايا العصبية دمج المعلومات من الجسم الفطر, مركز النظام اعلي من الدماغ الحشرات. عموما ، يوفر هذا البروتوكول طريقه لفحص الاتصالات متشابك بين الخلايا العصبية التي يتم التضمين نشاطها نتيجة للتعلم حاسة الشم.

Introduction

فك رموز أين وكيف يتم الحصول علي المعلومات في الدماغ من خلال التعلم وتخزينها فيما بعد كذاكره تشكل واحده من المهام الأكثر تحديا في علم الأعصاب¹. [نيوروسكينتيفيك] البحوث قد أدت إلى مفهوم التغيير في انتقال متشابك كما الركيزة العصبية التي تكمن وراء التعلم وتكوين الذاكرة^2,3. ومن المفترض انه ، اثناء التعلم ، والاتصالات متشابك بين الفرق العصبية التي تنشط خلال التصور من التحفيز يصبح تعديلها بحيث يمكن استردادها نمط النشاط مجتمعه خلال استدعاء الذاكرة ، التالي يامر العمل السلوكي في المستقبل⁴. وغالبا ما يتم توزيع هذه "الخلايا engram" والمشابك العصبية الخاصة بهم عبر مناطق الدماغ ومستويات المعالجة ، مما يجعل من الصعب تعيين التغييرات الملحوظة في الإرسال المتشابك إلى تعلم مهمة أو محفز. لتعريب وتصور تلك التغييرات متشابك التي ترتبط بشكل سببي لمهمة تعليمية معينه واحده يحتاج إلى نظام النموذج المناسب الذي يسمح لحصر تلك الاشتباكات العصبية بدقه.

ولمثل هذا المسعى ، فان الوحمة الصباغية هي مناسبه بشكل خاص لأنها تجمع بين البساطة النسبية للدماغ ، والثراء السلوكي ، وامكانيه الوصول التجريبية. ومن بين الكائنات الحية النموذجية الراسخة ، تقع دروفيبيلا بين الديدان الخيطية c. ايلينيسيس والثدييات العريكته وراثيا مثل الفئران من حيث تعقيد الخلايا العصبية. لوحظ عدد نمطي من الخلايا العصبية (~ 300) والذخيرة السلوكية محدوده في c. اليجنس. الثدييات ، من ناحية أخرى ، لديها الملايين من الخلايا العصبية والتعقيد السلوكي المذهل. الدماغ من ذبابه الفاكهة هو ، مع لها ~ 100,000 ، الخلايا العصبية أصغر بكثير من أدمغه معظم الفقاريات ، والعديد من الخلايا العصبية التي يمكن التعرف عليها بشكل فردي⁵. ومع ذلك ، تعرض دروفيسيلا طيفا واسعا من السلوكيات المعقدة ، بما في ذلك القدرة علي إظهار التعلم الشمي النقابي القوي وتكوين الذاكرة ، والتي تم وصفها لأول مره منذ 40 سنه⁶. في سياق هذا الاجراء تكييف الكلاسيكية ، وتخضع مجموعات من الذباب إلى رائحة كما التحفيز المشروط (^{CS +}) في حين انها تتلقي صدمه كهربائيه معاقبه كحافز غير مشروط (الولايات الامريكيه). ثم تعرض الرائحة الثانية (CS^-) دون اي عقاب. التالي ، تعلم الحيوانية لتجنب رائحة المرتبطة العقاب ، والتي يمكن اختبارها في حاله اختيار اللاحقة بين الروائح اثنين ،^{cs +} و cs^-. العمل علي تشريح الركيزة العصبية الكامنة وراء هذا السلوك في دروكوفيلا وقد حددت جثث الفطر (MB) كموقع الرئيسي لل "engram"^7,8,9,10 ولذلك ، كانت دوائر هذه المنطقة الدماغ وهو موضوع البحوث المكثفة من أجل الكشف عن المنطق الذي يتم الحصول علي الذاكرة انغرام وتخزينها (استعرضت مؤخرا في^11،12).

