Abbiategrasso Brain Bank Protocol zum Sammeln, Verarbeiten und Charakterisieren alternder Gehirne

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um einzelne Gehirn-Aging-Trajektorien durch ein Gehirn-Spenden-Programm und die richtige Charakterisierung des Gehirns zu verfolgen. Hirnspender sind an einer langfristigen Längs-Langzeitstudie beteiligt, einschließlich serieller multidimensionaler Bewertungen. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Gehirnverarbeitung und eine genaue Diagnosemethodik.

Zusammenfassung

In einer ständig alternden Bevölkerung wird mit einem Anstieg der Prävalenz neurodegenerativer Erkrankungen gerechnet. Das Verständnis von Krankheitsmechanismen ist der Schlüssel, um präventive und heilende Maßnahmen zu finden. Der effektivste Weg, dies zu erreichen, ist durch direkte Untersuchung von krankem und gesundem Hirngewebe. Die Autoren präsentieren ein Protokoll, um qualitativ hochwertiges Gehirngewebe zu erhalten, zu verarbeiten, zu charakterisieren und zu speichern, das von Personen gespendet wird, die in einem Antemortem-Gehirnspendeprogramm registriert sind. Das Spendenprogramm umfasst einen persönlichen, empathischen Umgang mit Menschen, eine Sammlung ergänzender klinischer, biologischer, sozialer und Lifestyle-Informationen und serielle multidimensionale Bewertungen im Laufe der Zeit, um individuelle Bahnen des normalen Alterns und kognitiven Verfalls zu verfolgen. Da viele neurologische Erkrankungen asymmetrisch sind, bietet unsere Gehirnbank ein einzigartiges Protokoll zum Schneiden frischer Proben. Hirnabschnitte beider Hemisphären sind abwechselnd eingefroren (bei -80 °C) oder in Formalin fixiert; eine feste Scheibe auf einer Hemisphäre entspricht einer gefrorenen auf der anderen Hemisphäre. Mit diesem Ansatz kann eine vollständige histologische Charakterisierung des gesamten gefrorenen Materials erreicht und Omics-Studien an histologisch gut definierten Geweben aus beiden Hemisphären durchgeführt werden, was eine vollständigere Bewertung neurodegenerativer Krankheitsmechanismen ermöglicht. Eine korrekte und eindeutige Diagnose dieser Krankheiten kann nur durch die Kombination des klinischen Syndroms mit der neuropatologisch-evaluation erreicht werden, die oft wichtige ätiologische Hinweise hinzufügt, die notwendig sind, um die Pathogenese zu interpretieren. Diese Methode kann zeitaufwändig, teuer und begrenzt sein, da sie nur ein begrenztes geografisches Gebiet abdeckt. Ungeachtet seiner Grenzen kann sich der hohe Charakterisierungsgrad lohnen. Unser oberstes Ziel ist es, die erste italienische Brain Bank zu gründen, wobei die Bedeutung neuropathologisch verifizierter epidemiologischer Studien betont wird.

Einleitung

Nach Angaben der WHO leiden derzeit etwa 50 Millionen Menschen an Demenz, eine Zahl, die sich bis 2050 voraussichtlich verdreifachen wird. Die Alzheimer-Krankheit ist die Hauptursache für Demenz, gefolgt von zerebrovaskulären Erkrankungen und anderen altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen. Im Jahr 2017 entwickelte die WHO das Global Dementia Observatory, um das Bewusstsein für Demenz zu schärfen und einen globalen Aktionsplan gegen demenz zu fördern¹. Jeder Mensch hat seine eigene Gehirnalterungsbahn, daher kann die Suche nach der Heilung aufgrund der Komplexität der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen schwierig sein. Vielleicht besitzt jede Person ihre eigene Pathogenese, die im Gehirngewebe geschrieben ist und einen personalisierten Ansatz erfordert. So wird die Untersuchung von Hirngewebe der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen der Neurodegeneration sein.

Wenn wir auf die Geschichte der Neurowissenschaften zurückblicken, erkennen wir, dass die beeindruckendsten und bahnbrechenden Entdeckungen ohne die direkte Untersuchung des menschlichen Gehirns niemals hätten passieren können. Im Laufe der Zeit hat sich die Quelle des zu untersuchenden Hirngewebes von groben Sezierungen, zufälligen "Chance-Begegnungen" und in einigen Fällen illegalem Handel zu organisierten Gehirnsammlungen und strategischen modernen Gehirnbanken gewandelt. Die Berücksichtigung vieler ethischer Aspekte ist einer der Hauptfaktoren, die moderne Gehirnbanken von den Hirnsammlungen der Vergangenheit unterscheiden. Die ersten echten modernen Brain Banks (BBs) wurden in der zweiten Hälfte des^20. Jahrhunderts eingeführt. Nicholas Corsellis und Wallace Tourtelotte können als Pioniere des modernen Brain Banking sanieren. Im Vereinigten Königreich hat Corsellis eine Sammlung mit über 1000 gut dokumentierten Gehirnen zusammengestellt, die mit verschiedenen psychischen und neurologischen Erkrankungen betroffen sind². Darüber hinaus half Corsellis, die Notwendigkeit zu offenbaren, frisches Gehirngewebe im Eis für biochemische Tests zu erhalten³. In den USA führte Wallace Tourtelotte unterdessen antemortem Gehirnspendenprogramme ein, um die Anwerbung potenzieller Hirnspender zu erleichtern und sicherzustellen, dass die gesammelten Gehirne von einer vollständigen medizinischen und neurologischen Geschichte begleitet werden^4,5. Einen historischen Überblick über Hirnsammlungen und moderne BBs finden Sie unter Carlos et al. ⁶.

Warum brauchen wir also noch menschliche Gehirne? Hirnerkrankungen können erst nach neuropathologischer Untersuchung eine definitive Diagnose gestellt werden. Die Neuropathologie stellt die klinische Diagnose in Frage und ist der Schlüssel zu einer korrekten Interpretation der klinischen Symptome und zur Entdeckung der histologischen Grundlagen neuer syndromischer Varianten. Tatsächlich kann die Diagnose anhand des pathologischen Bildes neu definiert werden. Dennoch ist die Autopsierate in den letzten Jahrzehnten aufgrund der jüngsten Entwicklung innovativer Neuroimaging-Techniken zurückgegangen. Durch die Bildgebung des Gehirns können die morphologischen, funktionellen und metabolischen Veränderungen im Gehirn sowie das Ausmaß der Proteinfehlfaltung in vivobewertet werden. In vivo-Neuroimaging und andere Biomarker-Studien können jedoch nur eine "Schätzung" des pathologischen Bildes ergeben, da sie nicht in der Lage sind, subtile zelluläre und molekulare Veränderungen zu erkennen. Fortschritte in der molekularen Bildgebung und die Entdeckung neuer Biomarker, Zielmoleküle und Tracer⁷ (z. B. Amyloid, TAU, mikrogliale Tracer) machen das menschliche Gehirn für die Interpretation von Daten aus klinischen Auswertungen und Biomarkertests noch unverzichtbarer. Darüber hinaus sind die Omics-Technologien (Genomik, Epigenomik, Transkriptomik, Metabolomik, Proteomik, Lipidomik, etc.), durchgeführt auf frischem und gefrorenem Hirngewebe, eröffnete neue Möglichkeiten zum Verständnis von Krankheitsmechanismen und zur Entdeckung von Risikogenen, neuartigen diagnostischen und^17,prognostischen Markern und potenziellen Wirkstoffzielen^{8,9,10,11,12,15,15,,17},^{,18,1919,20,21,22,23}.

Zu diesem Zweck archivieren moderne BBs gut charakterisierte, hochwertige Hirngewebe, die sie der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung stellen^3,24. Die von BBs gelieferten Gehirne sollten von einer vollständigen klinischen Vorgeschichte begleitet werden. Die Tätigkeit eines BB umfasst Folgendes: (1) Anerkennung und Rekrutierung von erkrankten und gesunden Personen für Gehirnspendenprogramme; die ideale Voraussetzung wäre, eine multidisziplinäre Nachbeobachtung der Spender im Laufe des Lebens zu erreichen, um eine vollständige klinische, Lebensstil- und Sozialgeschichte sowie Biomarkerprofile zu erhalten; in der Tat hängen kognitive Reserve und Gehirnstruktur von Lebensstil und sozio-pädagogischen Faktoren^25,26ab, so dass diese Informationen die gesamtdaten bereichern. (2) Erwerb des Gehirns (bestehend aus Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm) und verwandten Geweben (z. B. Rückenmark, Hirnnerven und Ganglien usw.) nach dem Tod des Spenders, wobei standardisierte rechtliche und ethische Vorschriften beachtet werden. (3) Angemessene Verarbeitung (Zerlegung, Fixierung, Einfrieren) des Gehirns im Sinne eines standardisierten operativen Protokolls, um hochwertiges Gewebe zu erhalten und eine zukünftige Verwendung in der multidisziplinären Forschung zu ermöglichen. (4) Detaillierte neuropathologische Charakterisierung mit einer endgültigen definitiven Diagnose. (5) Lagerung und Verteilung von Gewebematerial an die Forschungsgemeinschaft^27,28.

Alle BBs speichern sowohl gefrorene als auch formalinfixierte Paraffingewebe. Jede BB hat ihr eigenes Protokoll. Mit Ausnahme bestimmter Studien, wie dem bihemisphärischen Schnittprotokoll des Biomedical Research Institute (New Jersey)²⁹ und der Deramecourt-Studie zur zerebrovaskulären Pathologie³⁰, schneiden die größten BBs der Welt einfach das Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm entlang der Mittellinie (sagittale Ebene). Die eine Hälfte wird frisch seziert und dann für biochemische Studien eingefroren, während die andere für die histopathologische Bewertung formalin fixiert ist. So werden biochemische und histopathologische Analysen getrennt auf jeder Hemisphäre durchgeführt. Die Entscheidung, welche Seite fixiert oder eingefroren ist (Lateralität), hängt von der Singularbank^{31,32,33,34,35}ab. Da viele neurologische Erkrankungen asymmetrisch sind, bietet unser BB ein einzigartiges Protokoll zum Schneiden frischer Gehirne: benachbarte Abschnitte des Hirnstamms und jeder Hemisphäre sind abwechselnd fixiert und eingefroren; eine feste Scheibe auf einer Hemisphäre entspricht einer gefrorenen auf der anderen Hemisphäre. Durch diese Methode wird die Verwendung von Hirngewebe optimiert, und eine vollständige histologische Charakterisierung des gesamten gefrorenen Materials kann mit der Möglichkeit erreicht werden, histologische und biochemische Informationen aus allen Bereichen beider Hemisphären zu erhalten und zu vergleichen.

Der Rahmen unseres Brain Bank Projekts ist die Stadt Abbiategrasso. Abbiategrasso ist eine kleine Stadt etwa 22 km südwestlich der Stadt Mailand in Norditalien. Es hat eine Bevölkerung von etwa 32.600 Menschen. Hier befindet sich die Golgi-Cenci (GC) Stiftung. Die GC Foundation ist Teil eines großen Rehabilitation Geriatric Hospital (ASP Golgi-Redaelli) und ist ein Institut, das sich auf die Erforschung des Alterns und der Altenpflege konzentriert. Insbesondere konzentriert es sich auf die Untersuchung des mentalen Alterns, der sozialen und Verhaltensfaktoren, die es beeinflussen, und der Biologie und Pathologie, die altersabhängigen neurokognitiven Störungen (NCDs) zugrunde liegt. Im Jahr 2009 startete die GC Foundation eine neue Längsgenerationsstudie mit 1321 Teilnehmern (von 1644 förderfähigen Probanden: Erstansprechrate von 80,3%). geboren zwischen 1935 und 1939 (im Alter zwischen 70 und 75 Jahren), kaukasischer Ethnie, die in demselben kleinen geographischen Gebiet lebt. Die Studie hieß InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; auf Deutsch: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) und ist derzeit im Gange. InveCe.Ab ist geplant, eine Kohorte mit maximaler Homogenität und geringster Variabilität zu erhalten, um die Inzidenz, Prävalenz und natürliche Geschichte von Demenz zu bewerten, zusammen mit ihren möglichen Risiko- oder Schutzfaktoren, einschließlich Verhaltens-, psychosozialen, klinischen und biologischen Variablen³⁶. Die Merkmale der Kohorte sind in Abbildung 1 und Tabelle 1dargestellt. Die epidemiologischen Daten stimmen mit dem Demenztrend in der europäischen Bevölkerung^37,38 und InveCe.Ab Teilnehmer haben homogene genetische und ökologische Eigenschaften, die ein gutes Modell darstellen, um den Verlauf von normalen Alterung zu neurokognitiven Störungen zu studieren. Tatsächlich benötigen homogene Populationen weniger Probanden, um eine angemessene statistische Leistung zu erreichen. Die InveCe.Ab-Methodik wurde bereits an anderer Stelle berichtet^36, aber es ist wichtig, ihren mehrdimensionalen Ansatz durch regelmäßige Kontrollen (alle 2–3 Jahre) unter Verwendung der gleichen Bewertung zu unterstreichen, einschließlich: Blutentnahme (metabolisches Panel, Homocystein und Vitamine, DNA-Extraktion zum Profil Apolipoprotein E (APOE) und andere genetische Polymorphismen im Zusammenhang mit Kognition und Alterung), anthropometrische Messungen (Gewicht, Höhe und Taille), Talking While Walking Test (Dual Task Test), ein Interview zur Bewertung des Lebensstils (mediterrane Diät-Adhärenz, Niveau der körperlichen Aktivität und kognitiven Engagements) und soziale Faktoren (soziales Engagement, Einsamkeit), eine neuropsychologische Bewertung und eine klinische allgemeine Untersuchung. Ein Vergleich solcher Längsdaten mit postmortalen neuropathologischen Daten wäre für die Forschung von entscheidender Bedeutung. Daher hat unser Team und insbesondere Dr. Michela Mangieri den oben genannten neuropathologischen Ansatz konzipiert. Seit 2014 und während der zweiten Nachbereitung wurden die Teilnehmer von InveCe.Ab gebeten, ihr Gehirn zu spenden und damit die Geburt der Abbiategrasso Brain Bank (ABB) herbeizuführen. Die Kernspender von ABB sind die InveCe.Ab-Teilnehmer, aber ABB ist jetzt offen für andere ehrenamtliche Spender. Es handelt sich um Patienten von ASP Golgi-Redaelli, wo mehrere Patienten mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen leiden, oder erwachsene Freiwillige, die über das ABB-Projekt erfahren und zum selben geografischen Gebiet gehören (Abbiategrasso und Umgebung). Alle Spender durchlaufen das gleiche Bewertungsprotokoll.

