在Vivo光学钙成像学习诱导突触可塑性在果蝇黑色素增生

摘要

在这里，我们提出了一个协议，其中前和/或午睡钙可以在果蝇学习和记忆的上下文中可视化。体内钙成像使用显着局部钙传感器与经典的嗅觉调节范式相结合，因此可以确定这种类型的关联学习背后的突触可塑性。

摘要

几十年来对许多模型生物体的研究导致了目前作为学习和记忆形成基础的突触可塑性的概念。突触传播中由学习引起的变化通常分布在大脑的许多神经元和处理水平上。因此，需要一些方法来可视化神经元间学习依赖性突触可塑性。果蝇果蝇黑色素体是研究学习基础神经元回路的一个特别有利的模型有机体。这里提出的协议演示了一种方式，其中可以监测形成关联嗅觉记忆的过程，即突触活动及其变化。利用果蝇中现有的广泛遗传工具，可以具体表达确定细胞群甚至单个细胞中的遗传编码钙指标。通过将苍蝇固定到位，并打开头部胶囊，可以在提供嗅觉刺激的同时，可视化这些细胞中的钙动力学。此外，我们演示了一种设置，即苍蝇可以同时受到对身体的电击。这提供了一个系统，苍蝇可以经历经典的嗅觉调节 - 其中以前天真的气味被学习与电击惩罚 - 同时，这种气味（和其他未经训练的气味）的表示是通过双光子显微镜在大脑中观察到。我们的实验室以前曾报告过合成局部钙传感器的产生，这使得人们可以将荧光钙信号限制在午睡前或午合室。双光子显微镜提供了一种在空间上解决精细结构的方法。我们通过关注神经元来整合来自蘑菇体内的信息，这是昆虫大脑的高阶中心，从而说明了这一点。总体而言，该协议提供了一个检查神经元之间的突触连接的方法，这些神经元的活动由于嗅觉学习而被调节。

引言

通过学习在大脑中获取信息的位置和方式，然后存储为记忆，是神经科学^中最具挑战性的任务之一。神经科学研究已经导致突触传播的概念改变，作为神经元基质的基础，学习和记忆^{形成2，3。}据推测，在学习期间，在刺激感知期间活跃的神经元集合之间的突触连接会被修改，从而在记忆记忆记忆期间可以检索其组合活动模式，从而指导未来的行为^行动4。这些"基因细胞"及其突触通常分布在大脑区域和处理水平，这使得很难将突触传播的观察到的变化分配给学习任务或刺激。要本地化和可视化那些与特定学习任务有因果关系的突触变化，需要一个适当的模型系统，以便精确限制这些突触。

对于这样的努力，果蝇黑色素是特别适合的，因为它结合了相对的大脑简单性，行为丰富，和实验可访问性。在成熟的模型生物中，果蝇位于线虫和基因可处理的哺乳动物（如小鼠）之间的神经元复杂性。在C.elegans中观察到神经元的立体数量（+300）和有限的行为表谱。另一方面，哺乳动物拥有数百万个神经元和惊人的行为复杂性。果蝇的大脑有10万欧元，神经元比大多数脊椎动物的大脑小得多，许多神经元是单独可识别^的5。然而，果蝇表现出广泛的复杂行为，包括表现出强大的关联嗅觉学习和记忆形成的能力，第一次描述超过40^年前6。在这个经典的调理过程中，成群的苍蝇受到一种气味作为条件刺激（CS^+），而他们接受惩罚电击作为无条件的刺激（美国）。然后，第二种气味 （ CS^-） 被呈现，没有任何惩罚.因此，动物学会避免与惩罚相关的气味，这可以在两种气味，CS⁺和CS^-之间的后续选择情况进行测试。在果蝇中解剖这种行为背后的神经元基质的工作已经确定蘑菇体（MB）是"engram"7、8、9、10的主要部位。因此，这个大脑区域的电路是，也是密集研究的主题，以揭示记忆密码被获取和存储的逻辑（最近回顾^{在11，12）。}

果蝇MB由每半球2，000个内在神经元（Kenyon细胞）组成，以平行的斧子^投影13组织。嗅觉投影神经元的斧子扩展到侧原体和MB calyces，MB的主要树突输入位点，并从天线叶接收嗅觉输入。长，平行的斧子束的肯扬细胞构成脚轮和叶。大多数Kenyon细胞通过将一个抵押品伸向大脑的中线，形成水平β/β-叶，并通过向背向前方向延伸第二个抵押品，形成水平β/β-叶。另一组肯扬细胞形成MB的水平β-^叶13，其中学习过程和随后的短期记忆形成可以^{本地化10。}MB 叶接收一个正位输入并提供有效输出，这两个输出通常都限制在肯扬细胞^{斧14、15、16}上不同的隔间子区域。特别是，一个多巴胺能MB输入神经元已被证明调解基于价值，例如，惩罚性，增强作用在关联嗅觉^{学习15，17}。来自蘑菇体叶的立体和单独可识别的可识别的 MB 输出神经元集成了大量 Kenyon 细胞中的信息，针对不同的大脑区域，并承担行为指导性或厌恶性信息¹⁵.这种神经元结构导致了关联形图的组织概念。气味由稀疏激活的Kenyon细胞集合相对精确编码。这些Kenyon细胞组合的重合活性和多巴胺的释放 - 通过惩罚刺激引起的 - 调节从Kenyon细胞前突子到MB输出神经元的传输，使动物随后避免这种特殊^{的气味10 ， 12}.我们使用这个相当精确定义和本地化的语法作为范例案例来说明如何确定和监测突触活动中的这些与学习相关的变化。