تتكون المكونات من الخلايا العصبية الذاتية من 2,000 تقريبا (كريات كينيون) في نصف الكره الارضيه ، ويتم تنظيمها بالتوازي مع إسقاطات محواري¹³. يتم توسيع axons من الخلايا العصبية الإسقاط حاسة الشم إلى البروتوسيريبرا الجانبية والي calyces ميغابايت, موقع الإدخال الرئيسية الشجيرية من ميغابايت وتلقي المدخلات حاسة الشم من الفصوص الهوائية. تشكل المجموعة الطويلة والمتوازية من خلايا كينيون العم المتجول والفصوص. معظم خلايا كينيون تشكيل الأفقي β/الفصوص من خلال تمديد ضمان واحد نحو خط الوسط من الدماغ ، والعمودي α/α'-فصوص عن طريق تمديد الجانبية الثانية إسقاط في الاتجاه الظهري الامامي. يشكل الأخرى مجموعه من [كينيون] خلايا ال [γ-فصوص] أفقيه¹³ من ال [مب] حيث ال يعلم عمليه ولاحقه [شورت-ترم] ذاكره تشكيل استطاع كنت مترجمه¹⁰. الفصوص ميغابايت تلقي المدخلات الزبائ وتوفير الناتج افيرينت ، وكلاهما يقتصر عاده علي المناطق الفرعية مجزا متميزة علي طول الخلية كينيون محاور^14،15،16. وعلي وجه الخصوص, وقد ثبت الخلايا العصبية الإدخال MB المدخلات التي تتوسط القيمة, علي سبيل المثال, العقابية, تعزيز الآثار في التعلم حاسة الشم النقابي^15,17. نمطي والخلايا العصبية الناتجة افيرينت MB التي يمكن التعرف عليها بشكل فردي من فصوص الجسم الفطر دمج المعلومات عبر اعداد كبيره من الخلايا Kenyon ، واستهداف مناطق الدماغ المتنوعة وتحمل السلوك--مفيده المعلومات الايجابيه أو افئيه¹⁵ . وقد ادي هذا العمارة العصبية إلى مفهوم تنظيم engram النقابي. يتم ترميز الروائح بدقه نسبيا من قبل الفرق القليلة التنشيط من خلايا كينيون. النشاط المتزامن لهذه الفرق الخلية كينيون والإفراج عن الدوبامين التي اثارها معاقبه المحفزات-ينظم انتقال من الخلية كينيون presynapses علي الخلايا العصبية إخراج ميغابايت من هذا القبيل ان الكائنات سوف تجنب في وقت لاحق هذه الرائحة خاصه^{10 ،12}. نحن نستخدم هذا بدقه محدده والمترجمة انغرام كحاله نموذجيه لتوضيح كيف يمكن تحديد هذه التغييرات المعتمدة علي التعلم في النشاط متشابك ورصدها.