Die Autoren schlagen eine Methode vor, um einzelne Bahnen des normalen Alterns und den möglichen Fortschritt zu nichtübertragbaren Stellen zu verfolgen und gehirn, das von solchen Spendern erworben wurde, genau zu verwalten, zu verarbeiten und zu charakterisieren, gefolgt von Längs). Darüber hinaus ist es unser Ziel, Menschen in regelmäßigen neurologischen Bewertungen, Seminaren und pädagogischen Aktivitäten zum Wohlbefinden des Gehirns zu treffen und zu engagieren und ihr Bewusstsein für Hirnspenden für Forschungszwecke zu schärfen.

Protokoll

Im Einklang mit der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution und dem BNE-Verhaltenskodex führt die ABB ihre Aktivitäten nach ethischen Standards^{aus 39,40}. Das Gehirnernteverfahren wurde der Ethikkommission der Universität Pavia im Rahmen der InveCe.Ab-Studie³⁶vorgelegt und von ihr genehmigt. Die Studienverfahren entsprachen den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki von 1964 und den folgenden Änderungen. Das Einwilligungsformular ist vollständig und leicht verständlich. Die Teilnahme am Spendenprogramm ist eine persönliche Entscheidung, und es ist ein umfassendes Bewusstsein erforderlich. Wird eine Person nicht für befugt erachtet, das Einwilligungsformular zu unterzeichnen, ist die Zustimmung des Erziehungsberechtigten oder der Angehörigen (NOK) gerechtfertigt. Tabelle 2 berichtet über Inklusions- und Ausschlusskriterien für Hirnspenden. Die Forschung wurde unter der Aufsicht der Federazione Alzheimer Italia durchgeführt.

1. Rekrutierung für das Gehirnspendeprogramm

1. Treffen Sie die Probanden, die Interesse an der Gehirnspende bekundet hatten, und ihren NOK und/oder Erziehungsberechtigten, um das Projekt (den Umfang des Spendenprogramms; den Prozess der Gehirnentfernung, Konservierung, Nutzung und Verteilung), das Recht, sich jederzeit aus dem Programm zurückzuziehen, den Schutz der Anonymität und die Folgestrategien vorzustellen. Besprechen Sie die Möglichkeit zusätzlicher Biomarker-Untersuchungen und Gentests. Beachten Sie die Wünsche des potenziellen Spenders oder seines NOK, über die Ergebnisse informiert zu werden.
2. Erklären Sie alle wirtschaftlichen Aspekte, einschließlich des fehlenden finanziellen Gewinns sowohl für die Stiftung als auch für den Spender (Gehirne werden altruistisch gespendet und verteilt). Informieren Sie sie, dass ABB die Kosten für den Transport des Körpers übernimmt, während die Familie die Kosten der Beerdigung, Beerdigung oder Einäscherung übernimmt.
3. Im Falle der Annahme, erhalten Sie die Unterschrift der Zustimmung zur Teilnahme am Spendenprogramm. Geben Sie dem Spender einen individuellen numerischen Code, um Anonymität zu garantieren. Notieren Sie sich die Identifikationsnummer der an der Längsstudie Beteiligten und geben Sie einen weiteren Code für die Gehirnbank an, um die beiden Untergruppen von Spendern (Teilnehmer oder Nichtteilnehmer an der Längsstudie; siehe Tabelle 3) einfach zu trennen.
4. Geben Sie dem Spender einen Personalausweis, der seinen Status als Spender erklärt und die Telefonnummer (rund um die Uhr verfügbar) anzeigt, um die Brain Bank über seinen Tod zu informieren.

2. Spenderbewertung und serienmäßige Follow-ups

HINWEIS: Es ist möglich, nur für einige und nicht für alle der unten genannten Prüfungen ihre Zustimmung zu erteilen. Alle klinischen Bewertungen werden vom selben Team durchgeführt, einschließlich eines Neurologen, eines Geriaters mit Expertise in der Neurologie und 3 Psychologen. Wenn sich neue Symptome entwickeln oder der kognitive Rückgang fortschreitet, kann das Zeitintervall zwischen den Follow-ups verkürzt werden.

1. Wie im Fall der InveCe.Ab-Studie erhalten Sie einen Lifestyle-Sozialen Fragebogen, einschließlich Grad der Autonomie (ADL, IADL), persönlichen Gewohnheiten, sozialen und Lifestyle-Faktoren, die geistige Funktionen beeinflussen können. Sammeln Sie Familien-, medizinische und neurologische Geschichte mit Informationen über genetische, infektiöse, toxische, metabolische, Autoimmun-, Herz-Kreislauf-, Trauma-, degenerative, neoplastische und neurologische Erkrankungen. Sammeln Sie frühere klinische Untersuchungen und listen Sie pharmakologische Behandlungen auf.
2. Führen Sie eine umfangreiche neuromotorische Bewertung einschließlich Tests für Die Hirnnervenfunktion, Fundus Oculi, Gesichtsfeld, Muskelkraft und Ton, Empfindlichkeiten, Sehnenreflexe, exterozeptive und primitive Reflexe, Meningeale Zeichen, Haltung, Gang, Bewegungen, Koordination, sphinkterische Funktionen, und jede Anwesenheit von fokalen oder Babinski Zeichen. Bewerten Sie Sprache, mentalen Status und jede Verhaltensänderung.
3. Führen Sie eine umfassende neurokognitive Bewertung einschließlich globaler Kognition und eine vollständige neuropsychologische Bewertung bestimmter kognitiver Bereiche durch: verbales und visuelles Gedächtnis, Aufmerksamkeit, psychomotorische Geschwindigkeit, Sprache, semantisches Gedächtnis, Exekutivfunktionen und visuospatiale Fähigkeiten(Tabelle 4 für Details). Betrachten Sie das Vorhandensein von Depressionen (CES-D-Skala).
4. Erhalten Sie eine Blutprobe, die sowohl für die Blutchemieanalyse (Tabelle 5) als auch für die Isolierung und Speicherung von DNA, Plasma und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) verwendet wird. Bestimmen Sie die APOE-Genotypisierung (rs429358 und rs7412) (eine umfassendere genetische Profilierung wurde in InveCe.Ab-Teilnehmern ermittelt; siehe Tabelle 6). Registrieren Sie ein EKG (Herzveränderungen, Vorhofflimmern) und ein RuhezustandSelektroenzephalogramm für die quantitative Analyse (QEEG).
5. Betrachten Sie optionale Biomarker-Tests, einschließlich Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) TAU, Phospho-TAU und Amyloid, und Gehirn-Bildgebung (MRT zum Nachweis von In-vivo-Degeneration, Ischämie oder Entzündung; FDG-PET zur Erkennung von Stoffwechselversagen; PIB-PET zum Nachweis der Hirnamyloidose im Zusammenhang mit der Pathophysiologie von Alzheimer).
6. Planen Sie das anschließende Check-up-Programm des Hirnspenders. Richten Sie die Zeitintervalle nach verschiedenen Altersgruppen ein (bis 64 Jahre: alle 10 Jahre, 65-74 Jahre: alle 3 Jahre, ab 75 Jahren: alle 2 Jahre).
7. Weisen Sie eine klinische Diagnose und/oder eine neurokognitive Diagnose nach DSM-V zu. Klassifizieren Sie die klinische Demenz-Inszenierung mit dem Klinischen Demenz-Rating (CDR)-Score. Aktualisieren Sie CDR in der letzten Periode vor dem Tod.
8. Bereiten Sie eine Datenbank grafisch ähnlich der Papierdatenbank vor. Fügen Sie alle gesammelten Daten in die Brain Bank-Datenbank ein. Planen Sie eine Überarbeitung durch einen anderen Sachbearbeiter, um fehlerbetätigt zu werden.

3. Zeitpunkt des Todes und der Hirnentfernung

HINWEIS: Das italienische Gesetz legt fest, dass Asystole länger als 20 min dauern muss, um den Tod zu bestätigen. Die Registrierung eines flachen Elektrokardiogramms (EKG) für mindestens 20 min (genannt Thanatographie) ermöglicht eine Autopsie innerhalb von 24 h nach dem Tod (DPR 285/90 Art. 8 und Gesetz Nr. 578 29. Dez 29, 1993). Eine postmortale Zeit von <24 h ist ein gutes Ziel, um die Gesamtgewebequalität zu erhalten. Im Falle einer Postmortem-Zeit >30 h wird die Autopsie abgebrochen (siehe Tabelle 2). Das Autopsieteam besteht aus einem Pathologen, einem Neurologen und/oder einem Neurobiologen, einer Krankenschwester, einem anatomischen Raumtechniker und allen Praktikanten; die ersten beiden Teammitglieder führen auch die neuropathologische Diagnose durch. Bei der Handhabung und Zerlegung des Kadavers ist die Verwendung geeigneter Kleidung (Mantel, Handschuhe, Brille und Haarnetz) obligatorisch. In diesem Abschnitt beschreiben wir die wichtigsten Werkzeuge und Geräte, die normalerweise in unserem Labor verwendet werden. Die Leser können die Instrumente wählen, die nach eigenem Ermessen verwendet werden sollen. Eine detaillierte Beschreibung der hier verwendeten Materialien finden Sie in der Tabelle der Materialien.

