Abbiategrasso بروتوكول بنك الدماغ لجمع ومعالجة وتتميز الأدمغة الشيخوخة

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع مسارات شيخوخة الدماغ الفردية من خلال برنامج التبرع بالدماغ والتوصيف السليم للأدمغة. ويشارك المتبرعون الدماغ في دراسة طولية طويلة الأجل بما في ذلك التقييمات المتسلسلة متعددة الأبعاد. ويتضمن البروتوكول وصفا مفصلا لمعالجة الدماغ ومنهجية تشخيصية دقيقة.

Abstract

في السكان المسنين باستمرار، من المتوقع أن يرتفع انتشار الاضطرابات العصبية. فهم آليات المرض هو المفتاح لإيجاد تدابير وقائية وعلاجية. الطريقة الأكثر فعالية لتحقيق ذلك هو من خلال الفحص المباشر للأنسجة المخ المريضة والسليمة. يقدم المؤلفون بروتوكولًا للحصول على أنسجة الدماغ ذات الجودة الجيدة التي تبرع بها الأفراد المسجلون في برنامج التبرع بالدماغ قبل الوفاة ومعالجتها وتوصيفها وتخزينها. يتضمن برنامج التبرع نهجًا متعاطفًا وجهًا لوجه مع الأشخاص ، ومجموعة من المعلومات السريرية والبيولوجية والاجتماعية ونمط الحياة التكميلية والتقييمات المتسلسلة متعددة الأبعاد مع مرور الوقت لتتبع المسارات الفردية للشيخوخة الطبيعية والتدهور المعرفي. منذ العديد من الأمراض العصبية غير متناظرة، لدينا بنك الدماغ يقدم بروتوكول فريد من نوعه لشرائح العينات الطازجة. يتم تجميد أجزاء الدماغ من كلا نصفي الكرة الأرضية بالتناوب (في -80 درجة مئوية) أو ثابتة في formalin; شريحة ثابتة على نصف الكرة الأرضية واحد يقابل واحد المجمدة على نصف الكرة الآخر. مع هذا النهج، يمكن الحصول على توصيف الأنسجة الكلدة من جميع المواد المجمدة، ويمكن إجراء دراسات omics على الأنسجة محددة جيدا من الناحية النسيجية من كلا نصفي الكرة الأرضية وبالتالي تقديم تقييم أكثر اكتمالا لآليات الأمراض العصبية. لا يمكن تحقيق التشخيص الصحيح والمُحَدَّد لهذه الأمراض إلا من خلال الجمع بين المتلازمة السريرية والتقييم العصبي، والذي غالباً ما يضيف أدلة etiological مهمة ضرورية لتفسير التسبب. ويمكن أن تستغرق هذه الطريقة وقتا طويلا، ومكلفة ومحدودة لأنها لا تغطي سوى منطقة جغرافية محدودة. وبصرف النظر عن القيود التي تفرضها، فإن الدرجة العالية من التوصيف الذي توفره يمكن أن تكون مجزية. هدفنا النهائي هو إنشاء أول بنك الدماغ الإيطالية، مع التأكيد على أهمية الدراسات الوبائية التحقق من الأمراض العصبية.

Introduction

ووفقاً لمنظمة الصحة العالمية، يعاني حالياً نحو 50 مليون شخص من الخرف، وهو رقم من المتوقع أن يتضاعف ثلاث مرات بحلول عام 2050. مرض الزهايمر هو السبب الرئيسي للخرف، يليه المرض الدماغي الوعائي وغيره من الاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر. وفي عام 2017، أنشأت منظمة الصحة العالمية المرصد العالمي للخرف لزيادة الوعي بالخرف وتشجيع خطة عمل عالمية لمكافحة هذا الالخرف¹. كل فرد لديه مسار الشيخوخة الدماغ الخاصة بهم، وبالتالي فإن البحث عن علاج يمكن أن يكون تحديا نظرا لتعقيد من الأمراض المسببة للأمراض العصبية. ربما، كل شخص يمتلك لها أو له pathogenesis مكتوبة في أنسجة الدماغ تتطلب نهجا شخصية. وهكذا، فإن دراسة أنسجة المخ تكون المفتاح لفهم آليات التنكس العصبي.

إذا نظرنا إلى تاريخ علم الأعصاب، ندرك أن الاكتشافات الأكثر إثارة للإعجاب ورائدة لم يكن من الممكن أن تحدث دون الفحص المباشر للدماغ البشري. على مر الزمن، تغير مصدر أنسجة الدماغ التي سيتم دراستها من تشريحات الخام، و "لقاءات الصدفة" العشوائية، وفي بعض الحالات، التداول غير القانوني، إلى مجموعات الدماغ المنظمة وبنوك الدماغ الحديثة الاستراتيجية. إن النظر في العديد من الجوانب الأخلاقية هو أحد العوامل الرئيسية التي تميز بنوك الدماغ الحديثة عن مجموعات الدماغ في الماضي. تم تأسيس أول بنوك الدماغ الحديثة الحقيقية (BBs) في النصف الثاني من^القرن العشرين. يمكن اعتبار نيكولاس كورسيليس ووالاس تورتيلوت رائدين في الخدمات المصرفية الحديثة للدماغ. في المملكة المتحدة، جمعت Corsellis مجموعة عقد أكثر من 1000 الأدمغة موثقة جيدا المتضررين من مختلف الاضطرابات العقلية والعصبية². وعلاوة على ذلك، ساعدت Corsellis الكشف عن الحاجة إلى الحفاظ على أنسجة الدماغ الطازجة في الجليد من أجل الاختبارات الكيميائية الحيوية³. وفي الوقت نفسه في الولايات المتحدة الأمريكية، قدم والاس تورتيلوت برامج التبرع بالدماغ قبل الوفاة لتسهيل التماس المتبرعين المحتملين للدماغ وضمان أن الأدمغة التي تم جمعها مصحوبة بتاريخ طبي وعصبية كامل^4،5. للحصول على لمحة تاريخية عن مجموعات الدماغ و BBs الحديثة، انظر كارلوس وآخرون. ⁶-

إذاً، لماذا ما زلنا بحاجة إلى أدمغة بشرية؟ لا يمكن إعطاء أمراض الدماغ سوى تشخيص محدد بعد الفحص العصبي. تتحدى الأمراض العصبية التشخيص السريري، وهو المفتاح لتفسير صحيح للعوارض السريرية واكتشاف الأسس النسيجية للمتغيرات المتلازمية الجديدة. في الواقع ، يمكن إعادة تعريف التشخيص استنادًا إلى الصورة المرضية. ومع ذلك، انخفض معدل التشريح في العقود الأخيرة بسبب التطور الأخير لتقنيات التصوير العصبي المبتكرة. من خلال تصوير الدماغ، يمكن تقييم التعديلات المورفولوجية والوظيفية والتمثيلية في الدماغ، وكذلك مدى اختلاء البروتين، في الجسم الحي. ومع ذلك ، في التصوير العصبي الجسمي وغيرها من الدراسات المؤشرات الحيوية يمكن أن تعطي فقط "تقدير" للصورة المرضية لأنها غير قادرة على الكشف عن التغيرات الخلوية والجزيئية الدقيقة. إن التقدم في التصوير الجزيئي واكتشاف المؤشرات الحيوية الجديدة والجزيئات المستهدفة والتتبع⁷ (مثل الأميلويد و TAU والمتتبعات الصغيرة) يجعل الدماغ البشري أكثر غنى عنه لتفسير البيانات التي تم الحصول عليها من التقييمات السريرية واختبار العلامات الحيوية. وعلاوة على ذلك ، فإن التكنولوجيات omics (الجينوم ، الجينوم ، الجينوم ، transcriptomics ، المستقلبومات ، البروتينات ، الدهونوميات، الخ)، التي أجريت على أنسجة المخ الطازجة والمجمدة، فتحت إمكانيات جديدة لفهم آليات المرض واكتشاف الجينات خطر، وعلامات التشخيص والتكهن رواية، والأهداف المخدرات المحتملة^{8،,9،,10،,11،,12،,13،,14، 14،,,16،,17،,18،,19،,1621،,,21،,23.22}

لهذه الأغراض، و BBs الحديثة الأرشيف تتميز بشكل جيد، عالية الجودة أنسجة المخ جعلها متاحة للمجتمع العلمي^3،24. وينبغي أن تكون مصحوبة الأدمغة المقدمة من BBs من قبل التاريخ السريري الكامل. ويشمل نشاط BB ما يلي: (1) الاعتراف وتجنيد الأفراد المرضى والأصحاء في برامج التبرع بالدماغ؛ (2) و"1" تدريب الأفراد المصابين بأمراض صحية. الشرط المثالي هو تحقيق متابعة متعددة التخصصات من المتبرعين طوال الحياة للحصول على كامل السريرية، ونمط الحياة والتاريخ الاجتماعي، وملامح العلامات الحيوية؛ في الواقع، الاحتياطي المعرفي وهيكل الدماغ تعتمد على نمط الحياة والعوامل الاجتماعية التعليمية^25،26، وبالتالي فإن هذه المعلومات تثري البيانات الإجمالية في متناول اليد. (2) اكتساب الدماغ (الذي يتكون من المخ، المخيخ وسيقان الدماغ) والأنسجة ذات الصلة (مثل الحبل الشوكي، الأعصاب القحفية و ganglia، الخ) بعد زوال المتبرع، في حين أن جميع مراعاة اللوائح القانونية والأخلاقية الموحدة. (3) المعالجة المناسبة (تشريح، تثبيت، تجميد) من الدماغ، على النحو المحدد في بروتوكول المنطوق موحدة، للحصول على أنسجة عالية الجودة والسماح للاستخدام في المستقبل في البحوث متعددة التخصصات. (4) توصيف الأمراض العصبية مفصلة توفير التشخيص النهائي المحدد. (5) تخزين وتوزيع مواد الأنسجة إلى مجتمع البحوث^27،28.

جميع BBs تخزين كل من المجمدة وsinsin-ثابت- البارافين الأنسجة جزءا لا يتجزأ. كل BB له بروتوكول الخاصة به. باستثناء دراسات معينة، مثل بروتوكول قطع نصفين من معهد البحوث الطبية الحيوية (نيو جيرسي)²⁹ ودراسة Deramecourt لعلم الأمراض الدماغية³⁰، أكبر BBs في العالم ببساطة قطع المخ والاخين و الدماغ على طول خط الوسط (طائرة القوس). يتم تشريح نصف واحد الطازجة ثم جمدت للدراسات الكيميائية الحيوية، في حين يتم إصلاح الآخر في formalin لتقييم الهدولوجي. لذا، يتم إجراء التحليلات الكيميائية الحيوية والهوسولوجية بشكل منفصل في كل نصف الكرة الأرضية. يعتمد القرار فيما يتعلق بالجانب الثابت أو المجمد (الجانبي) على بنك المفرد^{31،32،33،34،35}. كما العديد من الأمراض العصبية غير متناظرة, BB لدينا يقدم بروتوكول فريد من نوعه لشرائح العقول الطازجة: الأجزاء المجاورة من جذع الدماغ وكل نصف الكرة الأرضية هي بالتناوب ثابتة ومجمدة; شريحة ثابتة على نصف الكرة الأرضية واحد يقابل واحد المجمدة على نصف الكرة الآخر. من خلال هذه الطريقة ، يتم تحسين استخدام أنسجة الدماغ ، ويمكن تحقيق توصيف الأنسجة الكاملة لجميع المواد المجمدة مع إمكانية الحصول على ومقارنة المعلومات النسيجية والبيوكيميائية من جميع المناطق في نصفي الكرة الأرضية.

إطار مشروع بنك الدماغ لدينا هو بلدة آبياتيغراسو. Abbiategrasso هي بلدة صغيرة على بعد حوالي 22 كيلومترا جنوب غرب مدينة ميلانو، في شمال إيطاليا. يبلغ عدد سكانها حوالي 32,600 شخص. وهي موطن لمؤسسة غولجي-سينسي (GC). مؤسسة GC هي جزء من مستشفى كبير لإعادة تأهيل المسنين (ASP Golgi-Redaelli)، وهي معهد يركز على البحوث حول الشيخوخة ورعاية المسنين. ويركز بشكل خاص على دراسة الشيخوخة العقلية، والعوامل الاجتماعية والسلوكية التي تؤثر عليه، وعلم الأحياء وعلم الأمراض الكامنة وراء الاضطرابات العصبية المعرفية المعتمدة على العمر(1). وفي عام 2009، أطلقت مؤسسة GC دراسة طولية جديدة شارك فيها 1321 مشاركاً (من أصل 1644 موضوعاً مؤهلاً: معدل استجابة أولي قدره 80.3 في المائة) ولد بين عامي 1935 و 1939 (تتراوح أعمارهم بين 70-75 سنة)، من العرق القوقازي، ويعيش في نفس المنطقة الجغرافية الصغيرة. كانت الدراسة تسمى InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso؛ باللغة الإنجليزية: Brain Aging Abbiategrasso , ClinicalTrials.gov , NCT01345110) وهي جارية حاليًا. InveCe.Ab ومن المقرر الحصول على الفوج مع أقصى قدر من التجانس والأقل تقلبا من أجل تقييم وقوع, انتشار والتاريخ الطبيعي للخرف, جنبا إلى جنب مع عوامل الخطر المحتملة أو الحماية, بما في ذلك السلوكية, النفسية والاجتماعية, المتغيرات السريرية والبيولوجية³⁶. وتوجد خصائص الفوج في الشكل 1 والجدول 1. البيانات الوبائية تتفق مع اتجاه الخرف في السكان الأوروبيين^37,38 و InveCe.Ab المشاركين لديهم خصائص وراثية وبيئية متجانسة, تمثل نموذجا جيدا لدراسة مسار من الشيخوخة الطبيعية إلى الاضطرابات العصبية المعرفية. والواقع أن السكان المتجانسين يحتاجون إلى عدد أقل من الأشخاص للوصول إلى قوة إحصائية كافية. وقد تم بالفعل الإبلاغ عن منهجية InveCe.Ab في مكان آخر³⁶ ولكن من المهم التأكيد على نهجها متعدد الأبعاد من خلال الشيكات الدورية (كل 2-3 سنوات) باستخدام نفس المجموعة من التقييمات بما في ذلك: أخذ عينات الدم (لوحة التمثيل الغذائي، الحمض الهوموسيستين والفيتامينات، واستخراج الحمض النووي لملف Apolipoprotein E (APOE) وغيرها من الأشكال الجينية المتعلقة بالإدراك والشيخوخة)، والقياسات الأنثروبومترية (الوزن والطول والخصر)، والحديث أثناء اختبار المشي (اختبار المهمة المزدوجة)، مقابلة لتقييم نمط الحياة (الالتزام بالنظام الغذائي المتوسطي، ومستويات النشاط البدني والمشاركة المعرفية) والعوامل الاجتماعية (المشاركة الاجتماعية، والوحدة)، والتقييم العصبي العصبي إن مقارنة مثل هذه البيانات الطولية مع البيانات العصبية بعد الوفاة سيكون أمرًا حاسمًا للبحث. لذلك، فإن فريقنا وخاصة الدكتورة ميشيلا مانجيري تصور النهج العصبي المذكور أعلاه. منذ عام 2014 وخلال المتابعة الثانية ، طُلب من المشاركين InveCe.Ab التبرع بأدمغتهم ، وبالتالي تحقيق ولادة بنك الدماغ Abbiategrasso (ABB). الجهات المانحة الأساسية من ABB هي InveCe.Ab المشاركين ولكن ABB مفتوحة الآن للجهات المانحة المتطوعين الآخرين. هم مرضى من ASP Golgi-Redaelli، موطن للعديد من المرضى المصابين بأمراض عصبية مختلفة أو المتطوعين البالغين الذين يتعلمون عن مشروع ABB وينتمون إلى نفس المنطقة الجغرافية (Abbiategrasso والمناطق المحيطة). ويخضع جميع المانحين لنفس بروتوكول التقييم.