تعتمد قيمه دروفيبيلا كنظام نموذجي بقوة علي الاداات الوراثية التي لا مثيل لها والتي تسمح لأحد بالتعبير عن الجينات للتعرف علي الخلايا العصبية الواحدة ومراقبتها والتحكم فيها داخل الدوائر المعقدة¹⁸. ظهور تقنيات لرصد نشاط الخلايا العصبية-مثل التصوير الكالسيوم ، وناقش هنا-وقد سمح لتحديد أنماط النشاط العصبية استجابه لتحفيز محدده. من خلال الجمع بين التعبير Gal4 محدده من مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (جيكيس) مع التحفيز حاسة الشم ، يمكن للمرء ان تصور ديناميات الكالسيوم التي أثارت رائحة الخلايا العصبية من الفائدة¹⁹. في هذا البروتوكول ، يظهر انه من خلال اقتران هذه التقنية مع نموذج التكييف الكلاسيكي ، من الممكن فحص هذه الاستجابات الشميه في سياق التعلم. اللدونة التي يسببها التعلم يمكن تشريحها باستخدام جيكليس فقط المترجمة إلى الخلايا العصبية محدده واحده ، ولكن أيضا إلى مقصورات فرعيه معينه من الخلايا العصبية. Pech et al.²⁰ إنشات مجموعه مختاره من الاداات التي تسمح بالبالضبط هذا. من خلال استهداف GCaMP3²¹ اما قبل أو بعد المشبك-عن طريق الربط إلى فقاري سينابتوفيسين أو dهوميروس ، علي التوالي²⁰-يمكن تمييز التحوير التفاضلي لهذه المواقع. هذا التعريب يضفي ، في هذا السياق ، ميزه علي معظم جيليس التي هي موجودة بشكل مطلق في جميع انحاء عصارة-علي سبيل المثال ، gcamp²²، GCaMP3²¹، أو GCaMP6²³ -لأنه يعني ان العابرين قبل و بوستسينابتيك يمكن ان يكون متميزة عن تدفق الكالسيوم المتكامل الشامل الذي يحدث نتيجة لتنشيط الخلايا العصبية. وهذا يمكن ان توفر أدله حول الموقع وأنواع اللدونة التي تحدث نتيجة أو التي تسبب التعلم وتكوين الذاكرة. علي سبيل المثال ، البروتوكول المقدم هنا يظهر قيمه هذه الاداه في فك رموز التحوير من الخلايا العصبية الناتج MB خلال التعلم النقابي حاسة الشم عن طريق استهداف التعبير من مستشعر الكالسيوم إلى ما بعد المشبك فقط. عن طريق الرصد ، داخل ذبابه الفردية ، والنشاط اثار رائحة قبل وبعد تكييف حاسة الشم يمكن رسمها مقارنه مباشره بين استجابه رائحة ساذجه واستجابه رائحة المستفادة. بينما الثابتة في نفس غرفه التصوير ، ويتعرض الذباب لمجموعه مختاره من الروائح. ثم ، فانها تتلقي بروتوكول تكييف النقابي مكره فيها واحده من هذه الروائح يقترن مع صدمه كهربائيه (تصبح^{cs +}) ويتم تقديم رائحة أخرى دون تعزيز (تصبح cs^-). وأخيرا ، يتعرض الذباب مره أخرى لنفس الروائح كما هو الحال في الخطوة الاولي. ويلاحظ ديناميات الكالسيوم باستخدام اثنين من الفوتون المجهري.

Protocol

1- ذبابه الفاكهة المحورة وراثيا

1. عبور الإناث العذراء والذباب الذكور (التي أثيرت في 25 درجه مئوية في 60 ٪ الرطوبة النسبية علي 12 ساعة الضوء/الظلام) تحمل المطلوب Gal4 و UAS يبني²⁵، علي التوالي ، لإنتاج الذباب التي الخلايا العصبية محدده من الفائدة التعبير عن المشفرة وراثيا مؤشر الكالسيوم.
2. عمر النسل انثويه من ال أعلاه صليب حتى هم في المدى من 3-6 أيام [بوست-اكلوسيون]. الذباب الإناث هي الأفضل بسبب حجمها أكبر قليلا.