1. Stellen Sie sicher, dass die von der Familie gewählte Bestattungsgesellschaft den Leichnam in die ABB-Einrichtungen bringt. Führen Sie die Thanatographie durch, bei der die Herzaktivität fehlen muss. Wenn ja, unterschreiben Sie eine Sterbeurkunde und beginnen Sie mit der Autopsie.
2. Transportieren Sie den Kadaver zum Autopsieraum. Messen Sie den Umfang des Schädels auf der Ebene des breitesten Teils des Kopfes. Messen Sie von der Nasion bis zur Inion, um den Anteroposteriordurchmesser (APD) zu erhalten, während der Abstand von einem Ohr zum anderen den Querdurchmesser (TD) ergibt. Berechnen Sie den Cephalic Index (CI) mit der Formel: CI = TD/APD x 100.
3. Mit einem scharfen Skalpell, machen Sie einen Kopfhautschnitt auf der koronalen Ebene, von der Spitze des Mastoid-Prozesses auf einer Seite zur anderen, über den Scheitelpunkt. Haare, Haut und Unterhautgewebe durchschneiden und die beiden Falten der Kopfhaut vorsichtig vom darunter liegenden Schädel trennen. Führen Sie den Schnitt aus, bis das gelbe supraorbitale Fett sichtbar wird und die Kopfhaut anterior reflektiert. Ziehen Sie den anderen Teil nachtränk.
4. Mit Skalpell und Zange, nehmen Sie eine kleine Probe des zeitlichen Muskels an jeder Seite, legen Sie eine in 4% Formaldehyd und gefrieren die andere (siehe Abschnitt 7).
5. Schneiden Sie den Schädel mit einer elektrischen Säge nach einem V-Schnitt auf der Vorderseite. Entfernen Sie die Schädelkappe und schneiden Sie die Meninges. Probenstücke von Dura sind sowohl in 4% Formaldehyd fixiert als auch gefroren (siehe Abschnitt 7).
6. Erhalten Sie ca. 10 ml CSF, indem Sie eine 20 G 3,5-In-Nadel durch das Corpus callosum einsetzen, um den dritten Ventrikel zu erreichen. Bewerten Sie das Aussehen, die Farbe und die Trübung von CSF und messen Sie den pH-Wert. Dann 10 Aliquots von jeweils etwa 1 ml machen und bei -80 °C aufbewahren.
7. Heben Sie das Gehirn zart ziehen an beiden Frontallappen und schneiden Sie sowohl Die Sehnerven infundibulum, die inneren Karotisarterien (ICA) und die dritte, vierte, fünfte und sechste Hirnnerven. Schneiden Sie das Tentorium, um die hintere Fossa zu erreichen und schneiden Wirbelarterien und unteren Schädelnerven. Legen Sie das Skalpell so tief wie möglich durch das Foramen magnum, um den kaudalsten Teil der Medulla zu schneiden. An diesem Punkt, entfernen Sie das gesamte Gehirn sanft.
8. Mit dem Skalpell den Knochen über Meckels Höhle durchbohren und das Gasserische Ganglion von beiden Seiten erhalten. Fixieren Sie ein Ganglion in 4% Formaldehyd und frieren Sie das andere ein (siehe Abschnitt 7). Fraktur ieren Sie die knöcherne sella turcica mit einem chirurgischen Schlägel und Meißel, um die Hypophyse zu entfernen und dann fixieren Sie es in 4% Formaldehyd.
9. Überprüfen Sie den Schädel und das gesamte Gehirn auf makroskopische Veränderungen und Gefäßveränderungen. Mit einem Maßband messen Sie das Gehirn, um den Quer- und Anteroposteriordurchmesser zu erhalten. Holen Sie sich mit Sorgfalt den Kreis von Willis und bewerten Sie ihn makroskopisch (Abbildung 2E) für das Vorhandensein von anatomischen Varianten, Läsionen oder Gefäßstenose.
10. Nehmen Sie 1–2 Stück Leptomeningen von 2–4 cm² aus der Konvexität und bewahren Sie sie in vollständig hoher Glukose Dulbecco modifizierte Eagle Media (DMEM) Kulturmedium bei 4 °C mit 20% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Pen/Strep, 1% Glutamin und 1% nicht-essentielle Aminosäuren Aminosäuren Amino (wie zuvor veröffentlicht, mit einigen Modifikationen)⁴¹.
    1. Um Fibroblastenkulturen zu erhalten, legen Sie die Leptomeningen auf eine 10 cm Petrischale und waschen Sie sie zweimal mit Phosphatpuffer-Saline (PBS), wobei die Flüssigkeit jedes Mal entsorgt wird.
    2. Mit einem Skalpell und einer Pipettenspitze die Leptomeningen in kleine Stücke von ca. 2 oder 3 mm schneiden, 3–4 Stück in jedem Brunnen einer 6-Well-Platte säen, die zuvor mit Gelatine für 0,5% beschichtet war, und jeden Brunnen mit 2 ml komplettem Medium füllen, das mit 1% Amphotericin B ergänzt wird (die Verarbeitung in einem Biosicherheitsschrank durchführen, um die Sterilität der Kultur zu gewährleisten).
    3. Legen Sie die Platte in einen 37 °C, 5%_{CO2-Inkubator} für mindestens eine Woche und ändern Sie das Medium alle 3–4 Tage. Trypsinize Zellen mit sterilem 1x Trypsin, wenn der Brunnen bei etwa 70% des Zusammenflusses ist. Leptomeningeale Fibroblasten in einen T75-Kolben geben und mit 12 ml komplettem Medium füllen. Nach 5 Tagen versuchen und konservieren sie in 900 l FBS und 100 l Dimethylsulfoxid (DMSO).
11. Trennen und inspizieren Sie Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm und gewichten Sie sie einzeln. Nehmen Sie die Zirbeldrüse ab und fixieren Sie sie in 4% Formaldehyd. Entfernen Sie olfaktorische Glühbirnen und Sehnerven, und fixieren oder einfrieren Sie eines von jedem Paar, unabhängig von der Seite. Halten Sie das Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm in Eis bei 4 °C für mindestens 2-4 h, bis sie für die Zerlegung bereit sind, um Gewebestörungen zu minimieren und die Weichheit des Gewebes zu reduzieren.
12. Achten Sie nach der Ernte auf den Kadaver. Befestigen Sie den Knochen mit einem Super-Klebstoff klebern, und nähen Sie die Kopfhaut mit einer chirurgischen Nadel und nicht resorbierbaren Nähten zurück.
13. Zeigen Sie dem Verstorbenen Respekt und Dankbarkeit, indem Sie den Kadaver sanft behandeln. Reinigen und rasieren Sie das Gesicht, und waschen und trocknen Sie das Haar, weil der Kadaver in einem offenen Sarg für die Lieben sichtbar gelegt werden.
    HINWEIS: Die Neuzusammensetzung des Kadavers erfolgt durch einen Techniker. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. ABB-Sezierprotokoll

HINWEIS: Derselbe Pathologe und/oder Neurologe schneidet Hirnstamm, Kleinhirn und Großhirn unter eine Dunstabzugshaube. Ein Neurobiologe ordnet die Scheiben nach dem Schneiden an. Ein Praktikant, der sich nicht mit Hirnabschnitten befasst, dokumentiert das gesamte Verfahren mit Fotos, die in die Datenbank hochgeladen werden sollen, um in den nachfolgenden Gewebeverarbeitungsphasen als Leitfaden zu dienen.

1. Schneiden Sie den Hirnstamm mit einem Trennmesser axial ab und machen Sie den ersten Schnitt auf der Ebene des rostralen Mittelhirns durch den überlegenen Colliculus, um zwei Scheiben zu erhalten, die die Substantia nigra (SN) aussetzen.
2. Machen Sie den Rest der Schnitte, um 8 mm Hirnstammscheiben zu erwerben, um etwa 10 Abschnitte zu erhalten. Achten Sie darauf, Schnitte, die durch die rostralen Pons in der Nähe der oberen Ränder des vierten Ventrikels gehen, um den Lokus coeruleus (LC) zu beobachten, und durch die Medulla oblongata, die der akustischen Striae knapp über der unteren Spitze des vierten Ventrikels unterlegen ist, um Scheiben einschließlich des dorsalen Motorkerns des Vagus (DMNV) zu haben.
3. Nennen Sie alle Slices im rostrocaudalen Sinne als BS (Brainstem) gefolgt von arabischen Zahlen, um die Abschnitte zu identifizieren. Verwenden Sie nach dem letzten Hirnstammabschnitt die Bezeichnung SC (Spinalcord), gefolgt von den Zahlen 1–n. Je nach Anzahl der entfernten Spinal-Meamer werden etwa 2–4 SC-Scheiben erhalten (Abbildung 2H–I).
4. Beschriften Sie alle Abschnitte, die korrigiert oder abwechselnd eingefroren werden sollen, und nehmen Sie ein Bild für das Fotoarchiv auf (Abbildung 2). Fixieren und einfrieren Sie dann alle Slices wie unten beschrieben (Schritte 4.7 und 4.8).
5. Schneiden Sie das Kleinhirn auf der sagittalen Ebene, um die beiden Kleinhirnhalbkugeln auf der Ebene der Vermis zu trennen. Führen Sie sagittale Schnitte durch, um 5 Scheiben aus jeder Hemisphäre zu erhalten (Abbildung 2F–G).
6. Benennen Sie alle Slices aus vermis als CBR oder CBL (für rechtes bzw. linkes Kleinhirn) und verwenden Sie arabische Zahlen, um die Abschnitte zu identifizieren. Beschriften Sie alle Abschnitte, die abwechselnd fixiert oder eingefroren werden sollen, und machen Sie ein Foto für das Archiv (Abbildung 2). Fixieren und frieren Sie dann alle Slices wie unten beschrieben ein.
7. Trennen Sie die beiden Hemisphären des Großhirns durch den Corpus callosum (Abbildung 2A-B) und schneiden Sie sie einzeln auf der koronalen Ebene. Machen Sie den ersten Schnitt in einer Ebene, die zwischen dem optischen Chiasm und den Brustkörpern, durch Frontallappen, Temporalpol, vordere Cingulate, vordere Kommissure, Kern von Meynert und Basalganglien.
8. Führen Sie den zweiten Schnitt ca. 1 cm hinterder Weise durch die Brustkörper und die Basalganglien, vorderen Thalamus, Subthalamus und Amygdala aus. Fahren Sie fort, um die vorderen und hinteren Bereiche zu sezieren, um 1 cm Scheiben zu erwerben, um 15 bis 20 Abschnitte für jede Hemisphäre zu erhalten.
9. Legen Sie die Scheiben auf eine flache Oberfläche. Legen Sie sie ihrer ursprünglichen Position in anteroposterior Richtung, von der Front bis zum Okzipitalpol, mit dem Abschnitt kontinuierlich mit der vorherigen Scheibe nach oben.
10. Durch den Vergleich der Abschnitte aus beiden Hemisphären wählen Sie alternative Abschnitte aus jeder Halbkugel aus, die als festes oder gefrorenes Material beibehalten werden sollen. Erkennen Sie die Hauptabschnitte, die für die Histopathologie fixiert und verarbeitet werden sollen, einschließlich frontaler und zeitlicher Lappen, Cingulate, Basalganglien, Nucleus basalis von Meynert, Amygdala, Thalamus, Hippocampus und entorhinaler Kortex, okzipito-temporaler Gyrus, parietalen und okzipitalen Lappen.
11. Nennen Sie alle Slices im anteroposterior en Sinn als L (links) oder R (rechts) gefolgt von arabischen Zahlen und setzen Sie ein Etikett, das angibt, ob das Segment fixiert oder eingefroren werden soll (Abbildung 2A–D). Um die Abschnitte zu identifizieren, machen Sie ein Bild für das Fotoarchiv. Fixieren und einfrieren Sie dann alle Slices, wie in den Abschnitten 7 und 8 beschrieben.

5. Hirn- und Gefäßinspektion und makroskopische pathologische Bewertung (mit bloßem Auge)

1. Führen Sie eine allgemeine makroskopische Untersuchung unter Berücksichtigung von Meningealveränderungen, diffuser oder lokalisierter kortikaler Atrophie, Hippocampusatrophie, ventrikulärer Vergrößerung, Kleinhirnatrophie, Hirnstammatrophie, Substantia nigra pallor, Veränderungen der weißen Materie (Typ und Ort angeben).
2. Untersuchen Sie den Kreis von Willis unter Berücksichtigung von Arteriosklerose und Okklusion. Zuweisen Der Punktzahl = 1 in Gegenwart von Atherom ohne Stenose von mehr als 50%, Score = 2 wenn mindestens eine Arterie 50% oder mehr okkludiert ist, Score = 3, wenn zwei oder mehr Arterien 50% oder mehr okkludiert^{sind 42}. Bewerten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Pathologie in anderen intrakraniellen Gefäßen.
3. Um parenchymale Gefäßläsionen zu erkennen, untersuchen Sie Gehirnhälften, Kleinhirn und Hirnstamm. Berücksichtigen Sie lacunare Läsionen (Durchmesser < 10 mm), ischämische oder hämorrhagische Infarkte und Blutungen (Durchmesser > 10 mm). Wenn vorhanden, geben Sie größe in Millimeter, Zahl und Position an. Berücksichtigen Sie auch das Vorhandensein oder Fehlen von subarachnoiden Blutungen.

6. Gewebequalitätskontrolle

HINWEIS: Die Agonal Factor Score (AFS) liegt zwischen 0 und 2 und ist wichtig für die Bewertung der Gewebequalität. Um AFS zu bestimmen, betrachten Sie klinische Bedingungen, die um den Zeitpunkt des Todes auftreten (insbesondere Bedingungen, die Gehirnazidose bestimmen) und die Dauer des Agonalzustandes (plötzlicher Tod oder längere Qual). Wenn AFS > 1, das Gehirngewebe möglicherweise nicht von optimaler Qualität⁴³. Berücksichtigen Sie auch Gehirn und CSF pH; Wenn pH < 6, das Gehirngewebe möglicherweise nicht von optimaler Qualität^43,44.

1. Überprüfen Sie, ob der Tod durch Erkrankungen verursacht wurde, die Hirngewebe wie Hypoxie, langwierige Azidose, mechanische Beatmung, Multiorganversagen, hohes Fieber, schweres Schädeltrauma, Einnahme neurotoxischer Substanzen, schwere Dehydrierung, schwere Hypoglykämie, epileptischen Zustand und längeres Koma schädigen können. Wenn eine dieser Bedingungen vorhanden ist, weisen Sie 1 Punkt zu.
2. Überprüfen Sie die Dauer des Agonalzustandes(schnell, wenn der Tod innerhalb von 1 h auftritt, Zwischenwenn der Tod zwischen 1 und 24 h auftritt, langsam, wenn der agonale Zustand länger als 1 Tag dauert). Wenn ein zwischengeschalteter oder langsamer Tod eintritt, weisen Sie 1 Punkt zu.
3. Berechnen Sie den AFS-Wert und messen Sie den CSF-pH-Wert anhand einer Elektroden-pH-Nadel und eines pH-Gewebes durch ein pH-Messgerät auf einer Oberflächen-pH-Meter auf einer Hirnscheibe aus jedem Lappen und auf einem Kleinhirnabschnitt.

7. Einfrieren des Gewebes

1. Halten Sie alle Gewebe in Eis bei 4 °C gefroren werden. Dann frieren Sie sie schnell ein. Legen Sie sie auf ein vorgefrorenes Aluminiumfach. Abdeckung mit einer ineinandergreifenden Aluminiumplatte, um sie flach zu halten. Legen Sie sie in flüssigen Stickstoff bei -120 °C für 3 min.
2. Legen Sie die Scheiben in eine Plastiktüte, die mit dem entsprechenden Identifikationscode und der entsprechenden Scheibennummer beschriftet ist. Teilen Sie die Plastiktüten in drei kryogene Boxen (für rechte Hemisphäre, linke Hemisphäre und Hirnstamm) und lagern Sie bei -80 °C.