يقترح المؤلفون طريقة لتتبع المسارات الفردية للشيخوخة العادية والتقدم المحتمل إلى الأمراض غير السارية ، وإدارة ومعالجة وتوصيف الأدمغة المكتسبة من هؤلاء المانحين بعد طولية. وعلاوة على ذلك، فإن هدفنا هو الالتقاء وإشراك الأفراد في التقييمات العصبية الدورية، والحلقات الدراسية والأنشطة التعليمية المتعلقة برفاهية الدماغ، وزيادة وعيهم بالتبرع بالدماغ لأغراض البحث.

Protocol

تماشيا مع لجنة أخلاقيات البحث البشري في مؤسستنا ومدونة قواعد السلوك في المعهد، فإن ABB تقوم بأنشطتها وفقًا للمعايير الأخلاقية^39،40. تم تقديم إجراءات حصاد الدماغ إلى المعتمدة من قبل لجنة الأخلاقيات في جامعة بافيا في سياق دراسة InveCe.Ab³⁶. وقد كانت إجراءات الدراسة متفقة مع المبادئ المبينة في إعلان هلسنكي لعام 1964 والتعديلات التالية. استمارة الموافقة كاملة وسهلة الفهم. الانضمام إلى برنامج التبرع هو قرار شخصي، وهناك حاجة إلى الوعي الكامل. وفي حالة عدم اعتبار الشخص مؤهلاً لتوقيع استمارة الموافقة، فإن الحصول على إذن من الوصي القانوني أو أقرب الأقرباء (NOK) له ما يبرره. 10- ويفيد الجدول 2 عن معايير الإدماج والاستبعاد فيما يتعلق بالتبرع بلدماغ. وقد أجريت البحوث تحت إشراف فيدرازيوني الزهايمر إيطاليا.

1. التوظيف في برنامج التبرع بالدماغ

1. دعوة الأشخاص الذين أعربوا عن اهتمامهم بالتبرع بالدماغ و/أو وصيهم القانوني لتقديم المشروع (نطاق برنامج التبرع؛ وعملية إزالة الدماغ، والحفاظ عليه، واستخدامه، وتوزيعه)، والحق في الانسحاب من البرنامج في أي وقت، وحماية عدم الكشف عن الهوية، واستراتيجيات المتابعة. مناقشة إمكانية إجراء تحقيقات إضافية في المؤشرات الحيوية واختبارات جينية. لاحظ رغبات المتبرع المحتمل أو NOK له أن تكون على علم بالنتائج.
2. شرح جميع الجوانب الاقتصادية بما في ذلك عدم وجود مكاسب مالية لكل من المؤسسة والمتبرع (يتم التبرع بالعقول وتوزيعها بشكل إيثاري). إبلاغهم بأن ABB تغطي تكاليف نقل الجثث، في حين أن الأسرة تغطي تلك المتعلقة بالجنازة أو الدفن أو الحرق.
3. في حالة القبول، الحصول على توقيع الموافقة على المشاركة في برنامج التبرع. امنح المتبرع رمزًا رقميًا فرديًا لضمان عدم الكشف عن هويته. دوِّن رقم تعريف المشاركين في الدراسة الطولية، وقدم رمزًا آخر لبنك الدماغ للفصل بسهولة بين المجموعتين الفرعيتين للمانحين (المشاركون أو غير المشاركين في الدراسة الطولية؛ انظر الجدول 3).
4. إعطاء المتبرع بطاقة هوية تعلن عن وضعه كمتبرع ويعرض رقم الهاتف (متاح على مدار الساعة) لإبلاغ بنك الدماغ بوفاته.

2 - تقييم الجهات المانحة والمتابعات التسلسلية

ملاحظة: من الممكن إعطاء الموافقة فقط لبعض الفحوص المذكورة أدناه وليس جميعها. يتم إجراء جميع التقييمات السريرية من قبل نفس الفريق بما في ذلك طبيب أعصاب، وطبيب شيخوخة لديه خبرة في علم الأعصاب و3 علماء نفس. إذا ظهرت أعراض جديدة أو تقدم التدهور المعرفي، يمكن تقصير الفترة الزمنية بين المتابعات.

1. كما هو الحال في دراسة InveCe.Ab ، الحصول على استبيان نمط الحياة الاجتماعية ، بما في ذلك درجة من الاستقلالية (ADL ، IADL) ، والعادات الشخصية ، والعوامل الاجتماعية ونمط الحياة التي قد تؤثر على الوظائف العقلية. جمع الأسرة، والتاريخ الطبي والعصبية مع المعلومات المتعلقة الوراثية، والعدوى، السامة، والتمثيل الغذائي، المناعة الذاتية، والقلب والأوعية الدموية، والصدمات النفسية، والتنكسية، والأمراض العصبية. جمع الفحوصات السريرية السابقة وقائمة العلاجات الدوائية.
2. إجراء تقييم واسع النطاق الحركية العصبية بما في ذلك اختبار لوظيفة الأعصاب القحفية، أوكولي، وميدان البصرية، وقوة العضلات ونبرة، والحساسيات، وردود الفعل وتر، وردود الفعل الظهارية والبدائية، وعلامات الحساسية، والموقف، مشية، والحركات، والتنسيق، وظائف العضلة العاصرة، وأي وجود علامات البؤري أو بابينسكي. تقييم اللغة والحالة العقلية وأي تغيير في السلوك.
3. إجراء تقييم عصبي إدراكي واسع النطاق بما في ذلك الإدراك العالمي وتقييم عصبي عصبي كامل لمجالات إدراكية محددة: الذاكرة اللفظية والبصرية، والاهتمام، والسرعة الحركية النفسية، واللغة، والذاكرة الدلالية، والوظائف التنفيذية، وقدرات visuospatial(الجدول 4 للحصول على التفاصيل). النظر في وجود الاكتئاب (CES - D مقياس).
4. الحصول على عينة الدم التي تستخدم في كل من تحليل كيمياء الدم(الجدول 5)والعزل وتخزين الحمض النووي والبلازما والخلايا أحادية النوى الدموية الطرفية (PBMC). تحديد APOE genotyping (rs429358 و rs7412) (تم تحديد التنميط الجيني أكثر شمولا في InveCe.Ab المشاركين؛ انظر الجدول 6). سجل تخطيط القلب (تعديلات القلب، الرجفان الأذيني) وكهربية الدماغ حالة يستريح للتحليل الكمي (QEEG).
5. النظر في اختبار المؤشرات الحيوية الاختيارية بما في ذلك السائل النخاعي (CSF) TAU, فوسفو-تاو وβ اميلويد, وتصوير الدماغ (التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف في انحطاط الجسم الحي, نقص التروية أو التهاب; FDG-PET للكشف عن فشل الأيض; PIB-PET للكشف عن الداء ال amyloidosis الدماغ المتعلقة بالزهايمر فيزيائية المرض).
6. خطط لبرنامج الفحص اللاحق للمتبرع الدماغي. إعداد الفترات الزمنية وفقا لمختلف الفئات العمرية (حتى 64 سنة: كل 10 سنوات، 65-74 سنة: كل 3 سنوات، من 75 سنة فصاعدا: كل 2 سنة).
7. تعيين التشخيص السريري و / أو التشخيص العصبي المعرفي وفقا لDSM-V. تصنيف التدريج الخرف السريري مع تصنيف الخرف السريري (CDR) درجة. تحديث CDR في الفترة الأخيرة قبل الوفاة.
8. إعداد قاعدة بيانات رسومياً مشابهة للورقة الواحدة. إدراج كافة البيانات التي تم جمعها في قاعدة بيانات بنك الدماغ. خطط لمراجعة من كاتب آخر للتحقق من وجود أي أخطاء.

3. وقت الوفاة وإزالة الدماغ

ملاحظة: ينص القانون الإيطالي على أن المُستَدَر يجب أن يدوم أكثر من 20 دقيقة لتأكيد الوفاة. يسمح تسجيل مخطط كهربية القلب المسطحة (ECG) لمدة لا تقل عن 20 دقيقة (المسمى بـ thanatography) بإجراء تشريح للجثة في غضون 24 ساعة من الوفاة (DPR 285/90 art. 8 والقانون رقم 578 Dec 29, 1993). وقت تشريح الجثة من < 24 ساعة هو هدف جيد للحفاظ على جودة الأنسجة بشكل عام. في حالة وقت ما بعد الوفاة > 30 ح يتم إلغاء تشريح الجثة (انظر الجدول 2). ويتألف فريق التشريح من أخصائي في علم الأمراض، وطبيب أعصاب و/أو أخصائي في علم الأعصاب، وممرضة، وفني غرفة تشريحية، وأي طلاب متدربين؛ يقوم أول عضوين بالفريق أيضاً بإجراء التشخيص العصبي. أثناء التعامل مع الجثث وتشريحها ، يكون استخدام الملابس المناسبة (المعطف والقفازات والنظارات الطبية وشرّة الشعر) إلزاميًا. في هذا القسم، نحن وصف الأدوات والمعدات الرئيسية المستخدمة عادة في المختبر لدينا. يمكن للقراء اختيار الأدوات التي سيتم استخدامها حسب تقديرهم. للحصول على وصف تفصيلي للمواد المستخدمة هنا، يرجى الاطلاع على جدول المواد.