果蝇作为模型系统的价值强烈依赖于无与伦比的基因工具箱，它允许人们表达转基因，以识别，监测和控制复杂^电路18中的单个神经元。神经元活动监测技术的出现（如钙成像，这里讨论）使得能够确定神经元活动模式以响应特定的刺激。通过将基因编码的钙指标（GECIs）的特定Gal4驱动表达与嗅觉刺激相结合，可以可视化感兴趣的神经元的异味引起的钙^{动力学19。}在此协议中，通过进一步将此技术与经典调理范式耦合，可以在学习环境中检查这些嗅觉响应。学习诱导的可塑性可以使用 GECIs 进一步解剖，这些 GECIs 不仅被本地化为单个特定神经元，而且还可分解到神经元的特定子隔间。Pech^等人20建立了一系列工具，正是允许这一点。通过将GCaMP3²¹定位到前或后发孔-通过与脊椎动物突触素或d荷马，^分别20个链接- 这些位点的差分调制可以区分。在此上下文中，这种本地化比大多数在细胞醇中普遍存在的 GECA 具有优势，例如，GCaMP 22、GCaMP3²¹或 GCaMP6²³ ，因为这意味着前和后瞬变可以区别于神经元激活后发生的整体综合钙流入。这可以提供有关由于或导致学习和记忆形成而发生的可塑性的位置和类型的线索。例如，此处提供的协议显示了此工具在嗅觉关联学习期间破译 MB 输出神经元调制的价值，将钙传感器的表达定向到仅对贴子的表达。通过监测，在单个苍蝇内，嗅觉调理前后的异味活动可以直接比较天真的气味反应和所学的气味反应。虽然固定在同一成像室，苍蝇暴露于多种气味。然后，他们收到一个厌恶的关联调理协议，其中一种气味与电击（^成为CS+）配对，而另一种气味在没有强化的情况下呈现（成为CS^-）。最后，苍蝇再次暴露在与第一步相同的气味中。使用双光子显微镜观察钙动力学。

研究方案

1. 转基因果蝇，果蝇黑色素

1. 交叉雌性处女和雄蝇（在12小时光/暗周期中，在60%的相对湿度下提高25°C）分别携带所需的Gal4和UAS^构造25，以产生苍蝇，其中感兴趣的特定神经元表示基因编码钙指示器。
2. 年龄的雌性后代的上述十字架，直到他们在3-6天后，环状。雌性苍蝇更可取，因为它们的体型稍大。

2. 果蝇在体内培养钙成像的制剂

1. 选择一只雌性苍蝇，在冰上麻醉不超过5分钟。
2. 使用精细钳子，将苍蝇放入成像室（如图 1 c所示）。确保胸部和腿部与造型室底部的电线接触，并确保头部平放。使用透明胶带固定苍蝇的位置。
   注:此协议需要一个定制的腔室，其中苍蝇是固定的，头部胶囊可以打开，苍蝇能够同时受到天线的气味刺激和对胸部和腿部的电击（图1）。
3. 使用固定在手术刀手柄上的手术手术刀刀片（见材料表），在苍蝇头部的胶带上切开一个窗口，使天线被覆盖，只有胸腔的前半部分暴露。
4. 用蓝光固化胶包围头部的两侧和背面，使用凹凸钳口持有的昆虫销进行精心操作。使用蓝色发光 LED 灯设置胶水。
5. 检查胶水是否完全设置，并清除飞头背表面残留的未硬化胶水。
6. 应用环铃^溶液24（见材料表）覆盖头部裸露的角质。
7. 使用非常细刀片的刺刀，穿过角质层。为了最有效地去除角质层，首先使用 ocelli 作为起点穿过头部的后部。然后，切开每一侧，中联眼睛，形成角质的皮瓣，可以很容易地撕掉使用钳子。
8. 去除任何可能阻塞大脑感兴趣区域的多余的角质层。
9. 小心清除任何气管的背表面使用精细的钳子，避免脑组织本身中断。根据需要清除环鸣器溶液^24（参见材料表），以清除组织碎片区域。
10. 将皮下气味输送针放在位置，距离苍蝇头部约 1 厘米。确保没有任何东西会阻碍气味传递到天线。
11. 在显微镜下，通过皮下气味输送针将成像室连接到气味输送系统。
12. 为了让苍蝇完全从麻醉和手术中恢复，并适应气流，在此阶段实施10分钟的休息期。