2. اعداد ذبابه الفاكهة لتصوير الكالسيوم في الجسم المجري

1. اختيار ذبابه واحده الإناث وتخدير علي الجليد لمده لا تزيد عن 5 دقيقه.
2. باستخدام ملقط دقيق ، ضع الذبابة في غرفه التصوير (الموضحة في الشكل 1ج). ضمان الصدر والساقيين علي اتصال مع الأسلاك الكهربائية في الجزء السفلي من الغرفة وان الراس يضع شقه. إصلاح موقف ذبابه باستخدام شريط لاصق واضح.
   ملاحظه: يتطلب هذا البروتوكول غرفه مبنيه خصيصا حيث يتم إصلاح الذباب ، مع كبسوله الراس التي يمكن الوصول اليها لفتح ، والذباب قادره علي الحصول علي كل من التحفيز الروائح إلى الهوائيات والصدمات الكهربائية إلى الصدر والساقيين (الشكل 1).
3. باستخدام شفره مشرط الجراحية الثابتة علي مقبض مشرط (انظر جدول المواد) ، وقطع نافذه في الشريط حول راس ذبابه ، وترك الهوائيات مغطاه وفقط الجزء الامامي-معظم الصدر المكشوفة.
4. تحيط الجانبين والظهر من الراس مع الغراء علاج الضوء الأزرق ، والتلاعب بعناية باستخدام دبوس الحشرات التي تحتفظ بها الفكين مقعر محدب. تعيين الغراء باستخدام مصباح LED الأزرق الباعث علي الضوء.
5. تحقق من ان يتم تعيين الغراء تماما ومسح اي الغراء غير تصلب المتبقية من السطح الظهري للراس يطير.
6. تطبيق قطره من الحل الرنين²⁴ (انظر جدول المواد) لتغطيه اهاب المكشوفة من الراس.
7. باستخدام سكين طعنه ناعمه جدا ، وقطع من خلال اهاب. لأزاله الأكثر كفاءه للبشرة ، أولا قطع عبر الخلفي من الراس باستخدام العنكبوتي كنقطه انطلاق. ثم ، وقطع كل جانب ، الإنسي إلى العينين ، لتشكيل رفرف من اهاب التي يمكن ان تمزق بسهوله قباله باستخدام ملقط.
8. أزاله اي اهاب الزائدة التي قد تسد منطقه الدماغ من الفائدة.
9. مسح بعناية السطح الظهري لأي القصبة الهوائية باستخدام ملقط غرامه ، وتجنب تعطيل انسجه المخ نفسها. أزاله وتحديث الحل الرنين²⁴ (انظر جدول المواد) كما هو مطلوب لمسح منطقه الحطام الانسجه.
10. ضع ابره تسليم الروائح الكريهة في الموضع ، حوالي 1 سم من راس الذبابة. تاكد من انه لا يوجد شيء يمكن ان يعيق تسليم الروائح إلى الهوائيات.
11. في المجهر ، قم بتوصيل غرفه التصوير إلى نظام تسليم الروائح عن طريق ابره تسليم الرائحة تحت الجلد.
12. للسماح للطيران للتعافي تماما من التخدير والجراحة ، والتكيف مع تدفق الهواء ، وتنفيذ 10 دقيقه فتره راحة في هذه المرحلة.

3. في الجسم الصور الكالسيوم

1. استخدام مجهر متعدد الفوتونات مجهزه ليزر الاشعه تحت الحمراء والغمر المياه الهدف (انظر جدول المواد) ، المثبتة علي طاوله الاهتزاز معزولة. لتصور مؤشرات الكالسيوم المستندة إلى GFP ، اضبط الليزر علي موجه أثاره من 920 نانومتر وقم بتثبيت فلتر تمرير النطاق GFP.
2. باستخدام مقبض التعديل Z الخشنة ، والمسح الضوئي من خلال محور Z من الدماغ وتحديد منطقه الدماغ من الفائدة. استخدم وظيفة الاقتصاص للتركيز علي المسح الضوئي علي هذه المنطقة فقط لتقليل وقت المسح الضوئي ، ولتدوير عرض المسح الضوئي بحيث يواجه الراس الامامي للأسفل.
3. ضبط حجم الإطار إلى 512 x 512 px ، سرعه المسح الضوئي ل> 4 هرتز ، ومسح المنطقة (في البعد Y) بحيث يتم تغطيه الخلايا العصبية من الفائدة.