1. تأكد من أن وكالة الجنازة التي تختارها العائلة تجلب الجثة إلى مرافق ABB. إجراء التصوير التانوغرافي الذي يجب أن يكون نشاط القلب غائباً خلاله. إذا كان الأمر كذلك، وقع شهادة وفاة والبدء في إجراءات تشريح الجثة.
2. نقل الجثة إلى غرفة التشريح. قياس محيط الجمجمة على مستوى أوسع جزء من الرأس. قياس من nasion إلى inion للحصول على القطر الأمامي (APD) ، في حين أن المسافة من أذن واحدة إلى أخرى تعطي القطر عرضية (TD). حساب مؤشر السيفليك (CI) باستخدام الصيغة: CI = TD/ APD x 100.
3. باستخدام مشرط حاد، قم بعمل شق فروة رأس على الطائرة التاجية، من طرف عملية الـ mastoid على جانب إلى آخر، ويمر فوق الرأس. قص الشعر والجلد والأنسجة تحت الجلد وفصل طيتين من فروة الرأس بعناية من الجمجمة تحت. قم بإجراء الشق حتى تصبح الدهون فوق المدارية الصفراء مرئية وتعكس فروة الرأس في وقتٍ ما. سحب الجزء الآخر في الخلف.
4. باستخدام مشرط ملقط، أخذ عينة صغيرة من العضلات الزمنية في كل جانب، وضع واحد في الفورمالديهايد 4٪ وتجميد الآخر (انظر القسم 7).
5. قطع الجمجمة باستخدام منشار كهربائي بعد V-قطع على الجانب الأمامي. إزالة الجمجمة وقطع السحايات. قطعة عينة من دورا على حد سواء ثابتة في الفورمالديهايد 4٪ والمجمدة (انظر القسم 7).
6. الحصول على حوالي 10 مل من CSF عن طريق إدخال 20 G 3.5 في إبرة من خلال الكولسوم الجسم للوصول إلى البطين الثالث. تقييم مظهر, لون والتعكر من CSF وقياس اله pH. ثم، وجعل 10 aliquots من حوالي 1 مل كل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
7. ارفع الدماغ بقوة على كل من الفصوص الأمامية وقطع كل من الأعصاب البصرية في فيندبولوم والشرايين السباتية الداخلية (ICA) والأعصاب القحفية الثالثة والرابعة والخامسة والسادسة. قطع tentorium للوصول إلى fossa الخلفي وقطع الشرايين الفقرية والأعصاب القحفية السفلى. إدراج مشرط عميق قدر الإمكان من خلال ماغنوم الشطة، لخفض الجزء الأكثر من النخاع. عند هذه النقطة، إزالة الدماغ كله بلطف.
8. مع مشرط، يخترق العظام فوق كهف ميكل والحصول على العقدة الغازية من كلا الجانبين. إصلاح العقدة واحد في الفورمالديهايد 4٪ وتجميد الآخر (انظر القسم 7). كسر التورسيكا sella العظمية باستخدام مطرقة جراحية وإزميل لإزالة الغدة النخامية ومن ثم إصلاحه في الفورمالديهايد 4٪ .
9. فحص الجمجمة والدماغ كله للتعديلات العيانية والتغيرات في الأوعية الدموية. مع شريط قياس، وقياس الدماغ الحصول على عرضية وأقطار اتيروبورس. استرداد بعناية دائرة ويليس وتقييم ذلك بشكل جهنم (الشكل 2E) لوجود المتغيرات التشريحية، والآفات أو تضيق الأوعية.
10. خذ 1-2 قطعة من leptomeninges من 2-4 سم² من محدبة والحفاظ عليها في كامل عالية الجلوكوز Dulbecco وسائل الإعلام النسر المعدلة (DMEM) المتوسطة في 4 درجة مئوية تحتوي على 20٪ مصل البقر الجنين (FBS)، 1٪ القلم / سترة، 1% الجلوتامين و 1% من الأحماض الأمينية غير الأساسية (كما نشرت سابقاً، مع بعض التعديلات)⁴¹.
    1. من أجل الحصول على الثقافات الخلايا الليفية، ووضع leptomeninges على طبق بيتري 10 سم وغسل مرتين مع المالحة العازلة الفوسفات (PBS)، في كل مرة التخلص من السائل.
    2. باستخدام مشرط وطرف ماصة، وقطع leptomeninges إلى قطع صغيرة من حوالي 2 أو 3 ملم، البذور 3-4 قطعة في كل بئر من لوحة 6-جيدا المغلفة سابقا مع الجيلاتين في 0.5٪ وملء كل بئر مع 2 مل من المتوسط الكامل تكمل مع 1٪ من أمبروتيرين B (إجراء المعالجة في مجلس الوزراء السلامة الحيوية لضمان عقم الثقافة).
    3. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية، و5٪ CO₂ لمدة أسبوع واحد على الأقل، وقضى التغيير متوسطة كل 3-4 أيام. الخلايا التربسينيزي مع التربسين 1x العقيمة عندما يكون البئر في حوالي 70٪ من التقاء. ضع الخلايا الليفية الليفية الليفية لليبتوينيني في قارورة T75 وملأها بـ 12 مل من المتوسط الكامل. بعد 5 أيام trypsinize والحفاظ عليها في 900 ميكرولتر من FBS و 100 ميكرولتر من ثنائي الفينيل سلفوكسيد (DMSO).
11. فصل وفحص المخ، المخيخ و الدماغ ووزنها بشكل فردي. خلع الغدة الصنوبرية وإصلاحه في الفورمالديهايد 4٪ . إزالة المصابيح الشمية والأعصاب البصرية، وإصلاح أو تجميد واحد من كل زوج، بشكل مستقل عن الجانب. الحفاظ على المخ، المخيخ و الدماغ في الجليد في 4 درجة مئوية على الأقل 2-4 ح حتى جاهزة للتشريح للحد من اضطراب الأنسجة والحد من ليونة الأنسجة.
12. بعد الحصاد، وإيلاء الاهتمام المناسب والرعاية إلى جثة. أعد العظم باستخدام الغراء لاصق عظمى، وغرزة الظهر فروة الرأس باستخدام إبرة جراحية والغرز غير امتصاص.
13. إظهار الاحترام والامتنان للشخص المتوفى من خلال التعامل مع جثة بلطف. تنظيف وحلق الوجه، وغسل وتجفيف الشعر، لأن سيتم وضع جثة في تابوت مفتوح مرئية لأحبائهم.
    ملاحظة: يتم إعادة تكوين الجثث بواسطة فني. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.

4. بروتوكول تشريح ABB

ملاحظة: نفس الطبيب الشرعي و / أو طبيب الأعصاب شريحة الدماغ، المخيخ و المخ تحت غطاء محرك الدخان. يقوم أخصائي علم الأعصاب بترتيب الشرائح بعد القطاعات. ويوثق المتدرب الذي لا يتعامل مع أقسام الدماغ الإجراء بأكمله مع الصور التي سيتم تحميلها إلى قاعدة البيانات لتكون بمثابة دليل خلال مراحل معالجة الأنسجة اللاحقة.

1. باستخدام سكين تشريح، وقطع جذع الدماغ axially وجعل أول قطع على مستوى منتصف الربعي، من خلال colliculus متفوقة، للحصول على شريحتين تعرض نيغرا substantia (SN).
2. جعل بقية التخفيضات للحصول على شرائح جذع الدماغ 8 ملم للحصول على حوالي 10 أقسام. كن حذرا لتشمل التخفيضات التي تمر عبر البونات الرسترالية بالقرب من الهوامش العليا للبطين الرابع لمراقبة coeruleus locus (LC) ومن خلال oblongata medulla أدنى من striae الصوتية فقط فوق قمة السفلية من البطين الرابع أن يكون شرائح بما في ذلك نواة المحرك الظهري من vagus (DMNV).
3. اسم جميع الشرائح في الحس rostrocaudal كما BS (جذع الدماغ) تليها الأرقام العربية لتحديد المقاطع. بعد المقطع الأخير من جذع الدماغ، استخدم التسمية SC (الحبل الشوكي) متبوعة بالأرقام 1-n. حوالي 2-4 يتم الحصول على شرائح SC اعتمادا على عدد من metameres العمود الفقري إزالتها (الشكل 2H-I).
4. تسمية جميع الأقسام لتكون ثابتة أو لتجميد بالتناوب واتخاذ صورة لأرشيف الصور (الشكل 2). ثم إصلاح وتجميد كافة الشرائح كما هو موضح أدناه (الخطوتين 4.7 و 4.8).
5. قطع المخيخ على متن الطائرة القوس لفصل نصفي الدماغين cerebellar على مستوى vermis. تنفيذ تقسيم القوس للحصول على 5 شرائح من كل نصف الكرة الأرضية (الشكل 2F-G).
6. قم بتسمية جميع الشرائح من vermis على أنها CBR أو CBL (لخيخ الرحم الأيمن والأيسر على التوالي) واستخدم الأرقام العربية لتحديد الأقسام. تسمية جميع الأقسام لتكون ثابتة أو مجمدة بالتناوب واتخاذ صورة للأرشيف (الشكل 2). ثم، إصلاح وتجميد جميع شرائح كما هو موضح أدناه.
7. فصل نصفي الكرة الأرضية من المخ عبر الكمالوس(الشكل 2A -B)وشريحة لهم بشكل فريد على متن الطائرة الإكليلي. جعل أول قطع في طائرة عابرة بين شياسم البصرية والهيئات mammillary، من خلال الفص الجبهي، القطب الصدغي، cingulate الأمامي، commissure الأمامي، نواة من Meynert والعنجة القاعدية.
8. أداء القطع الثاني حوالي 1 سم يمر في وقت ما بعد من خلال الهيئات mammillary وفضح ganglia القاعدية، والمهاد الأمامي، subthalamus و amygdala. مواصلة تشريح تشريح المناطق الأمامية والخلفية للحصول على شرائح 1 سم من أجل الحصول على 15-20 أقسام لكل نصف الكرة الأرضية.
9. تعيين الشرائح على سطح مستو. وضعها بعد موقفهم الأصلي في الاتجاه الأمامي، من الأمامية إلى القطب القذالي، مع جزء مستمر مع شريحة السابقة التي تواجه صعودا.
10. بمقارنة المقاطع من نصفي الكرة الأرضية، حدد أقسام بديلة من كل نصف الكرة الأرضية ليتم الاحتفاظ بها كمادة ثابتة أو مجمدة. التعرف على المقاطع الرئيسية التي سيتم إصلاحها ومعالجتها للقشرة الهستوباتية بما في ذلك الفصوص الأمامية والزمنية، وcingulate، العقدة القاعدية، والباسيلات النواة من Meynert، amygdala، المهاد، قرن آمون والقشرة التورتينية، الجيروسكوب الصدغي، الفصوص الجدارية والقذالي.
11. اسم جميع الشرائح بالمعنى الخلفي لL (يسار) أو R (يمين) متبوعة بالأرقام العربية ووضع تسمية تشير إلى ما إذا كانت الشريحة ستكون ثابتة أو مجمدة(الشكل 2A-D). لتحديد المقاطع، قم بأخذ صورة لأرشيف الصور. ثم، إصلاح وتجميد جميع الشرائح كما هو موضح في القسمين 7 و 8.

5. الدماغ والأوعية التفتيش والتقييم المرضي العيانية (بالعين المجردة)

1. إجراء فحص العيانية العامة النظر في التعديلات السحائة، وضمور القشرية المنتشر أو المترجمة، ضمور فرس النهر، توسيع البطين، ضمور cerebellar، ضمور جذع الدماغ، substantia نيغرا شحوب، تعديلات المادة البيضاء (تحديد النوع والموقع).
2. فحص دائرة ويليس النظر تصلب الشرايين والانسداد. تعيين درجة = 1 في وجود تصلب دون تضيق أكثر من 50٪ ، النتيجة = 2 إذا كان الشريان واحد على الأقل هو 50 ٪ أو أكثر من انسداد ، والنتيجة = 3 إذا اثنين أو أكثر من الشرايين هي 50 ٪ أو أكثر من انسداد⁴². تقييم وجود أو عدم وجود علم الأمراض في الأوعية داخل الجمجمة الأخرى.
3. للكشف عن آفات الأوعية الدموية في الدم، فحص نصفي الدماغ، المخ المخيوم و الدماغ. النظر في آفات الثغرات (القطر < 10 مم) ، وهوجية أو نزيفية ونزفية (قطر > 10 مم). إذا كان موجوداً، حدد الحجم في ملليمتر، رقم وموقع. أيضا، النظر في وجود أو عدم وجود البواسير تحت العنكبوتية.

6. مراقبة جودة الأنسجة

ملاحظة: درجة عامل التناسل (AFS) يتراوح بين 0 و 2 وهو مهم في تقييم جودة الأنسجة. لتحديد AFS ، ضع في اعتبارك الظروف السريرية التي تحدث في وقت الوفاة (خاصة الحالات التي تحدد حمض الدماغ) ومدة الحالة الزهية (الموت المفاجئ أو العذاب المطول). إذا AFS > 1، قد لا يكون أنسجة الدماغ من نوعية الأمثل⁴³. النظر أيضا في الدماغ و CSF pH; إذا درجة ال H < 6، قد لا يكون أنسجة الدماغ من نوعية الأمثل^43،,44.

1. تحقق مما إذا كان سبب الوفاة هو الحالات التي يمكن أن تلحق الضرر بأنسجة المخ بما في ذلك نقص الأكسجة، والحمض المطول، والتهوية الميكانيكية، والفشل المتعدد الأعضاء، والحمى العالية، والصدمة القحفية الشديدة، وابتلاع المواد العصبية المسببة للمواد، والجفاف الشديد، ونقص السكر في الدم الحاد، وحالة الصرع، والغيبوبة المطولة. إذا كان أحد هذه الشروط موجوداً، قم بتعيين نقطة واحدة.
2. التحقق من مدة الحالة الهزالية(السريع إذا حدث الموت في غضون 1 ساعة، متوسطة إذا حدثت الوفاة بين 1 و 24 ساعة، ببطء إذا استمرت الحالة الناهضة أكثر من يوم واحد). إذا حدث موت متوسط أو بطيء، قم بتعيين نقطة 1.
3. حساب درجة AFS، وقياس درجة النقش CSF عن طريق إبرة القطب درجة الH والأنسجة درجة PH بواسطة مقياس درجة اله PH سطح على شريحة الدماغ من كل شحم وعلى قسم cerebellar.

7. تجميد الأنسجة

1. الحفاظ على جميع الأنسجة التي سيتم تجميدها في الجليد عند 4 درجة مئوية. ثم، تجميدها بسرعة. وضعها على علبة الألومنيوم prefrozen. تغطية مع لوحة الألومنيوم المتشابكة للحفاظ على مسطحة لهم. وضعها في النيتروجين السائل في -120 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
2. ضع الشرائح داخل كيس بلاستيكي مع رمز التعريف المطابق ورقم الشريحة. تقسيم الأكياس البلاستيكية إلى ثلاثة صناديق التبريد (لنصف الكرة الأيمن، ونصف الكرة الأيسر وعقلها) وتخزينها في -80 درجة مئوية.

8. تثبيت الأنسجة

1. التفاف شرائح في الشاش واحدا تلو الآخر، ووضع شرائح في 10٪ الفوسفات buffered حل formalin. بعد يوم واحد، استبدل حل الفورستين بحل جديد. اتركها لمدة 5 أيام في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية.
2. الحفاظ على جميع شرائح ككل وتقسيم فقط شرائح تحتوي على قرن آمون و amygdala في جزأين (الشكل 3). الجزء العلوي من كل من شرائح تحتوي على الفص الجبهي (R10a-L9a في الشكل 3); سوف تحتوي الأجزاء السفلية على التوالي: (1) اللوزة والفص الصدغي والعصابة القاعدية (L9b في الشكل 3B)، و (2) قرن آمون وجزء من الفص الصدغي (R10b في الشكل 3A). ويتم ذلك من أجل الحفاظ على العلاقة بين مختلف الهياكل.
3. وضع جميع المقاطع في الفوسفات العازلة لمدة 2 أيام على الأقل لغسل وإزالة الصليب ربط المنتجات.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا.