8. Gewebefixierung

1. Die Scheiben nacheinander in Gaze wickeln und die Scheiben in 10% Phosphat gepufferte Formalinlösung legen. Nach 1 Tag die formalinLösung durch eine frische Lösung ersetzen. Lassen Sie sie für ca. 5 Tage in einem kalten Raum bei 4 °C.
2. Alle Scheiben als Ganzes aufbewahren und nur die Scheiben, die Hippocampus und Amygdala enthalten, in zwei Teile teilen (Abbildung 3). Der obere Teil beider Scheiben enthält den Frontallappen (R10a–L9a in Abbildung 3); die unteren Teile enthalten jeweils: (1) Amygdala, Temporallappen und Basalganglien (L9b in Abbildung 3B) und (2) Hippocampus und einen Teil des Temporallappens (R10b in Abbildung 3A). Dies geschieht, um die Beziehung zwischen den verschiedenen Strukturen aufrechtzuerhalten.
3. Legen Sie alle Abschnitte mindestens 2 Tage in den Phosphatpuffer, um Kreuzverknüpfungsprodukte auszuwaschen und zu entfernen.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

9. Dehydrierung, Räumung, Paraffineinbettung und Diavorbereitung

1. Bereiten Sie steigende Konzentrationen von Ethylalkohol von 70% bis 100%, Xylol und zwei Sätzen geschmolzenem Paraffinwachs vor. Legen Sie die Gehirnabschnitte in den automatischen Prozessor für Dehydrierung, Clearing-Verfahren und Paraffin-Infiltration (verwenden Sie zwei verschiedene Gewebeverarbeitungsprotokolle für Makro (Zerebrum und Kleinhirn-Scheiben) und Mikroproben (Gehirnstamm-Slices und die anderen kleinen Proben); Tabelle 7). Das Gewebe in Paraffinwachs auf einer Metall- oder Kunststoffform einbetten.
2. Wählen Sie die Abschnitte aus, die geschnitten werden sollen, um alle Interessengebiete zu bewerten, die den Montine-Index für die neuropathologische Charakterisierung⁴⁵ anwenden (Tabelle 8). Schneiden Sie dann die ausgewählten Abschnitte in scheiben.
3. Verwenden Sie ein Schlittenmikrotom für Makrosektionen und ein Drehmikrotom für kleine Abschnitte. Schneiden Sie 5 'm Scheiben für Haematoxylin und Eosin (H&E) Färbung und 8 'm Scheiben für die anderen Färbungen und Immunhistochemie. Legen Sie die Scheiben auf drei verschiedene Arten von histologischen Dias: 8,5 cm x 11 cm für die größten Scheiben, 5 cm x 7,5 cm für mittlere Scheiben und die klassischen 2,5 cm x 7,5 cm für kleinste.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

10. Deparaffinierung, histologische Färbung und Immunhistochemie (IHC)

1. Führen Sie die Deparaffinierung durch, um eine Reaktion mit wässrigen Farbstofflösungen zu ermöglichen. Führen Sie es mit Xylol und abnehmender Alkoholkonzentration (5 min für jeden Schritt). Rehydratisieren Sie 5 min mit destilliertem Wasser.
2. Verwenden Sie die folgenden histologischen Färbungen, um architektonische und strukturelle Gewebeanomalien und zelluläre Morphologie zu bewerten: H&E (für vaskuläre mikroskopische Läsionen und Entzündungen), Cresyl Violet (NISSL; für neuronalen Verlust), Luxol Fast Blue (LFB; für Demyelination), Gallyas (für neuritische Plaques und Neuropil-Threads).
3. Verwenden Sie die Immunhistochemie (IHC), um das Vorhandensein spezifischer Zielstrukturen hervorzuheben. Anti-NeuN und Anti-GFAP werden verwendet, um neuronale und gliale Kompartimente zu identifizieren; 4G8, AT8, '-SYN und TDP-43 werden verwendet, um Proteine zu identifizieren, die sich bei neurodegenerativen Erkrankungen aggregieren (Tabelle der Materialien).
   1. Pretreat entwachste Abschnitte mit 3% H_2O2 für 10 min dann in PBS abspülen. Durchführung einer Retrieval-Behandlung mit Citratpuffer 0,01 Mio. pH 6 (seriell für 2, 1 und 2 min) für 4G8-, SYN-, TDP-43- und NeuN-Antigene; 70% Ameisensäure für 4G8 und Vorinkubieren für 30 min in 5% normalen Ziegenserum.
   2. Über Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper inkubieren. Am Tag danach die Abschnitte in PBS vor der Inkubation mit dem Sekundärantikörper (Envision+ System-HRP mit Polymer) bei einer Verdünnung von 1:2 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur abspülen.
   3. Waschen Sie mehrmals in PBS und inkubieren Sie in Chromogensystem mit Diaminobenzidin (Liquid DAB+Substrate Chromogen System) mit Blick auf die Reaktionsentwicklung unter dem Mikroskop (Vergrößerung 4–10x). Waschen Sie schließlich die Abschnitte in PBS. Gegenbeflecken Sie die Abschnitte in Hämatoxylin, dehydrieren und abdeckfest mit DPX-Montage.
      HINWEIS: Tabelle 8 fasst das Standardprotokoll zusammen. Führen Sie H&E-Färbung auf allen Abschnitten durch, während spezielle/spezifische Flecken und Reaktionen auf ausgewählten Abschnitten verwendet werden. Ausgewählte Fälle erfordern zusätzliche Bereiche oder Reaktionen. Die Materialtabelle zeigt die Details der Antikörper, die für IHC verwendet werden.

11. Grundlegende neuropathologische Charakterisierung

HINWEIS: Unspezifische Hirngewebeveränderungen, Gefäßpathologie, Alzheimer-Krankheit (AD) Pathologie, Nicht-AD-TAUopathien, Synukleinopathien, TAR-DNA-bindende Protein (TDP-43) Pathologie und hippocampale Läsionen werden untersucht. Ein an eine Kamera angeschlossenes optisches Mikroskop wird verwendet, um parenchymale mikroskopische Läsionen zu erkennen. Die histologische Beurteilung wird von demselben Team von geschultem Personal in der Neuropathologie durchgeführt, darunter ein Professor für Neurologie, ein Neurologe und ein Pathologe. Es basiert auf einem modifizierten Montine-Ansatz⁴⁵ (Tabelle 8) auch: (1) Heterogene nicht-AD-TAUopathien, die das pathologische Kennzeichen der Fronto-Temporal Lobe Degeneration (FTLD) im Zusammenhang mit TAU-Ablagerungen darstellen: Pick-Krankheit, nicht fließende primäre progressive Aphasie (TAU-nfPPA), Progressive Supranuclear Palsy (PSP)^46,47 und Cortico-Basal Degeneration (CBD)⁴⁸. Darüber hinaus umfassen Nicht-AD-TAUopathien Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Altern und ohne definitive klinische Bedeutung wie primäre altersbedingte TAUopathie (PART)⁴⁹, Altersbedingte TAU Astro-Gliopathie (ARTAG)⁵⁰, argyrophile Kornerkrankung⁴⁸. (2) Lewy Type Synucleinopathy (LTS), die mit der Parkinson-Krankheit (PD) und Lewy Bodies Demenz (LBD) zusammenhängt. Um nach LTS zu suchen, wenden Sie die folgenden hierarchischen Schritte an: zunächst Olfaktor, Hirnstamm, Amygdala/TemporalKorte; wenn die vorherigen Bereiche positiv sind, fügen Sie limbische Strukturen (Hippocampus-Bildung, entorhinalen Kortex, vordere cingulate), mittleren frontalen Gyrus, minderwertige parietale Lobule und okzipitalen Kortex⁴⁵hinzu. Wenn klinische Merkmale von kortikaler LBD vorhanden sind (d. h. Schwankungen und/oder Halluzinationen), berücksichtigen Sie limbische Strukturen und Isocortex für den ersten Schritt. (3) TDP-43-Ablagerungen, das pathologische Kennzeichen von FTLD im Zusammenhang mit TDP-43-Ablagerungen: Verhaltensvariante der Fronto-Temporalen Demenz (bvFTD), Semantische Demenz (SD oder svFTD), TDP-nfPPA und FTD-Motor Neuron Disease (FTD-MND). Der IHC für TDP-43 wird auf den folgenden Abschnitten durchgeführt: Amygdala, Hippocampus, entorhinaler Kortex und mittlerer frontaler Gyrus; in Fällen mit Verdacht auf klinische FTLD, erwägen, andere Abschnitte zu untersuchen⁵¹.

1. Bewerten Sie unspezifische Hirngewebeveränderungen in ausgewählten Abschnitten mit H&E, NISSL, LFB und IHC für GFAP und NeuN. Betrachten Sie neuronale Seltenheit, ballonierte Neuronen, Spongiose, Gliose, Myelinverlust, das Vorhandensein oder Fehlen von entzündlichen oder tumoralen Infiltraten. Geben Sie die vorherrschende Position dieser Änderungen an.
2. Um mikroskopische Gefäßläsionenzu erkennen, untersuchen Sie H&E- und LFB-Dias mit mindestens zwei hemisphärischen Makroabschnitten (die ersten durch die Brustkörper (Charcot-Schnitt) mit frontalen und zeitlichen Lappen, Basalganglien, vorderer Thalamus, Amygdala und der zweite Durchgang durch den okzipitalen Lappen, den "genulaten" Abschnitt der Hippocampusbildung, einen Kleinhirnabschnitt und alle drei Hauptabschnitte des Hirnstamms (durch substantia nigra, locus coeruleus und DMNV).
   1. Erkennen Sie kleine Gefäßerkrankungen wie Arteriolosklerose, Lipohyalinose, perivaskuläre Raumdilatation, Verlust der weißen Materie, leptomeningeale und/oder parenchymale und/oder kapillare zerebrale Amyloid-Angiopathie. Geben Sie die Benotung (0–3) und die vorherrschende Position^{42,52 an.} Betrachten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Hemosiderin Leckage, Mikroblutungen und Mikroinfarkte.
   2. Bewerten Sie den Beitrag von Gefäßschäden zu kognitiven Beeinträchtigungen anhand des hierarchischen Deramecourt-Schemas (Gefäßwandveränderungen – kleine Gefäßerkrankungen – makroskopische Infarkte). Für diese Bewertung betrachten Sie einen frontalen und zeitlichen Lappenabschnitt, Basalganglien und Hippocampus (Score 0–20)³⁰. Schätzen Sie auch die Wahrscheinlichkeit, dass zerebrale Gefäßerkrankungen zur kognitiven Beeinträchtigung beigetragen haben, indem Sie den VCING-Score (low-intermediate-high) verwenden, der durch die Berücksichtigung hemisphärischer makroskopischer Infarte und kleiner Gefäßerkrankungen des okzipitalen Lappens einschließlich mittelschwerer bis schwerer Arteriolosklerose und Amyloid-Angiopathie⁵³erzielt wurde.
3. Bewerten Sie die AD-Pathologie mit IHC (4G8) für die Amyloidausbreitung. Definieren Sie Thals Stufen (1–5)⁵⁴, Aggregat Amyloid-Scoring (0–3)⁴⁵und Morphologie pro Standort (diffus, fokal, entkernt).
   1. Bewerten Sie die AD Tau Pathologie mit IHC (AT8) und beschreiben Sie die vorherrschende Morphologie pro Standort (neurofibrilläre Verwicklungen, Neuropilfäden, neuritäre Plaques). Definieren Sie Braaks Stufe (I–VI +; positives Zeichen zeigt das Vorhandensein von zusätzlichen Bereichen der hyperphosphorylierten Tau-Pathologie an, die nicht der Braak-Hierarchie folgen)⁵⁵ und Aggregat-Scoring (0-3)⁴⁵.
   2. Bewerten Sie neuritische Plaques mit Gallyas Färbung und CERAD-Score (0–3)⁵⁶. Definieren Sie dann die Wahrscheinlichkeit der neuropathologischen Merkmale, Adie einem AD-Klinischen Syndrom entsprechen, mit dem A-Myloid-B-Raak-BC-ERAD-Score (ABC-Score 0–3): none-low-intermediate-high⁴⁵.C score
4. Verwenden Sie AT8 IHC, um das Vorhandensein oder Fehlen von nicht-AD TAU Pathologie angeben vorherrschende Nkung und seltsame morphologische Bild zu bemerken. Betrachten Sie neuronale Einschlüsse wie flammenförmige oder kugelförmige Verwicklungen, kugelkugelförmige Einschlüsse (d. h. Picks Körper)⁵⁷, Neuropil-Threads, dystrophische Neuriten, argyrophile Körner; und gliaale Einschlüsse wie getuftete Astrozyten, dornige Astrozyten, astrozytische Plaques, gewickelte Körper, kugelförmige Einschlüsse^58,59.
5. Verwenden Sie den IHC von Syn,h, um LTS (Lewy-Körper, blasse Körper und Lewy-Neuriten) an den Bereichen in der obigen Notiz zu erkennen. Im Falle der Positivität, wenden Sie McKeiths Einstufung (0-4) auf, um die Schwere der Läsionen⁶⁰zu bewerten; verwenden Sie dann Beachs Stadien (I–IV) für die topographische Verteilung (Olfaktorbirne, Hirnstamm vorherrschend, limbisch vorherrschend, neokortikal)⁶¹. Vergleichen Sie die Stadien von Beach und Braak, um die Beziehung zwischen LBD und AD Pathologie^60,61,62zu definieren.
6. Betrachten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Glial Cytoplasmic Inzinzien (GCI; nicht Lewy-Typ Glialsynuklenopathie), die das pathologische Kennzeichen der Multiple System Atrophie (MSA) sind und geben Sie ihre vorherrschende Position⁶³an.
7. Verwenden Sie TDP-43 IHC, um TDP-43-Ablagerungen auf den Bereichen in der obigen Anmerkung zu erkennen. Identifizieren Sie die vorherrschende Morphologie pro Standort: Neuronale zytoplasmatische Einschlüsse (NCIs), Distrophische Neuriteneinschlüsse (DNs), Nukleare Einschlüsse (NIIs). Definieren Sie das Muster: A (vorherrschende NN und DNs: bvFTD und nfPPA); B (vorherrschende NSI: FTD-MND); C (überwiegend lange DNs: svPPA und bvFTD)^51,64. Verwenden Sie Nelsons Schema, um das Vorhandensein von TDP-43 in AD-Fällen^65,66zu definieren.
8. Bewerten Sie den Hippocampus ausgehend von Subiculum und Sommer (CA1). Verwenden Sie die Punktzahl der Rauramaa (0:4): 1-2 für Mikroinfarkte bzw. Makroinfarkte; 3–4 entspricht einem mittelschweren bzw. schweren neuronalen Verlust bzw. Hippocampus-Atrophie (Hippocampussklerose: HS). Weisen Sie auf das Vorhandensein oder Fehlen pathologischer Proteinablagerungen hin (in abnehmender Reihenfolge⁶⁷der Häufigkeit: pTAU, TDP-43,
9. Definieren Sie die neuropathologische Diagnose und geben Sie alle pathologischen Daten in die Datenbank ein.
   HINWEIS: Die Räume, in denen das biologische Material und die sensiblen Daten der Spender gespeichert sind, sind immer verschlossen und nur das autorisierte Personal darf betreten werden, um sowohl Sicherheit als auch Privatsphäre zu gewährleisten. Das gefrorene biologische Material wird in verschlossenen Gefriertruhen bei -80 °C gelagert, während formalinfixierte Paraffin-eingebettete Gewebe in verschlossenen Schränken bei Raumtemperatur gelagert werden. Es werden Zweimotor-Gefrierschränke verwendet und ein Back-up-Gefrierschrank ist ebenfalls vorhanden. Um sicherzustellen, dass die Gefriertruhen immer funktionieren, verfügen sie über ein 24/7-Überwachungssystem, das einen Alarm auslöst. Bei Stromausfall ist auch ein Notstromaggregat vorhanden. Die Teilnehmer werden mit einem numerischen Code anonymisiert, um ihre Privatsphäre zu gewährleisten; es ist nicht möglich, dass nicht autorisiertes Personal zur Identität der Spender und ihrer sensiblen Daten zurückkehrt. Alle Informationen werden in einer kennwortgeschützten Datenbank gesammelt. ebenso wird eine Gedruckte dieser Daten in gesperrten Archiven aufbewahrt.