4. التصور من العابرة رائحة الكالسيوم من خلال تكييف حاسة الشم

1. استخدام نظام تسليم رائحة^19،26 التي يمكن ان توفر العديد من المحفزات رائحة بطريقه دقيقه وقتيا.
   1. استخدم كمبيوتر إضافي للتحكم في الجهاز ، وللتواصل مع برنامج المجهر التصويري لتنسيق عمليات تحفيز الروائح مع التقاط الصور اثناء التجارب.
   2. بدء حزمه ماكرو مبرمجه مسبقا قادره علي ربط برنامج الحصول علي الصور وبرنامج تسليم الروائح (علي سبيل المثال ، حزمه ماكرو VBA المثبتة في برنامج التحكم في المجهر ، انظر جدول المواد) الذي يستجيب لمدخل خارجي الزناد المقدمة من قبل البدء في بروتوكول تسليم رائحة في برنامج منفصل).
2. بدء القياس عن طريق رصد "ما قبل التدريب"/الساذجة التي أثارت رائحة الكالسيوم العابرين في قرار من 512 x 512 px ومعدل الإطار من 4 هرتز. تقديم حافز الرائحة 2.5 s يحيط بها اكتساب صوره اضافيه ل 6.25 s السابقة رائحة بداية (لإنشاء F ₀ قيمه الأساس) و 12.5 s بعد أزاحه الرائحة. كرر هذا مع العطر الثاني ثم مع الثالثة.
3. مواصله 3 دقائق بعد هذا القياس مع تكييف الكلاسيكية ("التدريب") ذبابه.
   1. حدد واحده من الروائح المقدمة في مرحله "ما قبل التدريب" لتصبح^{cs +} رائحة واخر لتصبح cs^- رائحة. تقديم^{CS +} رائحة باستخدام نظام التحكم بالرائحة التي تسيطر عليها الكمبيوتر ل60 s إلى جانب الصدمات الكهربائية 12 90 V.
   2. بعد كسر 60 s ، وتقديم CS^- رائحة وحدها ل 60 s. استخدام كالمبيدات 4-ميثيلسيكلوهيكانول و 3-اوكتانول. لا تقدم الثالثة العطرة (علي سبيل المثال ، 1-octen-3-ol) خلال هذا التدريب كما يتم استخدامه كعنصر تحكم فقط قبل (الخطوة 4.2.) وبعد (الخطوة 4.4) مرحله التدريب.
4. قياس "مرحله ما بعد التدريب" اثار الكالسيوم التي أثارت رائحة مره أخرى عن طريق تكرار "ما قبل التدريب" بروتوكول تحفيز الروائح (الخطوة 4.2.) 3 دقائق بعد الانتهاء من مرحله التدريب (الخطوة 4.3).
   ملاحظه: يجب ان يعكس توقيت هذه الخطوة وقت الاهتمام بعد تكوين الذاكرة (علي سبيل المثال ، تنفيذ هذه الخطوة 3-4 دقيقه بعد خطوه التكييف للتحقيق في الذاكرة علي المدى القصير). عاده ، يمكن البقاء علي قيد الحياة الذباب لعده ساعات في هذا الاعداد.
5. احفظ ملفات الصور بتنسيق مناسب (علي سبيل المثال ، Tiff) لتحليل الصور لاحقا.

5-تحليل الصور

1. لتحليل الصور ، افتح ملفات Tiff (أو ما شابه) في برنامج تحليل الصور مثل فيجي²⁷.
2. محاذاة المكدسات باستخدام خوارزميه تصحيح الحركة لضمان الحد الأدنى من الحركة في الاتجاهين X و Y. تجاهل اي تسجيلات تظهر حركه قويه في المحور Z.
3. حدد أداه البرنامج المستخدمة لوضع علامة علي منطقه الاهتمام (ROI) حول المنطقة التي سيتم فحصها. وينبغي ان يكون هذا دقيقا قدر الإمكان للحد من تاثير فلوري الخلفية.
4. استخدم الاداه الخاصة بالبرنامج لاستخراج بيانات كثافة الفلورية الزمنيه كملفات بيانات من عائد الاستثمار المحدد ، بحيث يتم إنشاء قيمه لكل اطار من التسجيل.
5. افتح البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات لحساب قيم ΔF/F₀ لكل تتبع رائحة. F₀ = متوسط فلوري في 2 ق قبل بداية الرائحة. ΔF = الفرق بين الفلوري الخام في اطار معين و F₀. من هذه القيم ، احسب قيمه ΔF/F₀ لكل اطار والتي يمكن رسمها مع الوقت لتعكس الفلورية النسبية طوال فتره تحفيز الروائح.

النتائج

ويمكن النظر إلى مثال علي الصور التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول أعلاه في الشكل 2. د يتم التعبير عن GCaMP3 في الخلايا العصبية إخراج ميغابايت الذي تشعبات inعصبيه المقصورة 1 من ميغابايت γ (يسمي الخلايا العصبية MVP2^28,29) و?...

Discussion

تشريح الدوائر العصبية الكامنة وراء التعلم والذاكرة هو هدف بارز في مجال علم الأعصاب. ان امكانيه الحصول علي الجينات الوراثية واتساع الاختبارات السلوكية وسهولتها يجعلها أداه مثاليه للتحقيق في هذه الظواهر. هنا ، يتم تقديم طريقه التي من الممكن ان تصور ، داخل الذباب الفردية ، والتحوير الذ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape	Tesa SE, Norderstedt, Germany		Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20x40mm
Insect Minutien pins	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blue light-curing glue
Microscope slide	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	0656.1	Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Product No. 11
Surgical scalpel handle	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope.	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.