9. الجفاف، المقاصة، البارافين تضمين وإعداد الشريحة

1. إعداد تركيزات متزايدة من الكحول الإيثيل من 70٪ إلى 100٪، والزيلين ومجموعتين من شمع البارافين المنصهر. وضع أقسام الدماغ في المعالج التلقائي للجفاف، وإجراءات المقاصة والتسلل البارافين (استخدام بروتوكولين مختلفين لمعالجة الأنسجة الماكرو (الدماغ وشرائح المخ) والعينات الجزئية (شرائح جذع الدماغ والعينات الصغيرة الأخرى)؛ الجدول 7). تضمين الأنسجة في الشمع البارافين على العفن المعدني أو البلاستيك.
2. حدد الأقسام لشريحة لتقييم جميع المناطق ذات الأهمية تطبيق مؤشر Montine لتوصيف الأمراض العصبية⁴⁵ (الجدول 8). ثم، شريحة المقاطع المحددة.
3. استخدم الزلاجة الجزئية للقطع الكبيرة والصغرى الدوارة لأقسام صغيرة. قطع 5 μm شرائح لHematoxylin وEosin (H & E) تلطيخ و 8 μm شرائح لتلوين أخرى ومناعة الكيمياء. ضع الشرائح على ثلاثة أنواع مختلفة من الشرائح النسيجية: 8.5 سم × 11 سم لأكبر الشرائح ، 5 سم × 7.5 سم لشرائح متوسطة و2.5 سم × 7.5 سم لأصغر منها.
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

10. Deparaffinization، التصبغ النسيجي والكيمياء المناعية (IHC)

1. قم بإجراء إزالة الـ deparaffinization لتمكين التفاعل مع حلول الصبغة المائية. قم بإجراء ذلك باستخدام الزيلين وتقليل تركيز الكحول (5 دقائق لكل خطوة). اِعاد الترطيب لمدة 5 دقائق مع الماء المقطر.
2. استخدام التلطخات النسيجية التالية لتقييم تشوهات الأنسجة المعمارية والهيكلية، والمورفولوجيا الخلوية: H & E (للآفات المجهرية الأوعية الدموية والالتهاب)، كريسيل فيوليت (NISSL؛ لفقدان الخلايا العصبية)، Luxol سريع الأزرق (LFB؛ لإزالة الغموض)، غالياس (لللويحات النيوريكية وخيوط الخلايا العصبية).
3. استخدام الكيمياء المناعية (IHC) من أجل تسليط الضوء على وجود هياكل مستهدفة محددة. وتستخدم المضادة للنيون ومكافحة GFAP لتحديد المقصورات العصبية والزبقية; 4G8، AT8، α-SYN و TDP-43 تستخدم لتحديد البروتينات التي تجمع في الأمراض العصبية(جدول المواد).
   1. pretreat أقسام dewaxed مع 3٪ H₂O₂ لمدة 10 دقيقة ثم شطف في برنامج تلفزيوني. إجراء علاج الاسترجاع مع العازلة 0.01 M citH 6 (الميكروويف متسلسلة لمدة 2، 1 و 2 دقيقة) ل4G8، α-SYN، TDP-43 و NeuN مستضدات؛ استخدام حمض 70٪ فورميك ل4G8 وα-SYN. Preincubate لمدة 30 دقيقة في مصل الماعز العادي 5٪.
   2. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية. في اليوم التالي، شطف المقاطع في برنامج تلفزيوني قبل الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية (تصور + نظام HRP المسمى البوليمر) في تخفيف 1:2 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   3. غسل عدة مرات في برنامج تلفزيوني واحتضان في نظام الكروموجين مع ديامينيبينزيدين (السائل DAB + نظام كروموجين الركيزة) تبحث في التنمية رد الفعل تحت المجهر (التكبير 4-10x). أخيرا غسل المقاطع في برنامج تلفزيوني. مضاد المقاطع في haematoxylin، والجفاف وأغطية مع DPX تصاعد.
      ملاحظة: الجدول 8 يلخص البروتوكول القياسي. قم بإجراء H&E في جميع الأقسام، بينما تستخدم بقع خاصة/محددة وردود فعل على أقسام مختارة. تتطلب حالات مختارة مجالات أو ردود أفعال إضافية. جدول المواد يبين تفاصيل الأجسام المضادة المستخدمة في IHC.

11- التوصيف العصبي الأساسي

ملاحظة: يتم دراسة التعديلات غير محددة أنسجة الدماغ، وأمراض الأوعية الدموية، ومرض الزهايمر (AD) علم الأمراض، غير AD TAUopathies، synucleinopathies، TAR DNA ملزمة البروتين (TDP-43) وعلم الأمراض وآفات فرس النهر. ويستخدم مجهر بصري متصل بكاميرا للكشف عن الآفات المجهرية parenchymal. يتم إجراء التقييم النسيجي من قبل نفس الفريق من الموظفين المدربين في علم الأمراض العصبية، بما في ذلك أستاذ في علم الأعصاب، وطبيب أعصاب وأخصائي علم الأمراض. وهو يستند إلى نهج مونتين^{المعدلة 45} (الجدول 8)بما في ذلك أيضا: (1) غير متجانسة غير AD TAUopathies التي تشكل السمة المرضية للانحطاط الفص فرونتو الزمني (FTLD) المتعلقة برواسب TAU: مرض بيك، غير بطلاقة حبسة التقدمية الأولية (TAU-nfPPA)، الشلل فوق النووي التقدمي (PSP)^46،47 وCortico-Basal انحطاط (اتفاقية التنوع البيولوجي)⁴⁸. بالإضافة إلى ذلك، غير A-AD TAUopathies تشمل الشروط المتعلقة بالشيخوخة ومع عدم وجود أهمية سريرية محددة مثل الأولية المتعلقة بالسن TAUopathy (جزء)⁴⁹، العمر ذات الصلة TAU Astro-Gliopathy (ARTAG)⁵⁰، مرض الحبوب الأرجيوفيليك⁴⁸. (2) ليوي نوع Synucleinopathy (LTS) التي ترتبط بمرض باركنسون (PD) و Lewy الهيئات الخرف (LBD). للبحث عن LTS، وتطبيق الخطوات الهرمية التالية: في البداية، لمبة الشم، جذع الدماغ، اللوزة / القشرة الزمنية. إذا كانت المناطق السابقة إيجابية، إضافة هياكل الحوفي (تشكيل فرس النهر، قشرة الأنف، cingulate الأمامية) ، الجيروسكوب الأمامي الأوسط، الفصوص الجدارية السفلية والقشرة القذالي⁴⁵. إذا كانت الميزات السريرية لـ LBD القشرية موجودة (أي التقلبات و / أو الهلوسة) ، ففكر في الهياكل الحوفية والأيزوكورتكس للخطوة الأولى. (3) الودائع TDP-43، السمة المميزة لـ FTLD المتعلقة بودائع TDP-43: البديل السلوكي للخرف الصدغي الأمامي (bvFTD) ، الخرف الدلالي (SD أو svFTD) ، TDP-nfPPA وFTD-Motor Neuron Disease (FTD-MND). يتم تنفيذ IHC لـ TDP-43 على الأقسام التالية: اللوزة، قرن آمون، قشرة الأنف والجيروسكوب الوسطى الأمامية؛ في الحالات التي يشتبه في FTLD السريرية، والنظر في دراسة أقسام أخرى⁵¹.

1. تقييم التعديلات غير محددة في أنسجة الدماغ في أقسام مختارة باستخدام H & E, NISSL, LFB, و IHC لGFAP وNN. النظر rarefaction العصبية، والخلايا العصبية المنتفخة، الإسفنج، gliosis، فقدان الميالين، وجود أو عدم وجود التهابات أو ورم يتسلل. حدد الموقع السائد لهذه التعديلات.
2. للكشف عن الآفات الأوعية الدموية المجهرية، فحص الشرائح H & E وLFB بما في ذلك ما لا يقل عن قسمين ماكرو نصفي (الأول يمر عبر الأجسام الثديية (قطع شاركو) مع فصوص أمامي وازمني ، العقدة القاعدية، والمهاد الأمامي، amygdala، والثاني يمر من خلال الفص القذالي)، قسم "geniculate" من تشكيل فرس النهر، مقطع واحد cerebellar، وجميع الأقسام الرئيسية الثلاثة من جذع الدماغ (من خلال سوبستانتيا نيغرا، coeruleus locus و DMNV).
   1. الكشف عن مرض الأوعية الصغيرة بما في ذلك تصلب الشرايين, lipohyalinosis, توسيع الفضاء حولية, فقدان المادة البيضاء, leptomeningeal و / أو parenchymal و / أو اعتلال عضلة الدماغ. حدد التقدير (0-3) والموقع السائد^42،52. النظر في وجود أو عدم وجود تسرب الهيموسيدرين، microbleeds وmicroinfarcts.
   2. تقييم مساهمة الأضرار الوعائية في الإعاقة الإدراكية باستخدام مخطط Deramecourt الهرمي (تعديلات جدار السفينة - مرض السفن الصغيرة - المزارع العيانية). لهذا التقييم النظر في قسم الفص الجبهي والصدغي، العقد القاعدية وحصان (نقاط 0-20)³⁰. أيضا، تقدير احتمال أن مرض الأوعية الدموية الدماغية ساهمت في ضعف الإدراك باستخدام درجة VCING (منخفضة متوسطة عالية)، التي تم الحصول عليها من خلال النظر في النقوش المجهرية الهضمية وأمراض الأوعية الصغيرة من الفص القذالي بما في ذلك متوسطة إلى شديدة تصلب الشرايين واعتلال الأوعية الدموية^{الزميل 53}.
3. تقييم أمراض AD باستخدام IHC (4G8) لانتشار الأميلويد. تعريف مراحل ثال (1-5)⁵⁴، مجموع التهديف اميلويد (0-3)⁴⁵، ومورفولوجيا في الموقع (منتشر ، بؤري ، cored).
   1. تقييم مرض AD Tau باستخدام IHC (AT8) ووصف المورفولوجيا السائدة في الموقع (التشابك العصبي الرجفاني ، خيوط الخلايا العصبية ، لويحات neuritic). تعريف مرحلة براك (I-VI +; علامة إيجابية تشير إلى وجود مناطق إضافية من فرط الphosphorylated تاو الأمراض لا تتبع التسلسل الهرمي لBraak)⁵⁵ والسجل الكلي (0-3)⁴⁵.
   2. تقييم لويحات neuritic باستخدام تلطيخ الغالياس وRED درجة (0-3)⁵⁶. ثم، تحديد احتمالية السمات العصبية المقابلة لمتلازمة AD Aالسريرية باستخدام myloid-Bراك-Cنقاط ERAD (ABC درجة 0-3): لا شيء-منخفض-متوسط-عالية⁴⁵.
4. استخدام AT8 IHC لملاحظة وجود أو عدم وجود غير AD تاو الأمراض تحديد الموقع السائدة وصورة غريبة morphologic. النظر في إدراجات الخلايا العصبية مثل اللهب على شكل أو تشابك الجلوبوز, كروية- غلوبال إدراجات (أي, أجسام بيك)⁵⁷, خيوط الخلايا العصبية, نيوريتات dystrophic, الحبوب الأرجيوفيلية; والشوائب الدبقية مثل الخلايا الفلكية معصلة، وstrocytes الشائكة، لويحات الفلكية، الهيئات ملفوف، إدراجات كروية^58،59.
5. استخدم α-syn IHC للكشف عن LTS (أجسام ليوي، والأجسام الشاحبة، ونويات ليوي) على المناطق في المذكرة أعلاه. في حالة الإيجابية، وتطبيق الدرجات McKeith (0-4) لتقييم شدة الآفات⁶⁰; ثم، استخدام مراحل الشاطئ (I-IV) للتوزيع الطبوغرافية (لمبة الشم، جذع الدماغ الغالب، والهيمنة الحوفية، والزُرّب النيوَيّكِي)⁶¹. قارن مراحل الشاطئ وبراك لتحديد العلاقة بين LBD وعلم الأمراض AD^60،61،62.
6. النظر في وجود أو غياب الجلالي Cytoplasmic إدراج (GCI؛ غير Lewy نوع السينوتينال الدبقية) التي هي السمة المرضية لضمور النظام المتعدد (MSA) وتحديد موقعها السائد⁶³.
7. استخدام TDP-43 IHC للكشف عن الودائع TDP-43 على المناطق في الملاحظة أعلاه. تحديد المورفولوجيا السائدة في الموقع: تضمينات الخلايا العصبية السيتوبلازمية (NCIs) ، إدراجات نيوريت Distrophic (DNs) ، التضمينات النووية (NIIs). تحديد النمط: A (NCIs السائدة وDNs: bvFTD و nfPPA); B (NCIs الغالبة: FTD-MND); C (الـ DNs الطويلة السائدة: svPPA و bvFTD)^51,64. استخدام مخطط نيلسون لتحديد وجود TDP-43 في حالات الإعلان^65،66.
8. تقييم الحصين بدءا من قطاع سوبيكولوم وسومر (CA1). استخدام نقاط Rauramaa (0-4): 1-2 للميكروسينتات الدقيقة و الماكرو هافيركتس على التوالي؛ 3-4 المقابلة لفقدان الخلايا العصبية معتدلة وشديدة, على التوالي, وضمور فرس النهر (التصلب الحصين: HS). نشير إلى وجود أو عدم وجود رواسب البروتين المرضية (في ترتيب تناقص وتيرة: pTAU، TDP-43، α-syn)⁶⁷.
9. تحديد التشخيص العصبي وإدخال جميع البيانات المرضية في قاعدة البيانات.
   ملاحظة: الغرف التي يتم فيها تخزين المواد البيولوجية والبيانات المعقولة للمانحين تكون دائما مقفلة ولا يسمح إلا للموظفين المصرح لهم بالدخول، وذلك لضمان الأمن والخصوصية على حد سواء. يتم تخزين المواد البيولوجية المجمدة في المجمدات مقفلة في -80 درجة مئوية، في حين يتم تخزين الأنسجة المضمنة البارافين ثابتة أوفورمين في خزائن مقفلة في درجة حرارة الغرفة. وتستخدم المجمدات المحرك المزدوجة وثلاجة احتياطية موجودة أيضا. وعلاوة على ذلك، ولضمان عمل المجمدات دائما، يتم تزويدها بنظام مراقبة على مدار الساعة في اليوم السابع من اليوم الذي يطلق إنذارا. كما يوجد مولد للطوارئ في حالة انقطاع التيار الكهربائي. يتم إخفاء هوية المشاركين مع رمز رقمي لضمان خصوصيتهم. ولا يمكن للأفراد غير المأذون لهم العودة إلى هوية المانحين وبياناتهم المعقولة. يتم جمع جميع المعلومات في قاعدة بيانات محمية بكلمة مرور؛ وبالمثل، يتم الاحتفاظ بنسخة مطبوعة من هذه البيانات في محفوظات مقفلة.