Ergebnisse

Hirnspender und Hirnerntedaten
Im Jahr 2014 begann die Einstellung von Spendern während der zweiten InveCe.Ab-Nachbeobachtungszeit, an der 1010 von 1061 förderfähigen Probanden beteiligt waren (Antwortquote: 93 %; Abbildung 1). Im Zusammenhang mit der Längs-Längsstudie InveCe.Ab wurden 290 von 1010 Teilnehmern (28,7%) sich als Spender registrieren zu lassen (160 bereits registrierte und 130, die ihre Anmeldeabsicht bekundet haben). Das Bildungsniveau ist bei den Spendern höher als bei Nicht-Spendern (66 % unserer Spender verfügen über ein mittleres Bildungsniveau: 8 oder mehr Schuljahre), was auf die Bedeutung von Kultur und Bildung hinweist. Auch viele "gesunde" Menschen zeigten Interesse am Hirnspendenprogramm. Die meisten unserer "Kontrollen" bekennen, dass sie mit den Erkrankten und ihren Angehörigen sympathisieren können und irgendwie zur Forschung beitragen wollen, die zu einem besseren Verständnis neurologischer Erkrankungen führt. Selbstlose Menschen, die sich im Laufe des Lebens regelmäßig an Blutspendeprogrammen für Blut oder Mark beteiligen, sind offener für die Idee der Gehirnspende, ebenso wie Menschen, die sich bereits bereit erklärt haben, nach dem Tod Organe zu spenden. Sie sind sich der Tatsache bewusst, dass ihre Spende für die Forschung von großer Bedeutung wäre, auch wenn es keinen lebenden Empfänger gäbe. Ein weiterer Faktor, der zur Gehirnspende beiträgt, ist die Bevorzugung, eingeäschert zu werden. Derzeit umfasst die ABB-Spenderpopulation insgesamt 427 Personen (290 InveCe.Ab-Teilnehmer + 137 Freiwillige oder Patienten aus dem ASP Golgi-Redaelli Geriatrisches Krankenhaus), von denen 75% 70 Jahre oder älter sind. Es gibt eine deutliche Dominanz von Frauen (64%) und geistig intakte ältere Menschen (ca. 85%). Bisher wurden 27 Gehirne von 40 verstorbenen Spendern geerntet (67% Autopsierate); 13 Probanden wurden aus verschiedenen Gründen nicht autopsiet, darunter das Versäumnis, ABB den Tod zu melden, schwere Verletzungen, die zu Einer Hirnzerstörung führen, gefährliche Infektionskrankheiten und 1 CJD-Fall; 4 Probanden haben ihre Einwilligung widerrufen. Bisher erhielten 24 der 27 geernteten Gehirne eine vollständige neuropathologische Charakterisierung mit einer eindeutigen klinisch-pathologischen Diagnose, während die restlichen 3 Gehirne noch untersucht werden (Tabelle 3). Weitere Daten zur Gewinnung des Gehirns von ABB umfassen: Durchschnittsalter bei Tod (81 Jahre); mittleres postmortem Intervall (10,37 h); mittlerer CSF-pH-Wert (6,64); mittlerer Gewebe-pH-Wert (6,07); durchschnittliches Gehirngewicht (1012,86 gr); AfS war einer von 90% der verstorbenen Probanden.

Neurophysiologische Biomarker (QEEG)
QEEG ist Teil des mehrdimensionalen Ansatzes. Es ist eine einfache, nicht-invasive und kostengünstige Methode, mit einem wahrscheinlichen Potenzial, um Umwandlung von milden Neuro-Kognitiven Störungen (mild-NCD oder MCI) zu großen Neuro-Kognitiven Störungen (Major-NCD oder Demenz) zu erkennen. Durch unseren mehrdimensionalen Ansatz wird eine einfache QEEG-Untersuchung durchgeführt und ihre mögliche Rolle als Biomarker für Demenz getestet. Unsere Daten zu einer vorläufigen Serie von 36 Hirnspendern (18 normale ältere Menschen (NOLD), 11 Mild-NCD und 7 Major-NCD; 9 davon mit einer eindeutigen neuropathologischen Diagnose) deuten darauf hin, dass der mittlere Alpharhythmusanteil bei Major-NCD signifikant niedriger war als bei Mild-NCD (p: 0,002) und NOLD (p: 0,033). Umgekehrt waren die langsameren EEG-Frequenzen (Theta/Delta) bei Major-NCD signifikant höher als bei NOLD/mild-NCD (siehe die Beispielfälle in Abbildung 4). In unserer Serie kann die EEG-Rhythmusverteilung NOLD/mild-NCD-Patienten unabhängig von der ätiologischen Diagnose von Major-NDC-Patienten unterscheiden, was darauf hindeutet, dass Gehirnrhythmen von der Belastung degenerativer Läsionen unabhängig vom Läsionstyp beeinflusst werden. Tatsächlich zeigen 7 von 9 untersuchten Gehirnen Demenz aufgrund gemischter Pathologien. Die Spezifität in Bezug auf die Art der Pathologie scheint gering zu sein, und die elektrischen Rhythmen des Gehirns scheinen mehr von der Belastung und Topographie der Läsionen als von ihrer molekularen Natur beeinflusst zu werden (Poloni, et al. Proceedings of AD/PD 2019, Lisbon, daten unveröffentlicht).

Emblematische Fälle
Das ABB-Protokoll kann in einigen Fällen und unter bestimmten Bedingungen nützlich und notwendig sein. Ein Beispiel ist das Vorhandensein einer asymmetrischen Pathologie (Abbildung 5). Unser Protokoll eignet sich sehr gut für die Identifizierung und korrekte Charakterisierung dieser Art von Pathologie. Bisher haben wir 4 Gehirne mit asymmetrischer Beteiligung untersucht, von denen einige in Abbildung 5dargestellt sind. Makroskopisch ist die rechte Seite atrophie (Abbildung 5A) in einem Fall mit schwerer ventrikulärer Dilatation im rechten koronalen Abschnitt (Abbildung 5C) im Vergleich zur linken Seite (Abbildung 5B) vorhanden. Ein anderer Fall zeigt einen Infarkt der rechten Hemisphäre (Abbildung 5D) und ein anderer zeigt eine deutliche Atrophie des rechten Brustkörpers (Abbildung 5E). Auf mikroskopischer Ebene zeigt ein Fall von FTLD eine asymmetrische TDP-43-Positivität, die in der rechten Frontseite intensiver ist als auf der linken Seite (Abbildung 5F,G).

Makroabschnitte (Abbildung 6A,C) werden verwendet, um eine Gesamtansicht zu erhalten. LFB-Färbung hilft, Myelinverlust zu identifizieren (Abbildung 6D) und IHC für 4G8 und AT8 (Abbildung 6B) ermöglicht es, die Verteilung der Immunreaktivität in den Hemisphären mit bloßem Auge zu bewerten. In der ABB-Serie stehen Gehirne verwandter Personen zum Vergleich zur Verfügung.

In Abbildung 7werden mikroskopische Bilder von Abschnitten aus dem Gehirn homozygoter Zwillinge nebeneinander platziert, um einen einfacheren Vergleich zu ermöglichen (Zwilling 1 (BB137): Abbildung 7A,C,E,G,I,K versus Zwilling 2 (BB138: Abbildung 7B,D,F,H,J,L). Wie in einer ähnlichen vorherigen Studie⁶⁸wurden beide Zwillinge durch klinische und neuropathologische Beurteilungen verglichen. Die Zwillinge berichteten die gleiche Diagnose von Major-NCD aufgrund mehrerer Ätiologien, aber sie starben zwei Jahre auseinander, im Alter von 83 (Demenz-Beginn mit 72 Jahren) bzw. 85 (Demenz-Beginn mit 76 Jahren). Ihr Gehirn hat ein sehr ähnliches neuropathologisches Bild, mit hoher AD-Pathologie, die mit Amyloid-Angiopathie assoziiert ist. 4G8 Immunreaktivität wird über den Kortex (Abbildung 7A,B) und Basalganglien (Abbildung 7C,D) mit diffusen, dichten und entkernten Plaques diffundiert. Es wird auch deutlich in parenchymalen und leptomeningealen Gefäßen des Kortex und des Kleinhirns nachgewiesen (Abbildung 7A,B,G-J). Bei höherer Vergrößerung ist capCAA deutlich zu erkennen (Abbildung 7G,H). AT8 immunpositive Plaques, Verwicklungen und Fäden sind in den parietalen Kortiken beider Gehirne diffus (Abbildung 7E,F,L). Hinsichtlich der Amyloid- und NFT-Pathologiebelastung gilt Zwilling 1 als Thal-Stufe 3 (Montin a2) und ein Braak-Stadium 5 (Montin b3), während Zwilling 2 als Thal-Stufe 5 (Montin A3) und Braak-Stufe 6 (Montinb3) betrachtet wird. Sie hatten die gleichen Jahre der Bildung und ähnlichen Lebensstil; einer (BB137) war verheiratet und wurde bald darauf verwitwet, während der andere ledig war (BB138). Sie zeigten unterschiedliche Grade der klinisch-pathologischen Variabilität mit dem gleichen Anfang und dem gleichen Krankheitsverlauf, aber in unterschiedlichen Zeitrahmen. Dies bestätigt die Tatsache, dass, obwohl die genetische Komponente eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung der Krankheit spielt, die epigenetische und ökologische Komponente für die Bestimmung leicht unterschiedlicher Manifestationen von grundlegender Bedeutung sind.

In einigen Fällen entspricht das klinische Bild nicht den nneuropaologischen Merkmalen. In Abbildung 8wurden zwei verschiedene Fälle klinisch als AD-Fälle definiert; neuropathologische Analysen zeigen neben einer zwischengeschalteten AD-Pathologie eine diffuse Positivität für die Syn. Im ersten Fall zeigt ein schweres LTS(Strand IV) Bild Lewy-Körper, die homogen im gesamten Gyrus cingoli (Abbildung 8A) und im SN als zytoplasmatische Einschlüsse gefunden wurden, die von Neuromelanin umgeben sind (Abbildung 8B,C). Im zweiten Fall sind Lewy-Körper, die mit Lewy-Neuriten assoziiert sind, in der Amygdala (Abbildung 8D,E) und in Meynerts Kern (Abbildung 8F,G) diffus verteilt, was auf eine limbische LTS-Diagnose hindeutet. Tatsächlich erzeugt die Topographie der Läsionen und nicht ihre molekulare Natur die klinischen Manifestationen.