3. 体内钙成像

1. 使用装有红外激光和水浸物的多光子显微镜（见材料表），安装在振动隔离的桌子上。为了可视化基于GFP的钙指标，将激光调谐到920nm的激发波长，并安装GFP带通滤波器。
2. 使用粗 Z 调节旋钮，扫描大脑 Z 轴并定位感兴趣的大脑区域。使用裁剪函数仅将扫描焦点集中在此区域，以最小化扫描时间，并旋转扫描视图，使头部前朝下。
3. 将帧大小调整为 512 x 512 px，扫描速度调整为 > 4 Hz，以及扫描区域（在 Y 维度中），以便覆盖感兴趣的神经元。

4. 通过嗅觉调节，气味引起的钙瞬变的可视化

1. 使用气味传递^{系统19，26，}可以提供几个气味刺激在时间上精确的方式。
   1. 使用额外的计算机来控制设备，并与成像显微镜软件通信，在实验期间将气味刺激与图像捕获进行协调。
   2. 启动一个预编程的宏包，能够连接图像采集软件和气味传递程序（例如，安装在显微镜控制软件中的 VBA 宏包，参见材料表），该软件包可响应外部输入在单独的程序中启动气味传递协议提供的触发器）。
2. 通过监测"预训练"/以512 x 512 px和4 Hz的帧速率监测"预训练"/鼻气味引起的钙瞬变开始测量。 提供2.5 s气味刺激，并额外采集6.25s之前的气味（建立F₀基线值）和 12.5 s 后气味偏移。用第二个气味剂重复，然后用第三个气味剂重复。
3. 继续 3 分钟后，这个测量与经典条件 （"训练"） 苍蝇.
   1. 选择在"预训练"阶段呈现的气味之一，成为 CS⁺气味，而另一种成为 CS^气味。使用计算机控制的气味传递系统呈现 CS⁺气味，用于 60 s 和 12 个 90 V 电击。
   2. 休息60小时后，单独呈现CS气味60s。用作异味剂4-甲基环己烷醇和3-辛醇。在本次培训期间，请勿出示第三种异味剂（例如 1-octen-3-ol），因为它仅在培训阶段（步骤 4.2.）之前和之后（步骤 4.4）用作控制。
4. 在完成训练阶段（步骤 4.3）后 3 分钟，通过重复"训练前"气味刺激方案（步骤 4.2.），再次测量"训练后"异味引起的钙瞬变。
   注:此步骤的时间应反映记忆形成后的兴趣时间（例如，在调理步骤后 3-4 分钟执行此步骤以调查短期记忆）。通常，苍蝇可以生存几个小时，在这种准备。
5. 以适当的格式（例如 Tiff）保存映像文件，以便以后进行图像分析。

5. 图像分析

1. 要分析图像，请打开图像分析软件中的 Tiff（或类似）文件，如斐济²⁷。
2. 使用移动校正算法对齐堆栈，以确保 X 和 Y 方向的最小移动。丢弃在 Z 轴中显示强运动的任何录像。
3. 选择用于标记要检查的区域周围的感兴趣区域 （ROI） 的软件工具。这应尽可能精确，以限制背景荧光的影响。
4. 使用软件的相应工具从所选 ROI 中提取时光荧光强度数据作为数据文件，以便为录制的每一帧生成值。
5. 使用数据分析程序打开数据，以计算每个气味痕迹的 μF/F₀值。F₀ = 气味出现前 2 s 中的平均荧光。[F ] 给定帧中的原始荧光与 F₀之间的差值。从这些值中，计算每个帧的 μF/F₀值，该值可随时间绘制，以反映整个气味刺激周期的相对荧光。

结果

图2中可以看到使用上述协议获取的图像示例。d荷马-GCaMP3在MB输出神经元中表示，其树突内压在MB+-lobe的隔间1（神经元称为MVP2^{28，29），}并使用分裂Gal4线MB112C16进行基因定位。此外，演示的还有细胞细胞的亚细胞定位和合成后局部钙指标的差异。在比较图 2a和图 2f...

讨论

神经回路的解剖是神经科学领域的一个突出目标。果蝇的遗传可及性以及行为测试的广度和易用性使其成为研究此类现象的理想工具。在这里，提出了一种方法，可以在单个苍蝇中可视化由于嗅觉调节而在亚细胞水平上发生的调制。通过进行预训练和训练后对气味引起的钙动力学的可视化（由我们^第17组首先建立），可以在天真和学到的气味反应之间画出直接的、动物内?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape	Tesa SE, Norderstedt, Germany		Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20x40mm
Insect Minutien pins	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blue light-curing glue
Microscope slide	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	0656.1	Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Product No. 11
Surgical scalpel handle	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope.	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.