النتائج

المتبرعين الدماغ وبيانات حصاد الدماغ
في عام 2014، بدأ توظيف المانحين خلال متابعة InveCe.Ab الثانية، التي شملت 1010 من 1061 من الموضوعات المؤهلة (معدل الاستجابة: 93٪، 1010000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 الشكل 1). وفيما يتعلق بالدراسة الطولية InveCe.Ab، فإن 290 من أصل 1010 مشاركين (28.7%) وافق على التسجيل كمانحين (160 مسجلين بالفعل و130 ممن أعربوا عن نيتهم للتسجيل). المستوى التعليمي أعلى لدى المانحين منه في غير المانحين (66٪ من المانحين لديهم مستوى متوسط - عال من التعليم: 8 سنوات أو أكثر من المدرسة)، مما يدل على أهمية الثقافة والتعليم. كما أظهر العديد من الأفراد "الأصحاء" اهتمامًا ببرنامج التبرع بالدماغ. معظم "الضوابط" لدينا تعترف بأنها يمكن أن تتعاطف مع المرضى وأقاربهم، وتريد أن تسهم بطريقة أو بأخرى في البحوث التي تؤدي إلى فهم أفضل للأمراض العصبية. الناس نكران الذات الذين يشاركون بانتظام في الدم أو برامج التبرع بالنخاع خلال الحياة هم أكثر انفتاحا على فكرة التبرع في الدماغ، وكذلك الناس الذين وافقوا بالفعل على التبرع بالأعضاء بعد الموت. وهم يدركون حقيقة أنه على الرغم من أنه لن يكون هناك متلقي حي، فإن تبرعهم سيكون له أهمية كبيرة في البحوث. عامل آخر يساهم في التبرع الدماغ هو تفضيل أن يحرق. حاليا، تشمل مجموعة من المانحين ABB ما مجموعه 427 فردا (290 InveCe.Ab المشاركين + 137 المتطوعين أو المرضى من مستشفى آسيا والمحيط الهادئ Golgi-Redaelli الشيخوخة)، 75٪ منهم 70 سنة أو أكثر. وهناك غلبة واضحة للإناث (64 في المائة) والإناث (64 في المائة) و 15 في المائة من الإناث (20 في المائة) و 15 والمسنين سليمة عقليا (حوالي 85٪). وحتى الآن، تم حصاد 27 دماغا من أصل 40 متبرعا متوفين (67 في المائة معدل تشريح الجثث)؛ ولم يتم تشريح 13 شخصاً لأسباب مختلفة، بما في ذلك عدم إبلاغ شركة ABB عن الوفاة، والإصابات الخطيرة التي أدت إلى تدمير الدماغ، والأمراض المعدية الخطيرة، وحالة CJD 1؛ 4 أشخاص قد ألغت موافقتهم. حتى الآن، تلقى 24 من أصل 27 أدمغة تم حصادها توصيفًا عصبيًا كاملًا مع تشخيص طبي مرضي محدد ، في حين أن الأدمغة الـ 3 المتبقية لا تزال تحت الفحص(الجدول 3). وتشمل البيانات الإضافية لحصاد الدماغ من ABB: متوسط العمر عند الوفاة (81 سنة)؛ ومتوسط العمر عند الوفاة (81 سنة)؛ ومتوسط العمر عند الوفاة (81 سنة)؛ ومتوسط العمر عند الوفاة (81 سنة)؛ ومتوسط العمر عند الوفاة (81 سنة)؛ ومتوسط العمر يعني فترة ما بعد الوفاة (10.37 ساعة)؛ يعني CSF درجة الHH (6.64)؛ متوسط درجة PH الأنسجة (6.07); متوسط وزن الدماغ (1012.86 غرام) ؛ وكان AFS 1 في 90 ٪ من المواضيع المتوفى.

المؤشرات الحيوية العصبية الفسيولوجية (QEEG)
إن QEEG هي جزء من النهج متعدد الأبعاد. وهي طريقة مباشرة وغير غازية وغير مكلفة، مع احتمالية الكشف عن التحويل من اضطراب عصبي إدراكي خفيف (خفيف - NCD أو MCI) إلى اضطراب عصبي إدراكي رئيسي (كبير - NCD أو الخرف). من خلال نهجنا متعدد الأبعاد ، يتم إجراء فحص QEEG عادي ويتم اختبار دوره المحتمل كعلامة حيوية للخرف. تشير بياناتنا عن سلسلة أولية من 36 متبرعًا بالدماغ (18 من كبار السن العاديين (NOLD) و11 مرضًا خفيفًا -NCD و7 NCD رئيسيًا ؛ 9 منها مع تشخيص اعتلال عصبي محدد) إلى أن متوسط نسبة إيقاع ألفا كانت أقل بكثير في الأمراض غير السارية الرئيسية مقارنة بـ NCD المعتدل (p: 0,002) و NOLD (p: 0,033). وعلى العكس من ذلك، كانت ترددات EEG الأبطأ (ثيتا/دلتا) أعلى بكثير في الأمراض غير السارية الرئيسية منها في NOLD/Mild-NCD (انظر المثال في الحالات في الشكل 4). في سلسلة لدينا، يمكن توزيع إيقاع EEG التفريق NOLD / خفيفة-NCD المواضيع من المرضى كبرى NDC بغض النظر عن التشخيص المسببة، مما يشير إلى أن تتأثر إيقاعات الدماغ من عبء الآفات التنكسية بغض النظر عن نوع الآفة. في الواقع ، تظهر 7 من أصل 9 أدمغة تم فحصها الخرف بسبب الأمراض المختلطة. ويبدو أن خصوصية طبيعة علم الأمراض منخفضة ويبدو أن الإيقاعات الكهربائية للدماغ تتأثر بعبء وتضاريس الآفات أكثر من طبيعتها الجزيئية (Poloni، وآخرون إجراءات AD/PD 2019، لشبونة، بيانات غير منشورة).

الحالات الرمزية
وقد يكون بروتوكول ABB مفيداً وضرورياً في بعض الحالات والشروط. مثال على ذلك وجود علم الأمراض غير المتماثلة (الشكل 5). بروتوكولنا مناسب جدا لتحديد وتوصيف هذا النوع من الأمراض. حتى الآن، قمنا بفحص 4 العقول مع مشاركة غير المتماثلة، وبعضها مبين في الشكل 5. العيانية، ضمور الجانب الأيمن (الشكل 5أ) موجود في حالة واحدة مع تضخم البطين الحاد في القسم التاجي الأيمن(الشكل 5C)مقارنة بالجانب الأيسر (الشكل 5B). حالة أخرى تعرض اهان نصف الكرة الأيمن (الشكل 5D) وأخرى تظهر ضمور واضح للجسم المامملي الصحيح (الشكل 5E). على المستوى المجهري، تظهر حالة من FTLD الإيجابية TDP-43 غير المتماثلة التي هي أكثر كثافة في الجانب الأمامي الأيمن مقارنة مع اليسار(الشكل 5F,G).

يتم استخدام وحدات الماكرو(الشكل 6A, C) للحصول على عرض عام. LFB تلطيخ يساعد على تحديد فقدان الميلين (الشكل 6D) و IHC لكل من 4G8 و AT8(الشكل 6ب) يسمح لتقييم توزيع مناعي في نصفي الكرة مع العين المجردة. في سلسلة ABB ، تتوفر أدمغة الأفراد ذوي الصلة للمقارنة.

في الشكل 7، يتم وضع الصور المجهرية لأقسام من أدمغة التوائم المتجانسة جنبًا إلى جنب لتسهيل المقارنة (التوأم 1 (BB137): الشكل 7A ، C ، E ، G ، I ، K مقابل التوأم 2 (BB138 : الشكل 7B ، D ، F ، H ، J ، L). كما هو الحال في دراسة سابقة مماثلة⁶⁸، تمت مقارنة كلا التوأمين من خلال التقييمات السريرية والعصبية. أبلغ التوأمان عن نفس التشخيص للأمراض غير المعدية الرئيسية بسبب تعدد الإثاءات، لكنهما توفيا بفارق عامين عن بعضهما، في سن 83 (بداية الخرف في 72 عامًا) و85 (بداية الخرف في 76 عامًا) على التوالي. أدمغتهم لها صورة عصبية مشابهة جدا، مع ارتفاع الأمراض AD المرتبطة اعتلال الأوعية الدموية الأميلويد. 4G8 مناعية تنتشر في جميع أنحاء القشرة (الشكل 7A, B) و ganglia القاعدية ( الشكل7C, D) مع اللويحات المنتشرة والكثيفة، و cored. كما أنها اكتشفت بوضوح في كل من الأوعية parenchymal وleptomeningeal من القشرة المخيخ(الشكل 7A, B, G-J). في التكبير أعلى، كابكا واضح بوضوح(الشكل 7G، H). AT8 اللويحات المناعية، والتشابكات والخيوط منتشر في القشرية الجدارية لكلا العقول(الشكل 7E, F, L). فيما يتعلق بعبء مرض الأميلويد وNFT ، يعتبر التوأم 1 مرحلة ثال 3 (مونتين A2) ومرحلة Braak 5 (Montine B3) ، في حين يعتبر التوأم 2 المرحلة 5 من ثال (مونتين A3) ومرحلة Braak 6 (montine B3). وكان لديهم نفس سنوات التعليم ونمط الحياة المماثلة؛ ومع ذلك، كان متزوجا واحد (BB137) وأصبح أرملة بعد فترة وجيزة في حين كان الآخر واحد (BB138). وأظهرت درجات مختلفة من التقلبات السريرية الأمراض مع نفس بداية ونفس مسار المرض ولكن في أطر زمنية مختلفة. وهذا يؤكد حقيقة أنه على الرغم من أن المكون الوراثي يلعب دورا رئيسيا في تطور المرض، فإن المكون اللاجيني والبيئي أساسيان في تحديد المظاهر المختلفة قليلا.

في بعض الحالات، لا تتوافق الصورة السريرية مع السمات العصبية. في الشكل 8، تم تعريف حالتين مختلفتين سريريًا على أنها حالات AD ؛ تظهر التحليلات العصبية ، بالإضافة إلى علم الأمراض AD المتوسط ، إيجابية منتشرة لα -syn. في الحالة الأولى، تظهر صورة شديدة LTS (الشاطئ الرابع) أجسام ليوي وجدت بشكل متجانس في جميع أنحاء cingoli الجيروسكوب(الشكل 8A)وفي SN كما إدراج السيتوبلازمي محاطة neuromelanin(الشكل 8B, C). في الحالة الثانية، يتم توزيع أجسام ليوي المرتبطة بـ Lewy neurites بشكل منتشر في اللوزة(الشكل 8D,E)وفي نواة Meynert(الشكل 8F,G)مما يشير إلى تشخيص LTS الحوفي. في الواقع ، فإن تضاريس الآفات بدلا من طبيعتها الجزيئية تنتج المظاهر السريرية.

الشكل 1: مخطط تدفق دراسة Inve.Ce.Ab. عند خط الأساس، كان الانتشار العام للخرف 3٪. وخلال المتابعة، كانت معدلات الانتشار: 4.4% (1)^st69، 7.1٪^(2،10.9٪ (3).^rd وكان معدل الإصابة لمدة ثماني سنوات 15 ف/1000/سنة (95% CI: 13-18 p/1000/year). وبدأ استقدام المانحين في عام 2014 (خلال المتابعة الثانية). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: بروتوكول تشريح المخ (A)، المخيخ (F) و الدماغ (H). تظهر دائرة ويليس ونصف الكرة الأرضية في( E) و (B). تخفيضات الاكليلي من اليمين (C) والجانب الأيسر(D)هي ترقيم و بدلا من ذلك ثابتة ("F") ومجمدة ("C"). تظهر أقسام المخ القوس (G) والأقسام المحورية في جذع الدماغ (I). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تظهر شرائح الإكورينال من اليمين الثابت (A) واليسار (ب) الفص الجبهي الصدغي.
يتم تقسيم الحصين والفص الصدغي (A, R10b) من الفص الجبهي (A, R10a) على الشريحة اليمنى. على شريحة المقابل، وتنقسم اللوزة و ganglia القاعدية (B، L9b) من الفص الجبهي (B، L9a). شريط مقياس: 1.7 سم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التوزيع الطيفي النسبي للقدرات في مواضيع NOLD والأمراض غير السارية الرئيسية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: صور تمثيلية للأمراض غير المتماثلة. (أ) الحالة الأولى: الدماغ مع ضمور الحق. تظهر شرائح الإكليل(B)و(C)تمدد البطين من الجانب الأيمن واضح بشكل خاص في الأقسام 10-12 (C, arrows). في القسمين (ب) و (C) ، "F" تعني الثابتة و "C" للمجمدة (باللغة الإيطالية: congelato). (D) الحالة الثانية: اُفراد شديدة في نصف الكرة الأيمن. (E) الحالة الثالثة: ضمور الجسم المامملي الأيمن (السهم). (F, G) الحالة الرابعة: تظهر الصور المجهرية نشاطًا مناعيًا أكثر كثافة من نوع TDP-43 في القشرة اليمنى الجبهية (G) مقارنة بالأخرى اليسرى (F) في حالة من الخرف الجبهي الصدغي. أشرطة المقياس: 183 ميكرومتر (F, G). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: الجزئات الكلية. (أ، ج) شرائح من الفص الصدغي الصدغي الثابت والفص الجداري الطازج (C). (ب) الهلسولوجية الأمامية والزمنية قسم مناعي مع AT8 الأجسام المضادة. ومن الواضح أن المناعي موزعة في جميع أنحاء القشرة، ولكن أكثر كثافة في الفص الصدغي. (د)القسم الجداري النسيجي الملطخة بـ LFB. يشير السهم إلى منطقة من إزالة الغموض من المادة البيضاء. شريط مقياس: 1.55 سم (B, D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: توأمان. مقارنة بين أدمغة توأمين متماثلين: BB137 (A، C، E، G، الأول، K) وBB138 (B، D، F، H، J، L). الصور العصبية متشابهة جدا. (A) و (B) إظهار الإيجابية 4G8 منتشر في الفص القذالي مع البلاك الأميلويد ، leptomeningeal (السهام) وparenchymal (رؤوس الأسهم) السفن. الشعيرات الدموية اعتلال الأوعية الدموية (النجمية) معترف بها جيدا في التكبير أعلى (G) و (H). 4G8 يتم توزيعها بشكل منتشر في جميع أنحاء العقد القاعدية (C, D) وحول أوعية لبتونينجلي من المخيخ (I, J: السهام). AT8 المناعية تحديد التشابك والخيوط واللويحات (السهام) في القشرة الجدارية (E, F). الغالياس تلطيخ (K) يكشف لويحات neuritic كما AT8 الأجسام المضادة (L)لا. أشرطة المقياس: 470 ميكرومتر (A-F; I-J); 90 ميكرومتر (G-H; ك - ل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: التشخيص السريري مقابل التشخيص العصبي. في هذا الشكل، يتم الإبلاغ عن حالتين مختلفتين يختلف فيها التشخيص العصبي عن التشخيص السريري. إنّ النشاط المناعي لـ α-syn هو نتيجة غير متوقعة. (أ–ج) الحالة الأولى: يظهر Gyrus cingoli (A) توزيعًا متجانسًا لأجساد ليوي في SN (B-arrows). في الخلايا العصبية من SN، يظهر جسم ليوي مزدوج محاط بميلان الأعصاب (C). (D–G) الحالة الثانية: يمكن اكتشاف الإيجابية المنتشرة لـ α-syn في اللوزة (D, E) و Nucleus Meynert (F, G). يتم وضع علامة جيدة على الأجسام الخلوية ونويريت ليوي (العلامة النجمية). أشرطة المقياس: 154 ميكرومتر (A, D, F); 37 ميكرومتر (باء، هاء، زاي)؛ 20 ميكرومتر (ج). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: قالب اتفاقية النقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