Abbildung 1: Flussdiagramm der Inve.Ce.Ab-Studie. Zu Beginn betrug die Gesamtprävalenz von Demenz 3 %. Im Verlauf der Folgemaßnahmen betrugen die Prävalenzraten: 4,4%^(1.)⁶⁹, 7,1% (2^nd), 10,9% (3.^Platz). Die Inzidenzrate für acht Jahre betrug 15 p/1000/Jahr (95% CI: 13–18 p/1000/Jahr). Die Einstellung von Spendern begann 2014 (während der zweiten Folgemaßnahme). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Dissektionsprotokoll von Großhirn (A), Kleinhirn (F) und Hirnstamm (H). Kreis von Willis und einzelnen Hemisphären sind in (E) und (B) dargestellt. Koronale Schnitte von rechts (C) und links (D) sind nummeriert und alternativ fixiert ("F") und gefroren ("C"). Gezeigt werden sagittale Kleinhirnabschnitte (G) und Hirnstammaxialabschnitte (I). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Koronale Scheiben von festen rechten (A) und linken (B) Fronto-Temporallappen werden angezeigt.
Hippocampus und Temporallappen (A, R10b) werden vom Frontallappen (A, R10a) auf der rechten Scheibe getrennt. Auf der gegenüberliegenden Scheibe sind die Amygdala und Basalganglien (B, L9b) vom Frontallappen (B, L9a) getrennt. Maßstabsleiste: 1,7 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Relative spektrale Leistungsverteilung bei NOLD- und Major-NCD-Themen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Repräsentative Bilder asymmetrischer Pathologien. (A) Erster Fall: Gehirn mit rechter Atrophie. Koronale Scheiben (B) und (C) zeigen rechtsseitige ventrikuläre Dilatation, besonders deutlich in den Abschnitten 10–12 (C, Pfeile). In den Abschnitten (B) und (C) steht "F" für fest und "C" für gefroren (italienisch: congelato). (D) Zweiter Fall: schwerer Infarkt der rechten Hemisphäre. (E) Dritter Fall: Atrophie des rechten Brustkörpers (Pfeil). (F, G) Vierter Fall: Mikroskopische Bilder zeigen eine intensivere TDP-43-Immunreaktivität im frontalen rechten Kortex (G) im Vergleich zum linken (F) bei frontotemporaler Demenz. Skalenbalken: 183 m (F, G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Makroabschnitte. (A, C) Koronale Scheiben von festem Fronto-Temporallappen (A) und frischem parietalen Lappen (C). (B) Histologischer fronto-temporaler Abschnitt immunolabeliert mit AT8-Antikörper. Die Immunreaktivität ist klar über den Kortex verteilt, aber intensiver im temporalen Lappen. (D) Histologische parietale Sektion mit LFB gefärbt. Der Pfeil zeigt einen Bereich der Demyelination der weißen Materie an. Maßstab: 1,55 cm (B, D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Zwillinge. Vergleich der Gehirne zweier homozygoter Zwillinge: BB137 (A, C, E, G, I, K) und BB138 (B, D, F, H, J, L). Die neuropathologischen Bilder sind sehr ähnlich. (A) und (B) zeigen diffuse 4G8-Positivität im okzipitalen Lappen mit Amyloid-Plaque, Leptomeningeal (Pfeile) und parenchymalen (Pfeilspitzen) Gefäßen. Kapillaramyloid-Angiopathie (Sternchen) ist bei höheren Vergrößerungen (G) und (H) gut anerkannt. 4G8 ist diffus in den Basalganglien (C, D) und um leptomeningeale Gefäße des Kleinhirns verteilt (I, J: Pfeile). AT8 Immunreaktivität identifizieren Verwicklungen, Fäden und Plaques (Pfeile) in der parietalen Kortex (E, F). Gallyas Färbung (K) zeigt neuritische Plaques wie AT8-Antikörper (L). Skalenbalken: 470 m (A–F; I-J); 90 m (G–H; K-L). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Klinische versus neuropathologische Diagnose. In dieser Abbildung werden zwei verschiedene Fälle berichtet, in denen sich die neuropathologische Diagnose von der klinischen Diagnose unterscheidet. Die Immunreaktivität für die Syn-Syn ist ein unerwartetes Ergebnis. (A–C) Erster Fall: Gyrus cingoli (A) zeigt homogene Verteilung von Lewy-Körpern in SN (B-Pfeile). In einem Neuron von SN wird ein doppelter Lewy-Körper gezeigt, der von Neuromelanin umgeben ist (C). (D–G) Zweiter Fall: Eine diffuse Positivität für die Syn-Syn ist im Amygdala-Kern (D, E) und dem Meynert-Kern (F, G) nachweisbar. Zellkörper und Lewy-Neurriten (Sternchen) sind gut markiert. Skalenbalken: 154 m (A, D, F); 37 m (B, E, G); 20 m (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Vorlage für Übertragungsvereinbarungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

		N	%
Geschlecht	Männer	607	45.9
	Frauen	714	54.1
Geburtskohorte	1935	236	17.8
	1936	219	16.6
	1937	264	20.0
	1938	305	23.1
	1939	297	22.5
Familienstand	Verheiratet	872	66.1
	Zusammenlebende	13	1.0
	Getrennt/geschieden	29	2.2
	Verwitwet	325	24.6
	Einzelnen	80	6.1
Primäre Lebensbesetzung	Arbeiter	666	50.6
	Angestellte	459	34.9
	Hausfrau	191	14.5
Jahre der Ausbildung	5 Jahre	754	57.2
	>5 Jahre	565	42.8

Tabelle 1: Soziodemografische Merkmale der Studienteilnehmer in InveCe.Ab.

INKLUSIONSKRITERIEN	Ausschlusskriterien
Alle Personen ab 18 Jahren	Menschen, die die Spende unverhohlen ablehnen
Lebende Menschen auf dem Gebiet von Abbiategrasso	Menschen, die außerhalb der Lombardei leben
Freiwillige, die ihre Zustimmung geben	Diskrepanzen zwischen dem potenziellen Spender und NOKs-Wünschen in Bezug auf Hirnspende
Themen, die nicht mit DER Genehmigung von NOK entscheiden können	Situationen, die die Konsistenz des Gehirns stark zerstören
Tod durch natürliche Ursache	Klinischer Verlauf von <2 Jahren, es sei denn, die Möglichkeit einer Prionenerkrankung wurde ausgeschlossen
	Tod durch Tötung oder Selbstmord, mit der Notwendigkeit eines Koronarberichts
	Post-Mortem-Intervall >30 Stunden

Tabelle 2: Kriterien für eine Hirnspende.

Nr.	Sex	CODE BB	CODE InveCe	Alter	edu (yrs)	Klinische Diagnose			Cdr	Afs	PM (Hrs)	pH-Gewebe	pH-Likör	neuropathologische Diagnostik
1	F	BB 37		87	5	Major-NCD durch AD (BPSD)			5	2	29	Nd	Nd	Hohe AD-Pathologie, moderate SVD, TDP43+, ctx LTS, HS
2	F	BB 105		94	5	Major-NCD aufgrund von AD			5	1	5	5.72	6.78	Hohe AD-Pathologie, milde SVD, HS
3	F	BB 137		83	3	Major-NCD durch multiple Ätiologien (AD-VaD)			5	1	16	Nd	Nd	Hohe AD-Pathologie, moderate SVD, okzipitaler Infarkt, CAA-capCAA
4	M	BB 181		71	13	Major-NCD durch AD (BPSD)			5	2	3	Nd	Nd	Schwere LTS (Strand IV), Zwischen-AD-Pathologie, mildSVD, mCAA
5	M	BB 115	I 636	78	18	Major-NCD aufgrund von AD			5	1	6	Nd	Nd	Intermediate AD, moderate SVD, Entzündung, ILBD (Strand IIa), HS
6	F	BB 23	I 65	79	3	Major-NCD aufgrund von Gefäßerkrankungen			5	1	14	Nd	Nd	Schwere und weitverbreitete CAA, Intermediär-AD-Pathologie
7	M	BB 102	I 412	79	8	Major-NCD aufgrund von Gefäßerkrankungen			3	1	8	Nd	Nd	Vaskuläre Demenz, ILBD
8	M	BB 224	I 16	80	3	Major-NCD aufgrund mehrerer Ätiologien			5	1	11	Nd	5.99	Moderate SVD, Low AD Pathologie, ILBD (Strand IIa), HS
9	F	BB 47		78	5	Major-NCD zu mehreren Ätiologien (LBD-VaD BPSD)			5	0	8	Nd	Nd	Hohe AD-Pathologie, BG TAU Pathologie, ARTAG, milde SVD, HS
10	F	BB 153	I 965	79	5	Mild-NCD (Tod durch Dickdarmkrebs mit weit verbreiteter Metastasierung)			0.5	1	8	Nd	6.73	Niedrige AD-Pathologie, moderate BG-SVD
11	M	BB 118	I 1211	79	13	NOLD (Tod durch Leberkrebs)			0	2	3	Nd	6.51	Moderate SVD
12	M	BB 236	I 521	80	3	Major-NCD durch AD (BPSD)			4	1	15	Nd	6.15	Hohe AD-Pathologie, Schwere BG-SVD (mehrere Mikroblutungen), HS
13	F	BB 138		85	3	Major-NCD durch mehrere Ätiologien (AD-VaD BPSD)			4	0	15	Nd	6.75	Hohe AD-Pathologie, moderate SVD, CAA, limbische TDP43
14	M	BB 109	I 876	79	8	NOLD (Tod durch Hirntumor - GBL)			0	1	16	Nd	6.4	Low AD Pathologie, ILBD (Strand IIa), milde SVD
15	F	BB 271		84	8	Major-NCD durch AD (BPSD)			4	1	2	Nd	6.7	ZwischenAD, limbische LTS, mäßig BG-SVD, mCAA, TDP
16	F	BB 71	I 1080	79	8	NOLD (Tod durch Herzinsuffizienz)			0	0	6	Nd	6.26	Mäßige BG-SVD, ILBD, amy TDP, low AD
17	F	BB 189	I 858	80	5	Major-NCD durch AD (BPSD)			3	0	20	Nd	6.42	Zwischen-AD, CAA-capCAA, TDP43, mäßig BG-SVD, HS
18	F	BB 278	I 924	80	5	Major-NCD durch LBD (BPSD)			3	1	5	6.02	7.05	Intermediate AD, limbic LTS (Strand IV), limbische TDP, HS
19	F	BB 247		104	8	Major-NCD aufgrund mehrerer Ätiologien (wahrscheinlich gemischte Pathologie)			3	0	6	6.48	7.22	TAU Pathologie (PART-ARTAG), HS
20	M	BB 85	I 19	83	10	Major-NCD durch LBD (BPSD)			3	1	9	6.26	7.3	Schwere limbische LTS, Zwischen-AD, Moderate SVD, schwere CAA-CapCAA, HS
21	F	BB 14	I 222	82	8	Major-NCD durch multiple Ätiologien (AD-VaD)			2	1	11	5.59	6.4	Intermediate AD Pathologie, Moderate SVD
22	F	BB 282		76	8	Major Frontotemporal ECD (nfPPA BPSD)			3	1	10	6.07	6.39	TDP (Typ A), ILBD, moderate SVD, low AD, HS
23	F	BB 154	I 1079	80	5	NOLD (Tod durch Krebs mit weit verbreiteter Metastasierung)			0	1	5	6.49	6.9	moderate SVD, CAA, low AD, limbische Enzephalitis
24	F	BB 290		65	13	Haupt Frontotemporal ECD (bvFTD BPSD)			5	1	12	5.73	6.42	TDP (Typ A)
25	F	BB 210		89	8	Major-NCD durch AD (BPSD)			5	1	15	5.94	6.4	in Arbeit
26	M	BB 293		75	18	Major Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD)			5	1	8	6.14	6.83	in Arbeit
27	F	BB 99	I 1370	79	9	NOLD (Tod durch septischen Schock)			0	2	14	6.3	7.12	in Arbeit
	M/F			Bedeuten	Bedeuten				Bedeuten	Bedeuten	Bedeuten	Bedeuten	Bedeuten
	0.5			81	7.7				3.2	1.0	10.4	6.1	6.6

Tabelle 3: Klinische/neuropathologische Diagnose der ABB-Serie. BB: Brain Bank; edu (Jahre): Ausbildungsjahre; CDR: Klinische Demenz-Bewertung (0 = keine Demenz; 0,5 = leichte kognitive Beeinträchtigung; 1 = leichte Demenz; 2 = mittelschwere Demenz; 3 = schwere Demenz; 4 = sehr schwere Demenz; 5 = terminale Demenz); AFS: Agonal Factor Score; PM (Hrsg.): Post Mortem Stunden; nd: nicht getan; M/F: Männchen/Frauen; BPSD: Verhaltens- und psychologische Symptome von Demenz; VaD: Vaskuläre Demenz; NOLD: Normale ältere Menschen; GBL: Glioblastom; nfPPA: nicht fließende primäre progressive Aphasie; bvFTD: Verhaltensvariante der Frontotemporalen Demenz; SVD: Kleine Gefäßerkrankung; LTS: Lewy Typ Synucleinopathie; HS: Hippocampal Sklerose; CAA: Zerebrale Amyloid-Angiopathie; capCAA: KapillarCAA; mCAA: meningeale CAA; ILBD: Zufällige Lewy-Körpererkrankung; BG: Basal Ganglia; ARTAG: Altersbedingte TAU Astro-Gliopathie; TEIL: Primäre altersbedingte TAUopathie; amy: amigdala.