		ن	%
الجنسين	الذكور	607	45.9
	الاناث	714	54.1
الفوجة الميلاد	1935	236	17.8
	1936	219	16.6
	1937	264	20.0
	1938	305	23.1
	1939	297	22.5
الحالة الاجتماعية	متزوج	872	66.1
	المعاشره	13	1.0
	منفصل/مطلق	29	2.2
	الارامل	325	24.6
	واحد	80	6.1
احتلال الحياة الأولية	عمال ذوي الياقات الزرقاء	666	50.6
	عمال ذوي الياقات البيضاء	459	34.9
	ربه منزل	191	14.5
سنوات التعليم	≤ 5 سنوات	754	57.2
	>5 سنوات	565	42.8

الجدول 1: السمات الاجتماعية الديمغرافية للمشاركين في دراسة InveCe.Ab.

معايير الاشتمال	معايير الاستبعاد
جميع الأفراد الذين تتراوح أعمارهم بين 18 سنة فما فوق	الناس الذين يرفضون بشكل صارخ التبرع
الناس الذين يعيشون داخل أراضي آبياتيغراسو	الناس الذين يعيشون خارج منطقة لومبارديا
المتطوعون الذين يمنحون موافقتهم بأنفسهم	التناقضات بين المانح المحتمل ورغبات NOKs فيما يتعلق بالتبرع بالدماغ
أشخاص غير قادرين على اتخاذ قرار بإذن من NOK	الحالات التي تدمر إلى حد كبير اتساق الدماغ
الوفاة بسبب طبيعي	دورة سريرية من <2 سنوات ما لم يتم استبعاد احتمال الإصابة بمرض بريون
	الوفاة الناجمة عن القتل أو الانتحار، مع الحاجة إلى تقرير الطبيب الشرعي
	فاصل ما بعد الوفاة > 30 ساعة

الجدول 2: معايير التبرع الدماغي.

N°	الجنس	كود BB	التعليمات البرمجية InveCe	العمر	edu (سنوات)	تشخيص إكلينيكي			مجلس الانماء	المؤسسه	PM (ساعة)	أنسجة pH	الخمور pH	التشخيص العصبي
1	و	BB 37		87	5	الرئيسية - NCD بسبب AD (BPSD)			5	2	29	Nd	Nd	عالية AD علم الأمراض، متوسط SVD، TDP43+، CTX LTS، HS
2	و	BB 105		94	5	الرئيسية - NCD بسبب AD			5	1	5	5.72	6.78	عالية AD علم الأمراض، وSVD خفيفة، HS
3	و	BB 137		83	3	الرئيسية - NCD بسبب تعدد الإلتيولوجيا (AD-VaD)			5	1	16	Nd	Nd	عالية AD علم الأمراض، متوسط SVD، afarct القذالي، CAA-capCAA
4	م	BB 181		71	13	الرئيسية - NCD بسبب AD (BPSD)			5	2	3	Nd	Nd	LTS شديدة (الشاطئ الرابع)، علم الأمراض مُتوسط، mildSVD، mCAA
5	م	BB 115	I 636	78	18	الرئيسية - NCD بسبب AD			5	1	6	Nd	Nd	متوسطة AD، معتدلة SVD، التهاب، ILBD (شاطئ IIa)، HS
6	و	BB 23	أنا 65	79	3	الرئيسية -NCD بسبب مرض الأوعية الدموية			5	1	14	Nd	Nd	شديدة وواسعة النطاق CAA، علم الأمراض م. م. المتوسط
7	م	BB 102	I 412	79	8	الرئيسية -NCD بسبب مرض الأوعية الدموية			3	1	8	Nd	Nd	الخرف الوعائي، ILBD
8	م	BB 224	أنا 16	80	3	الرئيسية - NCD بسبب تعدد الإتّواهات			5	1	11	Nd	5.99	متوسط SVD، انخفاض علم الأمراض الإعلان، ILBD (شاطئ IIa)، HS
9	و	BB 47		78	5	الرئيسية - NCD إلى تعدد الإبتداءات (LBD-VaD BPSD)			5	0	8	Nd	Nd	عالية AD علم الأمراض، BG تاو الأمراض، ARTAG، SVD معتدل، HS
10	و	BB 153	I 965	79	5	خفيفة -NCD (الوفاة بسبب سرطان القولون مع الانبثاث على نطاق واسع)			0.5	1	8	Nd	6.73	انخفاض AD علم الأمراض، معتدلة BG-SVD
11	م	BB 118	I 1211	79	13	NOLD (الوفاة بسبب سرطان الكبد)			0	2	3	Nd	6.51	متوسطة SVD
12	م	BB 236	I 521	80	3	الرئيسية - NCD بسبب AD (BPSD)			4	1	15	Nd	6.15	عالية AD علم الأمراض، BG-SVD شديدة (العديد من microbleeds)، HS
13	و	BB 138		85	3	الرئيسية - NCD بسبب تعدد الإلتيولوجيا (AD-VaD BPSD)			4	0	15	Nd	6.75	عالية AD علم الأمراض، متوسط SVD، CAA، الحوفي TDP43
14	م	BB 109	I 876	79	8	NOLD (الموت بسبب ورم في الدماغ - GBL)			0	1	16	Nd	6.4	انخفاض AD علم الأمراض، ILBD (شاطئ IIa)، متوسط SVD
15	و	BB 271		84	8	الرئيسية - NCD بسبب AD (BPSD)			4	1	2	Nd	6.7	مُرَج متوسط، LTS الحوفي، BG-SVD معتدل، mCAA، TDP
16	و	BB 71	أنا 1080	79	8	NOLD (الموت بسبب قصور في القلب)			0	0	6	Nd	6.26	معتدلة BG-SVD، ILBD، ايمي TDP، منخفضة AD
17	و	BB 189	I 858	80	5	الرئيسية - NCD بسبب AD (BPSD)			3	0	20	Nd	6.42	إعلان متوسط، CAA-capCAA، TDP43، متوسط BG-SVD، HS
18	و	BB 278	I 924	80	5	الرئيسية - NCD بسبب LBD (BPSD)			3	1	5	6.02	7.05	إعلان متوسط، LTS حوفي (الشاطئ الرابع)، TDP حوفي، HS
19	و	BB 247		104	8	الرئيسية- NCD بسبب تعدد الإلتيولوجيا (ربما علم الأمراض المختلط)			3	0	6	6.48	7.22	تاو علم الأمراض (PART-ARTAG), HS
20	م	BB 85	أنا 19	83	10	الرئيسية - NCD بسبب LBD (BPSD)			3	1	9	6.26	7.3	حاد LTS حوفي, إعلان متوسط, متوسط SVD, حاد CAA-capCAA, HS
21	و	BB 14	I 222	82	8	الرئيسية - NCD بسبب تعدد الإلتيولوجيا (AD-VaD)			2	1	11	5.59	6.4	علم الأمراض المتوسط AD، متوسط SVD
22	و	BB 282		76	8	الرئيسية الأمراض غير المعدية الصدغية الجبهي (nfPPA BPSD)			3	1	10	6.07	6.39	TDP (نوع A)، ILBD، متوسط SVD، إعلان منخفض، HS
23	و	BB 154	I 1079	80	5	NOLD (الموت بسبب السرطان مع الانبثاث على نطاق واسع)			0	1	5	6.49	6.9	متوسط SVD، CAA، منخفض AD، التهاب الدماغ الحوفي
24	و	BB 290		65	13	الرئيسية الأمراض غير المعدية الجبهي (bvFTD BPSD)			5	1	12	5.73	6.42	TDP (النوع أ)
25	و	BB 210		89	8	الرئيسية - NCD بسبب AD (BPSD)			5	1	15	5.94	6.4	قيد التقدم
26	م	BB 293		75	18	الرئيسية الأمراض غير المعدية الصدغية الجبهية (bvFTD BPSD)			5	1	8	6.14	6.83	قيد التقدم
27	و	BB 99	I 1370	79	9	NOLD (الموت بسبب صدمة الإنتان)			0	2	14	6.3	7.12	قيد التقدم
	م/واو			يعني	يعني				يعني	يعني	يعني	يعني	يعني
	0.5			81	7.7				3.2	1.0	10.4	6.1	6.6

الجدول 3: التشخيص السريري/العصبي للسلسلة ABB. BB: بنك الدماغ; edu (سنوات): سنوات التعليم؛ CDR: تصنيف الخرف السريري (0 = عدم وجود الخرف؛ 0.5 = ضعف إدراكي خفيف؛ 1 = الخرف الخفيف؛ 2 = الخرف المعتدل؛ 3 = الخرف الشديد؛ 4 = خرف شديد جدا؛ 5 = الخرف الطرفي)؛ AFS: نقاط عامل الزهية; PM (ساعات) : ساعات ما بعد الوفاة ؛ nd: لم يتم ذلك؛ م/واو: ذكور/إناث؛ BPSD: الأعراض السلوكية والنفسية للخرف; VaD: الخرف الوعائي; NOLD: المسنين العاديين; GBL: الورم الأرومي الدبقي; nfPPA: غير بطلاقة الحبسة التقدمية الأولية; bvFTD: البديل السلوكي للخرف الجبهي الصدغي؛ SVD: مرض السفن الصغيرة; LTS: ليوي نوع Synucleinopathy; HS: التصلب الفرسان; CAA: اعتلال الأوعية الدماغية الأميلويد; كابكا: الشعيرات الدموية CAA; mCAA: رجاء CAA; ILBD: عرضية ليوي أمراض الجسم; BG: بسال جانغليا؛ ARTAG: تاو استرو- اعتلال الدبقية المرتبط بالسن؛ جزء: الأولية المتعلقة بالسن TAUopathy; ايمي: أميغدالا.

المجال	اسم الاختبار
الاكتئاب	مركز الدراسات الوبائية مقياس الاكتئاب (CES-D) [2]
الإدراك العالمي	مصغرة فحص الدولة العقلية (MMSE) [1]
الذاكرة اللفظية والبصرية	الحرة و cued انتقائية تذكير اختبار [3]
	اختبار كورسي [4]
	ري-أوستريث الرقم المعقدة (ROCF) أذكر [5]
انتباه / سرعة الحركية	درب صنع A [6]
	مصفوفات الانتباه [4]
ذاكرة اللغة الدلالية	الطلاقة اللفظية الدلالية (الألوان والحيوانات والفواكه والمدن) [4]
الوظائف التنفيذية	درب صنع B [6]
	الغراب الملون المصفوفات [7]
قدرات Visuospatial	اختبار رسم الساعة (CDT) [8]
	ري-أوستريث الشكل المعقد (ROCF) نسخة [5]

الجدول 4: التقييم العصبي النفسي للمتبرعين الدماغ.

الايضات

تعداد الدم الكامل

الكوليسترول HDL و LDL

الدهون الثلاثيه

الجلوكوز

الهيموغلوبين الجليك (HbA1c)

الهموسيستين

كوبالامين (فيتامين ب12)

الفولات

الزلال

اليوريا

الكرياتينين

ترانسميناسيس (ALT و AST)

غاما جلوتاميل transferase

هرمون تحفيز الغدة الدرقية (TSH)

فيتامين (د) (25-هيدروكسي فيتامين د)

بروتين سي التفاعلي (CRP)

الشوارد

الجدول 5: لوحة التمثيل الغذائي للمتبرعين الدماغ.