Domäne	Testname
Depression	Center for Epidemiologic Studies Depression Scale (CES-D) [2]
Globale Erkenntnis	Mini-Mental State Examination (MMSE) [1]
Verbales und visuelles Gedächtnis	Freier und Cued Selective Reminding Test [3]
	Corsi-Test [4]
	Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) Rückruf [5]
Aufmerksamkeit/ psychomotorische Geschwindigkeit	Trailmaking A [6]
	Aufmerksamkeitsmatrizen [4]
Sprachsemantisches Gedächtnis	Semantische Verbalfluency (Farben, Tiere, Früchte, Städte) [4]
Führungsfunktionen	Trailmaking B [6]
	Raven es Coloured Matrizen [7]
Visuospatial-Fähigkeiten	Uhrenzeichnungstest (CDT) [8]
	Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) Kopie [5]

Tabelle 4: Neuropsychologische Beurteilung für Hirnspender.

Metaboliten

Vollständiges Blutbild

Cholesterin HDL und LDL

Triglyceride

Glukose

Glykiertes Hämoglobin (HbA1c)

Homocystein

Cobalamin (Vitamin B12)

Folsäure

Albumin

Harnstoff

Kreatinin

Transaminasen (ALT und AST)

Gamma Glutamyl Transferase

Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH)

Vitamin D (25-hydroxy-vitamin D)

C-Reaktives Protein (CRP)

Elektrolyte

Tabelle 5: Metabolisches Panel für Hirnspender.

GENNAME	dbSNP
Apolipoprotein E (APOE)	rs429358
	rs7412
Katasse (CAT)	rs1001179
Superoxiddismutase 2 (SOD2)	rs4880
Angiotensinogen (AGT)	rs699
Sirtuin 2 (SIRT2)	rs10410544
Translocase der äußeren mitochondrialen Membran 40 (TOMM40)	rs2075650
Überbrückungsintegrator 1 (BIN1)	rs7561528
Catechol-O-Methyltransferase (COMT)	rs4680
Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR)	rs1801133
	rs1801131
Neurotropher Faktor des Gehirns (BDNF)	rs6265
solute Trägerfamilie 6, Mitglied 4 (SLC6A4 oder 5HTT)	Hydroxytryptamin-Transporter gengebundene polymorphe Region (5-HTTLPR)
	rs25531

Tabelle 6: SNPs analysiert für InveCe.Ab Hirnspender.

Prozess	Lösung	Dauer
		MAKRO-BEISPIELE	MIKROPROBEN
Fixierung	10% GEPUFFERTES FORMALIN	8 Tage bei 4 °C	8 Tage bei 4 °C
Waschen	PHOSPHATE BUFFER	2-15 Tage bei Raumtemperatur	2-15 Tage bei Raumtemperatur
Waschen	H2O WASH	2-3 h, Leitungswasser	2-3 h, Leitungswasser
Dehydrierung	ETHYLALKOHOL 70%	24 h	8 h
Dehydrierung	ETHYLALKOHOL 80%	24 h	4 h
Dehydrierung	ETHYLALKOHOL 90%	60 h (in der Regel über das Wochenende)	4 h
Dehydrierung	ETHYLALKOHOL 95%	12 h	4 h
Dehydrierung	ETHYLALKOHOL 95%	12 h	4 h
Dehydrierung	ETHYLALKOHOL 100%	6 h	4 h
Dehydrierung	ETHYLALKOHOL 100%	6 h	4 h
Clearing	XYLENE I	12 h	10 h
Clearing	XYLENE II	12 h	10 h
Infiltration	PARAFFIN I	12 h	11 h
Infiltration	PARAFFIN II.	12 h	11 h
Einbetten	PARAFFINWACHS

Tabelle 7: ABB-Gewebeverarbeitungsprotokoll.

Region	H&E	CRESIL VIOLETT	LFB	GALLYAS	4G8	AT8	€SYN	TDP-43	Neun	GFAP
Hirnstamm
Medulla- Dorsal Motor Kern von Vagus	X					X	X
Pons - Locus Coeruleus	X					X	X
Midbrain - Substantia Nigra	X				X	X	X
Kleinhirn
Kleinhirn-Kortex und Dentate-Kern	X	X	X		X
Gehirns
Mittlerer frontaler Gyrus	X	X	X		X	X	X	X
Basal Ganglia + Kern von Meynert	X	X	X		X				X	X
Cingulate, vorder	X	X	X		X		X		X	X
Amygdala	X					X	X	X	X	X
Thalamus und subthalamischer Kern	X					X
Überlegener und mittlerer zeitlicher Gyri	X	X	X	X	X	X	X		X	X
Hippocampus und Entorhinal-Kortex	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Minderwertige parietale Lobule	X	X	X	X	X	X	X
Okzipitaler Kortex	X		X		X	X	X
Olfaktorische Glühbirne	X						X

Tabelle 8: Bewertete Regionen, Färbung und Immunhistochemie.

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
Unser Ziel ist es, hochwertige Gewebe von Themen mit detaillierter Geschichte, die aus der Längsbeobachtung abgeleitet sind, zu erhalten, zu charakterisieren und zu speichern. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es erforderlich, sich mit den folgenden Schlüsselaspekten zu befassen. Wie oben beschrieben, beginnt das Protokoll mit der Rekrutierung von Spendern, was der erste entscheidende Schritt ist. Dann ist es notwendig, dass die Spender das Folgeprogramm fortsetzen und die Haftung an dem Projekt über die Zeit bis zur eigentlichen Spende des Gehirns aufrecht erhalten. Zum Zeitpunkt des Todes ist es notwendig, dass das ABB-Personal unverzüglich benachrichtigt wird, um das Autopsieteam innerhalb von 24 Stunden einzuberufen, was für eine angemessene Gewebequalität wichtig ist. Frisches Schneiden der zerebralen Hemisphären erfordert eine ruhige Hand und ein spezifisches Training. Um Zellschäden durch langsames Einfrieren zu vermeiden und qualitativ hochwertige Scheiben für den Kryostat und Omics zu erhalten, ist es wichtig, dass sie schnell eingefroren werden. Unter Berücksichtigung der Geschwindigkeit des Eindringens von Formalin-Lösung (1 mm/Stunde), um Gewebeantigenität zu erhalten, wird die Einweichzeit der einzelnen Scheibe auf ihrem Minimum gehalten.

Fehlerbehebung der Methode
Um die oben genannten kritischen Schritte zu beheben, bieten wir den folgenden Ansatz an. Spenderrekrutierung und Die Einhaltung von Follow-ups: Es gibt mehrere Faktoren, die die Gehirnspende behindern, darunter Ängste, die Figur des Körpers zu beschädigen, Reinheit und Integrität oder die Möglichkeit, Schmerzen nach dem Tod zu empfinden. Einige befürchten sogar, dass die Autopsie durchgeführt werden könnte, während sie noch am Leben sind^70,71. Bedenken hinsichtlich der Unterbrechung der Bestattungsmodalitäten und der finanziellen Belastung bestehen ebenfalls⁷². Darüber hinaus kann das mangelnde Wissen eines medizinischen Personals über postmortale Verfahren und die Unfähigkeit, die Bedenken potenzieller Spender oder deren NOK zu berücksichtigen, die Registrierung verhindern. All diese Faktoren können zu einem geringen Bekanntheitsgrad bei einer geringen Anzahl von eingeschriebenen Teilnehmern und einer hohen Wahrscheinlichkeit von Spenderverlusten im Laufe der Zeit führen. In der Tat sollte das Programm zur Einstellung von Spendern effizient sein, um das Bewusstsein zu schärfen, Vertrauen zu schaffen und die Menschen davon zu überzeugen, sich zu registrieren und eine hohe Beteiligungsquote aufrechtzuerhalten. Unserer Erfahrung nach erfolgt dies durch eine sorgfältige Auswahl potenzieller Spender und eine gründliche Erläuterung der Ziele des BB. Wir bieten pädagogische Aktivitäten und einen empathischen Ansatz, der sowohl bei gesunden Menschen als auch bei Menschen mit neurodegenerativen Erkrankungen und ihren Familien auf die Ängste und Bedürfnisse eingeht. Wir stellen fest, dass potenzielle Spender eher ihre Zustimmung geben, wenn sie persönlich angesprochen werden. Ein face-to-face-Ansatz schafft eine Beziehung, die auf gegenseitigem Vertrauen und Respekt basiert, die von grundlegender Bedeutung ist, um einen hohen Prozentsatz der Registrierung für Hirnspenden und Follow-up-Bewertungen zu erreichen. Ein hochqualifiziertes Personal mit einem ausgeprägten Sinn für Ethik nähert sich zunächst dem potenziellen Spender, diskutiert die Möglichkeit, das Gehirn nach dem Tod zu spenden, erklärt den Wert des menschlichen Hirngewebes für neurowissenschaftliche Forschung und klärt jeden Zweifel an postmortalen Verfahren. Günstige Mundpropaganda ist ebenso wichtig. Nach der Gehirnernte wird entsprechend darauf geachtet, den Kadaver neu zu komponieren. Es ist wichtig, dem Verstorbenen Respekt und Dankbarkeit zu zeigen, indem man den Kadaver sanft behandelt. Wenige Monate später ist ein Treffen geplant, um die Ergebnisse der neuropathologischen Analyse zu kommunizieren, wann immer von Familienmitgliedern gewünscht.

Der Zeitpunkt des Todes und der Gehirnernte: Wenn die Person akzeptiert, wird sie spenderund und erhält einen Personalausweis mit einer Nummer, um 24 Stunden/Tag, 7 Tage/Woche (die Empfangsnummer des ASP Golgi-Redaelli Geriatrischen Krankenhauses, das mit uns verbunden ist) zu kontaktieren. Darüber hinaus wird den Angehörigen ein Klebeetikett gegeben, das im Falle eines Krankenhausaufenthalts verwendet werden soll. Die Bestattungsunternehmen der Region wurden zuvor informiert, um den Leichnam zu den ABB-Einrichtungen zu bringen, wo das Autopsieteam vorgeladen wird. Das Autopsieteam besteht aus einem Pathologen, einem Neurologen und/oder einem Neurobiologen und einem anatomischen Raumtechniker, die täglich von 6 bis 23 Uhr auf Abruf sind; Einige Auszubildende sind auch häufig anwesend, um zu helfen und Fotos zu machen.

Die Präzision und Konsistenz der neuen Schneidverfahren wird durch die Einbeziehung der beiden Bediener (ein Neurologe und ein Pathologe) gewährleistet, die die Methode entwickelt haben und über mehrjährige Erfahrung in der Neuropathologie verfügen. Beim Einfrieren der Scheiben werden sie auf eine vorgefrorene Aluminiumschale gelegt und mit einer ineinandergreifenden Aluminiumplatte überzogen, um sie gut flach zu halten. Unmittelbar danach werden sie 3 Minuten lang in flüssigen Stickstoff gegeben, bevor sie bei -80 °C gelagert werden. Die zu fixierenden Scheiben werden einzeln in Gaze gewickelt und in eine 10% phosphatgepufferte Formalinlösung eingeweicht, die nach einem Tag ersetzt wird. Anschließend werden sie in formalen nicht mehr als 5 zusätzlichen Tagen aufbewahrt; Wenn wir jedoch bedenkt, dass die Formalinlösung bei 1 mm/Tag eindringt, möchten wir die Einweichzeit weiter verkürzen.

Einschränkungen der Methode
Die hier beschriebene Forschungsmethode deckt nur ein begrenztes geografisches Gebiet ab, und die am Spendenprogramm beteiligten Personen besitzen Merkmale, die nicht vollständig die allgemeine Bevölkerung repräsentieren. Obwohl mehr als akzeptabel, kann ein postmortem Intervall von bis zu 24 Stunden Veränderungen in einigen Proteinstrukturen, Enzymen und RNA des Gehirngewebes produzieren. Die Bestimmung von AFS und pH ist möglicherweise nicht völlig ausreichend für die Bestimmung der Gewebequalität⁷³ und wir entwickeln andere Möglichkeiten zur Authentifizierung der Gewebequalität auf der Grundlage der RNA-Integrität.

Was das Mikrotome-Schneidverfahren betrifft, so ist zwar sehr nützlich für die Rekonstruktion anatomischer Beziehungen, doch ist zu beachten, dass die Verwendung von Makrosektionen nicht einfach ist und einige technische Schwierigkeiten mit sich bringt. Unsere Methode ist anspruchsvoll und zeitaufwändig. Die Kosten sind recht hoch, und die Finanzierung ist nicht immer einfach. Die Mittel stammen in erster Linie aus öffentlichen (ASP Golgi-Redaelli Geriatrisches Krankenhaus) und privaten Mitteln (Golgi-Cenci-Stiftung), privaten Spenden, gemeinnützigen Organisationen (z.B. "Federazione Alzheimer Italia") und Stipendien.