اسم الجين	dbSNP
Apolipoprotein E (APOE)	rs429358
	rs7412
كاتالاس (CAT)	rs1001179
أكسيد فائق dismutase 2 (SOD2)	rs4880
أنجيوتنسينوجين (AGT)	rs699
سيرتوين 2 (SIRT2)	rs10410544
غشاء الميتوكوندريا الخارجي 40 (TOMM40)	rs2075650
التكامل في الجسور 1 (BIN1)	rs7561528
كاتيشول-O-ميثيل ترانسفيراز (COMT)	rs4680
الميثيلينتيتراهيدروفوليات (MTHFR)	rs1801133
	rs1801131
عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)	rs6265
الأسرة الناقلة المذابة 6، عضو 4 (SLC6A4 أو 5HTT)	هيدروكسيتريبتامين نقل الجينات المرتبطة منطقة متعددة الأشكال (5-HTTLPR)
	rs25531

الجدول 6: تحليل SNPs للمتبرعين الدماغ InveCe.Ab.

عمليه	حل	مده
		عينات ماكرو	عينات صغيرة
تثبيت	10% شكلي مؤقت	8 أيام عند 4 درجة مئوية	8 أيام عند 4 درجة مئوية
غسل	الفوسفات العازل	2-15 يوما في درجة حرارة الغرفة	2-15 يوما في درجة حرارة الغرفة
غسل	H2O WASH	2-3 ساعة، ماء الصنبور	2-3 ساعة، ماء الصنبور
الجفاف	إيثيل الكحول 70%	24 ساعة	8 ساعات
الجفاف	الكحول الإيثيل 80%	24 ساعة	4 ساعات
الجفاف	إيثيل الكحول 90%	60 ساعة (عادة خلال عطلة نهاية الأسبوع)	4 ساعات
الجفاف	الكحول الإيثيل 95%	12 ساعة	4 ساعات
الجفاف	الكحول الإيثيل 95%	12 ساعة	4 ساعات
الجفاف	إيثيل الكحول 100%	6 ساعات	4 ساعات
الجفاف	إيثيل الكحول 100%	6 ساعات	4 ساعات
مسح	XYLENE I	12 ساعة	10 ساعات
مسح	XYLENE II	12 ساعة	10 ساعات
تسلل	بارافين 1	12 ساعة	11 ساعة
تسلل	بارافين الثاني	12 ساعة	11 ساعة
تضمين	بارافين واكس

الجدول 7: بروتوكول معالجة الأنسجة ABB.

المنطقه	H & E	كريسيل فيوليت	LFB	غالياس	4G8	AT8	α-SYN	TDP-43	نيون	GFAP
أدمغة تيم
ميدولا - دورسال موتور نيوكليوس من فاغوس	x					x	x
بونس - لكوس كوليوس	x					x	x
ميدبراين - سوبستانتيا نيغرا	x				x	x	x
المخيخ
قشرة Cerebellar ونواة دينتات	x	x	x		x
سيريبروم
الجيروسكوبي الأوسط	x	x	x		x	x	x	x
باسال جانجليا + نواة من ماينرت	x	x	x		x				x	x
Cingulate، الأمامي	x	x	x		x		x		x	x
أميغدالا	x					x	x	x	x	x
الثالم ونواة سوبثاليمي	x					x
Gyri الزمنية متفوقة ومتوسطة	x	x	x	x	x	x	x		x	x
قرن آمون وقشرة إنتورهينال	x	x	x	x	x	x	x	x	x	x
الفصوص الجدارية السفلية	x	x	x	x	x	x	x
قشرة القذالي	x		x		x	x	x
لمبة الشم	x						x

الجدول 8: تقييم المناطق، والتلوين والكيمياء الأرستقراطية المناعية.

Discussion

الخطوات الهامة في البروتوكول
هدفنا هو الحصول على، وتوصيف وتخزين أنسجة ذات نوعية جيدة قادمة من مواضيع ذات تاريخ مفصل مستمد من الملاحظة الطولية. ومن أجل بلوغ هذا الهدف، يلزم معالجة الجوانب الرئيسية التالية. وكما ورد أعلاه، يبدأ البروتوكول بتعيين المانحين، وهي الخطوة الحاسمة الأولى. ثم، فمن الضروري أن الجهات المانحة مواصلة برنامج المتابعة والحفاظ على الالتصاق إلى المشروع مع مرور الوقت حتى التبرع الفعلي للدماغ. وعند الوفاة، من الضروري أن يتم إخطار موظفي أي بي بي بسرعة من أجل عقد اجتماع لفريق التشريح في غضون 24 ساعة، مع ما إذا كان ذلك مهماً لجودة الأنسجة. قطع جديدة من نصفي الكرة الدماغية يتطلب يد ثابتة وتدريب محدد. لتجنب تلف الخلوية الناجمة عن تجميد بطيء والحصول على شرائح ذات نوعية جيدة للتبريد و Omics، من المهم أن يتم تجميدها بسرعة. النظر في سرعة اختراق حل formalin (1 مم / ساعة)، للحفاظ على antigenicity الأنسجة يتم الاحتفاظ الوقت نقع من شريحة واحدة في الحد الأدنى.

استكشاف أخطاء الأسلوب وإصلاحها
12 - ومن أجل التصدي للخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه، نقدم النهج التالي. توظيف الجهات المانحة والالتزام بالمتابعة: هناك عدة عوامل تعوق التبرع بالدماغ بما في ذلك المخاوف من الإضرار بشخصية الجسم ونقاوته ونزاهته، أو إمكانية الشعور بالألم بعد الوفاة. حتى أن البعض قلقون من أن تشريح الجثة قد يتم بينما هم لا يزالون على قيد الحياة^70,71. المخاوف من تعطيل ترتيبات الجنازة والعبء المالي هي أيضا الحاضر⁷². وعلاوة على ذلك، فإن عدم معرفة الموظفين الطبيين بإجراءات ما بعد الوفاة وعدم القدرة على معالجة شواغل المتبرعين المحتملين أو كرونة الـ 100 قد لا يشجعون على التسجيل. وقد تؤدي جميع هذه العوامل إلى انخفاض مستوى الوعي مع انخفاض عدد المشاركين المسجلين وارتفاع احتمال خسارة المانحين بمرور الوقت. وبالفعل، ينبغي أن يكون برنامج توظيف المانحين فعالا في نشر الوعي، وغرس الثقة، وإقناع الناس بالتسجيل والحفاظ على معدلات عالية من المشاركة في المتابعة. ومن واقع تجربتنا، يتم ذلك من خلال الاختيار الدقيق للمانحين المحتملين وشرحاً شاملاً لمقاصد BB. نحن نقدم أنشطة تعليمية ونهج التعاطفي لمعالجة مخاوف واحتياجات كل من الأشخاص الأصحاء والمتضررين من الأمراض العصبية وأسرهم. نجد أن المانحين المحتملين هم أكثر عرضة لإعطاء موافقتهم عند الاتصال بهم شخصيا. إن النهج المباشر يخلق علاقة قائمة على الثقة والاحترام المتبادلين وهو أمر أساسي لتحقيق نسبة عالية من التسجيل للتبرع الدماغي وتقييمات المتابعة. فريق عمل مدرب على درجة عالية من الحس الأخلاقي يقترب أولا من المتبرع المحتمل، ويناقش إمكانية التبرع بالدماغ بعد الوفاة، ويشرح قيمة أنسجة الدماغ البشري للبحوث العصبية العلمية، ويوضح أي شك فيما يتعلق بإجراءات ما بعد الوفاة. كلمة مواتية من الفم هو على نفس القدر من الأهمية. بعد حصاد الدماغ، يتم إيلاء الاهتمام المناسب والرعاية لإعادة تركيب الجثث. من المهم إظهار الاحترام والامتنان للشخص المتوفى من خلال علاج الجذافير بلطف. وبعد بضعة أشهر، من المقرر عقد اجتماع لإبلاغ نتائج التحليل العصبي عند الطلب من قبل أفراد الأسرة.

وقت الوفاة وحصاد الدماغ: عندما يقبل الشخص، يصبحون متبرعين ويُمنحون بطاقة هوية مع رقم للاتصال بـ 24 ساعة في اليوم، 7 أيام/أسبوع (رقم الاستقبال لمستشفى آسيا والمحيط الهادئ غولجي- ريدالي للشيخوخة الذي يرتبط بنا). وعلاوة على ذلك ، يتم إعطاء علامة لاصقة للأقارب لاستخدامها في حالة دخول المستشفى. وقد أُبلغت وكالات الجنازة في المنطقة في وقت سابق بإحضار الجثة إلى مرافق مصرف البحرين المركزي، حيث تم استدعاء فريق التشريح. يتكون فريق التشريح من أخصائي علم الأمراض، طبيب أعصاب و/أو أخصائي الأعصاب، وفني غرفة تشريحية، وهي قيد الاستدعاء من الساعة 6 صباحًا حتى الساعة 11 مساءً كل يوم. كما أن بعض الطلاب المتدربين موجودون بشكل متكرر للمساعدة في التقاط الصور.

يتم ضمان دقة واتساق إجراءات القطع الجديدة من خلال مشاركة نفس المشغلين (طبيب أعصاب وأخصائي أمراض) الذين طوروا الطريقة ولديهم عدة سنوات من الخبرة في علم الأمراض العصبية. عند تجميد الشرائح، يتم وضعها على صينية الألومنيوم prefrozen ومغطاة مع لوحة الألومنيوم المتشابكة للحفاظ عليها مسطحة بشكل جيد. بعد ذلك مباشرة، يتم وضعها في النيتروجين السائل لمدة 3 دقائق، قبل تخزينها في -80 درجة مئوية. يتم تغليف الشرائح التي سيتم إصلاحها بشكل فردي في الشاش ، وغارقة في محلول الفوريني المخزن بالفوسفات بنسبة 10٪، والذي يتم استبداله بعد يوم واحد. وبعد ذلك، يتم الاحتفاظ بها في شكليات في ما لا يزيد عن 5 أيام إضافية. ومع ذلك، بالنظر إلى أن حل formalin يخترق في 1 مم/يوم، نود أن تقصير مزيد من الوقت النقع.

قيود الطريقة
ولا تغطي طريقة البحث الموصوفة هنا سوى منطقة جغرافية محدودة، والأفراد المشاركين في برنامج التبرع لديهم خصائص لا تمثل بشكل كامل عامة السكان. على الرغم من أن أكثر من مقبول, فاصل ما بعد الوفاة تصل إلى 24 ساعة قد تنتج تغييرات في بعض هياكل البروتين, الإنزيمات والرنا من أنسجة الدماغ. قد لا يكون تحديد AFS وhh كافيًا تمامًا لتحديد جودة الأنسجة⁷³ ، ونحن نعمل على تطوير طرق أخرى لتوثيق جودة الأنسجة استنادًا إلى سلامة الحمض النووي الريبي.

وفيما يتعلق بإجراء قطع الجزيئات الدقيقة، على الرغم من أنه مفيد جدا لإعادة بناء العلاقات التشريحية، تجدر الإشارة إلى أن استخدام التشظيات الصغيرة ليس بسيطاً، وهو يمثل بعض الصعوبات التقنية. طريقتنا صعبة وتستغرق وقتا طويلا. فالتكاليف مرتفعة جداً والتمويل ليس سهلاً دائماً. ويأتي التمويل في المقام الأول من القطاع العام (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) والموارد الخاصة (مؤسسة غولجي - سينسي)، والتبرعات الخاصة، والمنظمات غير الربحية (مثل "Federazione Alzheimer Italia") ومنح المشاركة.

أهمية طريقة ABB فيما يتعلق بالأساليب القائمة/البديلة
في البداية، استهدف برنامج التبرع الدماغي الأفراد المشاركين في الدراسة الطولية InveCe.Ab. ونتيجة لذلك، فإن الأدمغة المتبرع بها مصحوبة بمعلومات سريرية وبيولوجية واجتماعية مفصلة تم جمعها على مر السنين. تستمد قوة ABB على وجه التحديد من هذا الأصل المميز. والواقع أن دراسة مجموعة من الأشخاص ذوي الصلة اجتماعياً وجينياً الذين يشتركون في الخصائص البيولوجية والتعرض البيئي تعزز التحليل الإحصائي. وعلاوة على ذلك، تشمل الدراسة الفوائد التالية: 1) العناية باحتياجات المجتمع المحلي وتوفيرها (فعل "العطاء قبل السؤال"): يتلقى الناس فحصا دوريا مجانيا يتم إبلاغ الممارس العام به، ويقدم رقم هاتف سكرتيرنا للاستشارات، ويزور الأشخاص ذوي الإعاقة الشديدة في المنزل؛ (2) توفير خدمات الاستشارة في مجال الاستشارات. 2) إشراك المشاركين، والأشخاص الذين لهم أدوار عامة، والممارسون العامون في الأنشطة التعليمية من خلال تنظيم حلقات دراسية دورية (تتعلق بصحة الدماغ، والتبرع بالدماغ والصحة العامة)، وتخطيط دورات مواضيعية (مثل استخدام أجهزة تكنولوجيا المعلومات للمسنين)؛ 3) لقاء الناس واعتماد نهج وجها لوجه. وتشكل جميع هذه العناصر قوة مشروع ABB. وعلاوة على ذلك، يحسن المشروع القدرات السريرية للعاملين الطبيين المشاركين، حيث يكتسبون الخبرة في كل من تقييمات ما قبل الوفاة وتقييمات الأمراض العصبية بعد الوفاة. وفي هذا الصدد، نود أن نذكر التجربة الخاصة جداً "للدراسة البحثية المتعلقة بشيخوخة الأقليات". وشملت هذه الدراسة عددا محدودا ومنتقى من الأميركيين الأفارقة المقيمين في منطقة شيكاغو (784 من أصل 1357 موضوعا مؤهلا: معدل استجابة قدره 57 في المائة). وقد تمت زيارة المشاركين سنويا فى منازلهم وطلب منهم الانضمام الى برنامج التبرع بال المخ . وتستند هذه الدراسة على نهج غير عادي مع بعض أوجه التشابه مع لنا الحصول على نسب عالية من الاستجابة الإيجابية لبرنامج التبرع بالدماغ (352 من أصل 784 مشاركا كانوا مسجلين: 44٪)، على الرغم من أن معدل تشريح الجثة لم يكن مرضيا تماما (53٪)⁷⁴. تماما كما هو الحال في "دراسة أبحاث الشيخوخة الأقلية"، ونحن نقدم أنشطة تعليمية ونهج التعاطف، وتحقيق نتائج ممتازة. وعلى وجه الخصوص، فإن معدل استجابتنا هو 93%، ونسبة التسجيل هي 28.7%، ومعدل التشريح في الوقت الحالي هو 67%. وتبين هذه المعدلات أن المشاريع التي تشرك الناس بشكل مباشر لديها نسبة مئوية أكبر من التبرعات. برامج التبرع بالدماغ الأخرى ، مع اهتمام أقل في بناء علاقة مع المتبرعين المحتملين ، لديها عادة نسبة تسجيل منخفضة ، حيث تبلغ حوالي 10-15٪ أو أقل^73،75.

هناك عدد قليل من الدراسات الفوج السابقة التي تنتهي بتحليل الأمراض العصبية. وعلاوة على ذلك، فإن غالبية بنوك الدماغ ومستودعاته تتركز على الأمراض، وهناك ندرة في أدمغة "السيطرة" من متبرعين أصحاء مقارنة بعدد الأدمغة "المريضة". ويستند عدد محدود فقط من BBs على الدراسات السكانية التي تنطوي على كل من المواد المرضية والطبيعية من أجل دراسة مسارات الشيخوخة^{73،74،76،77،78،79،80}. بعض الدراسات مثل "دراسة أبحاث الشيخوخة الأقلية" في الولايات المتحدة^{الأمريكية 74} و "دراسة Vantaa 85+ " في فنلندا⁷⁶ مشابهة لدراستنا ولكنها تميل إلى نفاد مع إنهاء الفوج. بدلا من ذلك، من المتصور أن يستمر برنامج التبرع في ABB لفترة طويلة في المستقبل، وتجنيد المتبرعين المحتملين وجدولة المتابعات حتى بعد انتهاء الدراسة الطولية InveCe.Ab. هذا النهج يجعل أسلوب التوظيف لدينا مشابهاً لأسلوب "معهد أبحاث الشمس الصحية (SHRI) برنامج التبرع بالدماغ" الذي يهدف إلى مجتمع التقاعد⁷³. بروتوكول SHRI للتبرع الدماغي فعال جدا مع أقصر متوسط الفترة بعد الوفاة في العالم (3.92 ساعة). على غرار أكبر BBs في العالم ، فإن بروتوكول SHRI ببساطة قطع المخ المخيخ والمخيخ و الدماغ في خط الوسط (طائرة القوس) ، ثم يتم تشريح نصف جديد ومجمد للدراسات الكيميائية الحيوية ، في حين يتم إصلاح الآخر في الشكلين للتقييم الهستواثي. ومع ذلك، فإن أحد نقاط القوة في بروتوكول تشريح مبادرة المؤسسات الخاصة في مجال حقوق الإنسان هو تثبيت الشرائح الفردية بدلاً من نصف الكرة الأرضية بأكمله. في الواقع، تثبيت نصف الكرة الأرضية ككل ليس الأمثل، بسبب التدرجات التثبيت مختلفة بين السطح واللب. وعلاوة على ذلك، قد تتأثر البروتينات القشرية من التعرض لفترات طويلة لمحلول formalin. وهكذا، فإن السبب الذي قررناه لإصلاح شرائح فردية.

قرار أي جانب هو ثابت أو مجمد، يعتمد على بنك المفرد (دائما نفس، تعيين عشوائي أو تعيين اعتمادا على ما إذا كان يوم تشريح هو غريب أو حتى)^{31،32،33،34،35}. لذلك، يتم إجراء التحليل الكيميائي الحيوي والهوسولوجي بشكل منفصل في كل نصف الكرة الأرضية. كما العديد من الأمراض العصبية غير متناظرة, لدينا BB يقدم بروتوكول فريد من نوعه لشرائح العينات الطازجة: يتم الاحتفاظ أقسام بديلة من جذع الدماغ ومن كل نصف الكرة الأرضية من المخيخ و المخيخ والمواد الثابتة أو المجمدة; شريحة ثابتة على نصف الكرة الأرضية واحد يقابل واحد المجمدة على نصف الكرة الآخر. طريقة لدينا يعطي الفرصة للحصول على توصيف كامل النسيجية لجميع المواد المجمدة ومقارنة النتائج من جميع المناطق من كلا الجانبين. كما قال في المقدمة، الطريقة الموصوفة تسمح لنا بالحصول على أكبر قدر ممكن من المعلومات من أنسجة الدماغ. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة ABB تسفر عن توصيف أساسي ولكن كامل للأمراض العصبية، بما في ذلك تقريبا جميع أمراض البروتينات المعروفة في الدماغ وأمراض الأوعية الدموية. نظرا للدور المثير للجدل من إصابات الأوعية الدموية في تحديد ضعف الإدراك، قررنا استخدام تسجيل مزدوج لعبء الأوعية الدموية^30،53.

وكما هو موضح في البروتوكول، فإننا نستخدم نهجا متعدد التخصصات. على الرغم من أن هذه طريقة تستغرق وقتا طويلا وشاقة، ونحن نعتقد أنه يوفر العديد من المزايا للبحوث. على سبيل المثال ، في عمل سابق ، أظهرنا أن tHcy عالية في حد ذاتها ، أو MTHFR C677T TT المرتبطة بأليل APOE-ε4 ، قد تكون ذات صلة باختلالات وظيفية تنفيذية بدلاً من فقدان الذاكرة⁸¹. لذلك، قد يكون من المثير للاهتمام لتقييم الموضوعات مع هذا الملف الوراثي خاصة على المستوى العصبي. وهذا مثال على مدى فائدة هذه المتابعة المتعمقة في إيجاد فرضيات بحثية جديدة يمكن التحقق منها من خلال التحقيق في المواد البيولوجية التي يتم جمعها في مصرفنا. ومن البرهان الآخر على ميزة نهجنا إدراج فريق قطر المعني بEG ضمن التقييمات التي نقوم بها بشكل روتيني، لإصالته وسهولة استخدامه النسبية. في الواقع، يكشف تخطيط الدماغ النشاط متشابك من قشرة الدماغ عن طريق تسجيل الإمكانيات الكهربائية من dendrites التي تنتمي إلى الخلايا العصبية الهرمية القشرية⁸². يمكن اعتبار QEEG علامة حيوية لتقدير النشاط المشبك القشري الذي يرتبط بالإدراك⁸³. على وجه الخصوص، كان الانخفاض في إيقاعات ألفا في الجزء الخلفي من الدماغ مع زيادة عامة من الترددات المنخفضة (ثيتا وإيقاعات دلتا) مرتبطة بتعطل الاتصال القشري. وينبغي أن تعتبر أن معظم الدراسات الارتباط التشخيصي قد استندت إلى التشخيص السريري الذي هو فقط من المحتمل وليس تشخيص مؤكد^84,85,86,87. فقط عدد قليل جدا من الدراسات المستهدفة قد قارنت بيانات QEEG مع الصورة العصبية للتحقيق في العلاقة بين QEEG وLTS المتغيرات^88,89, والتمييز بين FTLD وD⁸³. من خلال إنهاء دراستنا مع تعريف التشخيص العصبي ، ومن الممكن بعد ذلك لتفسير الملاحظات التي أجريت بشكل صحيح على النشاط الكهربائي الدماغي. وعلاوة على ذلك، أداء QEEG المسلسل في كل موضوع يمكننا تتبع مسار موجات EEG داخل الفردية وارتباطها مع الصورة العصبية. يمكن أن يؤدي اتباع التعديلات الفردية للنشاط الكهربائي القشري بمرور الوقت إلى فهم أفضل لمعانيه كعلامة حيوية للخرف المُبدا.

التطبيقات المستقبلية واتجاه الأسلوب
تنفيذ توزيع الأنسجة هو واحد من الأهداف الرئيسية المتوقعة. من أجل القيام بذلك، أنشأنا للتو لجنة علمية بما في ذلك مدير مؤسسة GC (طب الشيخوخة)، وهو أكاديمي من علم الأعصاب من جامعة بافيا، وطبيب أعصاب وأخصائي أمراض على حد سواء من مؤسسة GC ومستشفى الشيخوخة ASP Golgi-Redaelli. عند توزيع أنسجة المخ والشرائح النسيجية والعينات البيولوجية الأخرى، من المهم أن نتذكر أن المتبرعين وافقوا على التبرع من أجل البحث. ولذلك ينبغي أن يتم توزيع المواد بحكمة، تماما كما هو موضح في مدونة قواعد السلوك⁴⁰لـ BNE . وينبغي لأي طرف يقدم طلباً للحصول على المواد أن يبين نوع العينة المطلوبة وكمية تلك العينات، وأن يقدم وصفاً لمشروع البحث، وكيف ستستخدم العينات، وأن يقدم، كلما أمكن، أدلة على المنشورات السابقة (للاطلاع على اتفاق النقل، انظر الشكل 9). بنك الدماغ لا يعمل لتحقيق مكاسب مالية. لذا، فإن الرسوم التي يدفعها الباحثون يجب أن تغطي فقط نفقات شراء الأنسجة ومعالجتها وتخزينها وتوزيعها.

خطط لبدء تحليل الحالات مع تسلسل exome وتقنيات Omics، مثل البروتيوميكس وعلم النسخ، هي في الحركة. وسوف تسمح منهجية أخذ العينات البديلة لدينا بإجراء دراسات أوميتش على أنسجة محددة جيداً من الناحية النسيجية من كلا نصفي الكرة الأرضية. ومن خلال هذا النهج، سيكون من الممكن مقارنة نمط تنشيط الجينات في مناطق مختلفة من الدماغ في نفس نصف الكرة الأرضية وفي المناطق المقابلة من نصف الكرة الغربي الآخر، وتكون قادرة على ربط تنشيط الجينات بعلم الأنسجة. وفي هذا المجال، ستكون تطبيقات التعلم العميق ذات أهمية كبيرة، بما في ذلك التحليل المحوسب للشرائح النسيجية والارتباط المتطور للبيانات السريرية والثنائية والبيانات العُمائية. ويمكن تحديد الارتباطات الأخرى بين العديد من المتغيرات المختلفة، فضلا عن التطبيقات التكنولوجية الأخرى الممكنة. وسيتيح توافر المواد المجمدة من نصفي الكرة الأرضية إمكانية وجود تضاريس دقيقة لتنشيط الجينات وتوزيع البروتين. وهذا سيكون من الأهمية الخاصة حتى في المواضيع الصحية، معتبرا أن كلا من وظائف الدماغ وبعض الأمراض غير متناظرة.

وعلاوة على ذلك، يمكننا الحصول على الثقافات الخلية من المتبرعين الدماغ تتميز بشكل جيد. في الواقع، الثقافات الخلية من leptomeninges من الأدمغة المقطوعة توريد الخلايا الحية التي يمكن استخدامها لمزيد من التحقيق في آليات المرض أو الشيخوخة، عن طريق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) التكنولوجيا التي تنطوي على إعادة برمجة الخلايا الليفية leptomeningeal والتمييز بينها في الخلايا العصبية في النماذج المتقدمة⁹⁰.

مع تقدم الأدمغة في العمر، يمكن أن تحدث ملامح مختلفة من التغيير على المستوى الجزيئي والخلوي والأنسجة. كل دماغ فريد من نوعه. كل لديه طريقته الخاصة في الاستجابة للضغوط الداخلية والخارجية. يقاوم البعض بينما يستسلم البعض الآخر ويعرض أمراضًا متميزة. التناقضات بين العرض السريري والصورة العصبية غالبا ما تكون موجودة لأن تضاريس الآفات، بدلا من طبيعتها الجزيئية، يحدد العرض السريري. لا يمكن تحقيق التشخيص الصحيح والمُحَدَد إلا من خلال الجمع بين المتلازمة السريرية والنتائج العصبية التي غالباً ما تضيف أدلة مسببة مهمة ضرورية لكشف التسبب في الأمراض. في أوروبا، هناك محاولة لخلق نهج قياسي لتشخيص الأمراض العصبية. يتبع بروتوكولنا التشخيصي بشكل كامل تقريبًا الإرشادات المنشورة مؤخرًا حول التشخيص العصبي للدماغ^{المصرفي 91}. وهذا سيسمح لنا بجمع ومشاركة أنسجة الدماغ الموثقة جيدا، مع الهدف المحتمل المتمثل في إنشاء أول بنك الدماغ الإيطالي. في الواقع، في إيطاليا هناك مستودعات الدماغ ولكن ليس بنوك الدماغ على أساس الدراسات الأترابية. هدفنا هو تطوير طريقة لحصاد أنسجة الدماغ التي يمكن تنفيذها على نطاق واسع في جميع أنحاء إيطاليا، لإنشاء شبكة تستخدم بروتوكول مشترك وتشارك المواد المماثلة. ومن أجل القيام بذلك، فإن مشاركة مراكز البحوث الأخرى وإنشاء موقع شبكي محدد هما من بين الأهداف الرئيسية للمستقبل.

وتستخدم التكنولوجيات المبتكرة باستمرار لتحليل الطبيعة الجزيئية للأمراض العصبية و لتحديد العلامات البيولوجية. وفي هذا السياق، ستكون هناك حاجة متزايدة للأدمغة مصحوبة بمعلومات عن المسارات المعرفية والشيخوخة التي تم الحصول عليها من خلال الدراسات الطولية، مع التأكيد على أهمية النهج الوبائي الذي تم التحقق منه من الناحية العصبية⁹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Electrical saw with 5d blade	CEA	06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm	CEA	70064.250 HHH
Electrode pH needle	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Bovine Serum	Carlo Erba	FA30WS1810500	medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical	Uvex	500XG
Gloves	CEA	01.28.14
Glue	Arcobaleno	2624000800002
Head supporter	Lacor	60456
L-Glutamine (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape	CEABIS	CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide	UHU Bostik	8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140050	medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Surgical mallet and surgical cisel	CEA	79.68.88
Surgical scissor	CEA	27.08.45/79.68.64
	Feather	M130RC