Zur Bedeutung der ABB-Methode im Hinblick auf bestehende/alternative Methoden
Zu Beginn richtete sich unser Gehirnspendeprogramm an Personen, die an der Längsstudie InveCe.Ab teilnahmen. Infolgedessen werden die gespendeten Gehirne von detaillierten klinischen, biologischen und sozialen Informationen begleitet, die im Laufe der Jahre gesammelt wurden. Die Stärke von ABB ergibt sich gerade aus diesem unverwechselbaren Ursprung. Die Untersuchung einer Gruppe von sozial und genetisch verwandten Personen, die biologische Merkmale und Umweltexpositionen teilen, verbessert die statistische Analyse. Darüber hinaus umfasst die Studie folgende Vorteile: 1) Betreuung und Versorgung der Bedürfnisse der Gemeinschaft (der Akt des "Gebens vor dem Fragen"): Die Menschen erhalten eine kostenlose regelmäßige Untersuchung, über die der Hausarzt informiert wird, eine Telefonnummer unseres Sekretärs wird für Konsultationen zur Verfügung gestellt, und Schwerbehinderte werden zu Hause besucht; 2) Einbeziehung der Teilnehmer, Personen mit öffentlichen Rollen und Allgemeinmediziner in bildungspolitische Aktivitäten durch die Organisation von regelmäßigen Seminaren (im Zusammenhang mit der Gesundheit des Gehirns, der Gehirnspende und der allgemeinen Gesundheit) und die Planung thematischer Kurse (z. B. der Einsatz von IT-Geräten für ältere Menschen); 3) Begegnung mit Menschen und einen persönlichen Ansatz. All diese Elemente bilden die Stärke des ABB-Projekts. Darüber hinaus verbessert das Projekt die klinischen Fähigkeiten des beteiligten medizinischen Personals, da es Sowohl Erfahrungen in den Amorterstellenbewertungen als auch in den postmortalen neuropathologischen Bewertungen sammeln kann. In diesem Zusammenhang möchten wir die sehr eigenartige Erfahrung der "Altersforschung der Minderheit" erwähnen. An dieser Studie war eine begrenzte und ausgewählte Anzahl von Afroamerikanern beteiligt, die im Raum Chicago wohnten (784 von 1.357 förderungsberechtigten Probanden: Ansprechrate von 57 %). Die Teilnehmer wurden jährlich zu Hause besucht und gebeten, sich dem Hirnspendenprogramm anzuschließen. Diese Studie basiert auf einem ungewöhnlichen Ansatz mit einigen Ähnlichkeiten mit unserem, der hohe Prozentsätze positiver Reaktionen auf das Hirnspendeprogramm erhält (352 Spender von 784 Teilnehmern waren eingeschrieben: 44%), obwohl die Autopsierate nicht ganz zufriedenstellend war (53%)⁷⁴. Wie in "Die Altersforschung der Minderheit" bieten wir pädagogische Aktivitäten und einen empathischen Ansatz an, um hervorragende Ergebnisse zu erzielen. Insbesondere liegt unsere Antwortquote bei 93 %, der Einschreibeprozentsatz bei 28,7 % und die Autopsiequote liegt derzeit bei 67 %. Diese Raten zeigen, dass Projekte, die Menschen direkt ansprechen, einen größeren Prozentsatz an Spenden haben. Andere Gehirn-Spenden-Programme, mit weniger Aufmerksamkeit für den Aufbau einer Beziehung mit potenziellen Spendern, haben in der Regel einen niedrigen Einschreibungsprozentsatz, etwa 10-15% oder weniger^73,75.

Es gibt nur wenige frühere Kohortenstudien, die mit einer neuropathologischen Analyse enden. Darüber hinaus sind die meisten Gehirnbanken und Repositories krankheitszentriert und es gibt eine Knappheit an "Kontroll"-Gehirnen von gesunden Spendern im Vergleich zur Anzahl der "kranken" Gehirne. Nur eine begrenzte Anzahl von BBs basieren auf Bevölkerungsstudien mit erkrankten und normalen Probanden, um Alterungspfade^{73,74,76,77,78,79,80}zu studieren. Einige Studien wie "The minority aging research study" in den USA⁷⁴ und "The Vantaa 85+ study" in Finland⁷⁶ ähneln unseren, aber sie neigen dazu, mit dem Ende der Kohorte zu enden. Stattdessen soll das Spendenprogramm von ABB auch nach dem Ende der Längsstudie InveCe.Ab noch lange andauern, potenzielle Spender gewinnen und Folgemaßnahmen planen. Dieser Ansatz macht unsere Rekrutierungsmethode ähnlich der des "Sun Health Research Institute (SHRI) Brain Donation Program", das sich an eine Rentnergemeinschaft richtet⁷³. Das SHRI-Protokoll zur Hirnspende ist sehr effizient mit dem kürzesten mittleren Postmortem-Intervall der Welt (3,92 Stunden). Ähnlich wie die größten BBs der Welt schneidet das SHRI-Protokoll das Großhirn, das Kleinhirn und den Hirnstamm einfach in der Mittellinie (sagittale Ebene), dann wird die eine Hälfte frisch seziert und für biochemische Studien eingefroren, während die andere für die histopathologische Bewertung formal in formalin fixiert ist. Eine der Stärken des SHRI-Sektionsprotokolls ist jedoch die Fixierung einzelner Slices anstelle der gesamten Hemisphäre. Tatsächlich ist die Fixierung einer Hemisphäre als Ganzes aufgrund der unterschiedlichen Fixationsgradienten zwischen der Oberfläche und dem Kern nicht optimal. Darüber hinaus können die kortikalen Proteine durch eine längere Exposition gegenüber der Formalinlösung beeinflusst werden. Daher der Grund, warum wir beschlossen haben, einzelne Slices zu fixieren.

Die Entscheidung, welche Seite fixiert oder eingefroren ist, hängt von der singulären Bank ab (immer die gleiche, zufällig zugewiesen oder zugewiesen, je nachdem, ob der Tag der Sezierung ungerade oder gerade ist)^{31,32,33,34,35}. So werden biochemische und histopathologische Analysen getrennt auf jeder Hemisphäre durchgeführt. Da viele neurologische Erkrankungen asymmetrisch sind, bietet unser BB ein einzigartiges Protokoll zum Schneiden frischer Proben: Alternative Abschnitte aus dem Hirnstamm und aus jeder Hemisphäre von Kleinhirn und Großhirn werden als festes oder gefrorenes Material aufbewahrt; eine feste Scheibe auf einer Hemisphäre entspricht einer gefrorenen auf der anderen Hemisphäre. Unsere Methode bietet die Möglichkeit, eine vollständige histologische Charakterisierung aller gefrorenen Materialien zu erhalten und die Ergebnisse aus allen Bereichen beider Seiten zu vergleichen. Wie in der Einleitung gesagt, ermöglicht die beschriebene Methode uns, so viele Informationen wie möglich aus dem Gehirngewebe zu erhalten. Darüber hinaus liefert die ABB-Methode eine grundlegende, aber vollständige neuropathologische Charakterisierung, einschließlich fast aller bekannten Hirnproteinopathien und Gefäßpathologie. Aufgrund der umstrittenen Rolle von Gefäßverletzungen bei der Bestimmung kognitiver Beeinträchtigungen haben wir uns für eine doppelte Punktzahl für die Gefäßbelastung^30,53entschieden.

Wie im Protokoll erläutert, verwenden wir einen multidisziplinären Ansatz. Obwohl dies eine zeitaufwändige und mühsame Methode ist, glauben wir, dass sie mehrere Vorteile für die Forschung bietet. Zum Beispiel haben wir in einer früheren Arbeit gezeigt, dass hohe tHcy per se, oder MTHFR C677T TT, die mit dem APOE-4-Allel verbunden ist, mit Exekutivenstörungen und nicht mit Gedächtnisverlust zusammenhängen kann⁸¹. Daher kann es interessant sein, Probanden mit diesem speziellen genetischen Profil auf einer neuropathisologischen Ebene zu bewerten. Dies ist ein Beispiel dafür, wie eine solche gründliche Nachforschung nützlich ist, um neue Forschungshypothesen zu erstellen, die durch die Untersuchung von biologischem Material, das in unserer Bank gesammelt wurde, überprüfbar sind. Ein weiterer Beweis für den Vorteil unseres Ansatzes ist die Einbeziehung von QEEG in die Bewertungen, die wir routinemäßig durchführen, für seine Originalität und die relative Benutzerfreundlichkeit. Tatsächlich erkennt EEG die synaptische Aktivität der Großhirnrinde, indem es die elektrischen Potenziale von Dendriten aufzeichnet, die zu kortikalen pyramidenförmigen Neuronen gehören⁸². QEEG kann als Biomarker für die Schätzung der kortikalen synaptischen Aktivität betrachtet werden, die mit der Kognition⁸³zusammenhängt. Insbesondere eine Abnahme der Alpha-Rhythmen im hinteren Teil des Gehirns mit einer allgemeinen Zunahme der unteren Frequenzen (Theta- und Delta-Rhythmen) wurde mit kortikalen Verbindungsstörungen zusammengebracht. Es sollte berücksichtigt werden, dass die meisten diagnostischen Korrelationsstudien auf einer klinischen Diagnose basieren, die nur eine wahrscheinliche und keine definitive Diagnose^84,85,86,87ist. Nur sehr wenige zielgerichtete Studien haben QEEG-Daten mit dem neuropathologischen Bild verglichen, um die Korrelation zwischen QEEG- und LTS-Varianten^88,89und die Unterscheidung zwischen FTLD und AD⁸³zu untersuchen. Durch das Beenden unserer Studie mit einer Definition der neuropathologischen Diagnose ist es dann möglich, die Beobachtungen zur zerebralen elektrischen Aktivität richtig zu interpretieren. Darüber hinaus können wir durch serielles QEEG in jedem Fach intraindividuelle EEG-Wellenbahn und deren Korrelationen mit dem neuropathologischen Bild verfolgen. Nach individuellen Veränderungen der kortikalen elektrischen Aktivität im Laufe der Zeit kann zu einem besseren Verständnis seiner Bedeutung als Biomarker für beginnende Demenz führen.

Zukünftige Anwendungen und Richtung der Methode
Die Umsetzung der Gewebeverteilung ist eines unserer wichtigsten zukunftshandiven Ziele. Um dies zu tun, haben wir gerade eine wissenschaftliche Kommission mit dem Direktor der GC Foundation (Geriatrie), einem Akademiker der Neurologie von der Universität Pavia, einem Neurologen und einem Pathologen sowohl von der GC Foundation & dem Geriatrischen Krankenhaus ASP Golgi-Redaelli gegründet. Bei der Verteilung von Hirngewebe, histologischen Dias und anderen biologischen Proben ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Spender der Spende um der Forschung willen zugestimmt haben. Die Verteilung von Material sollte daher umsichtig erfolgen, wie im BNE-Verhaltenskodex⁴⁰beschrieben. Jede Partei, die einen Materialantrag stellt, sollte art und quantitativ die benötigte Probe angeben, eine Beschreibung des Forschungsprojekts und die Verwendung der Proben vorlegen und, wann immer möglich, Nachweise für frühere Veröffentlichungen liefern (siehe Abbildung 9). Die Gehirnbank arbeitet nicht für finanziellen Gewinn. Die von den Forschern gezahlten Gebühren sollten also nur die Kosten für die Gewebebeschaffung, -verarbeitung, -lagerung und -verteilung decken.

Pläne, Fälle mit Exome-Sequenzierung und Omics-Techniken wie Proteomik und Transkriptomik zu analysieren, sind in Bewegung. Unsere alternative Probenahmemethodik ermöglicht es, Omics-Studien an histologisch genau definierten Geweben aus beiden Hemisphären durchzuführen. Durch diesen Ansatz wird es möglich sein, das Muster der Genaktivierung in verschiedenen Hirnbereichen der gleichen Hemisphäre und in den entsprechenden Bereichen der anderen Hemisphäre zu vergleichen und die Genaktivierung mit der Histopathologie zu korrelieren. In diesem Bereich wären Deep-Learning-Anwendungen von großem Interesse, einschließlich der computergestützten Analyse histologischer Dias und der spitzen Korrelation klinischer, histologischer und omics-Daten. Andere Korrelationen zwischen vielen verschiedenen Variablen können ebenso identifiziert werden wie andere mögliche technologische Anwendungen. Die Verfügbarkeit von gefrorenem Material aus beiden Hemisphären ermöglicht eine genaue Topographie der Genaktivierung und Proteinverteilung. Dies wird auch bei gesunden Probanden von besonderem Interesse sein, wenn man bedenkt, dass sowohl die Funktionen des Gehirns als auch einige Krankheiten asymmetrisch sind.

Darüber hinaus können wir Zellkulturen von gut charakterisierten Hirnspendern erhalten. Tatsächlich liefern Zellkulturen aus den Leptomeningen von geernteten Gehirnen lebende Zellen, die für die weitere Untersuchung von Krankheits- oder Alterungsmechanismen verwendet werden können, mittels der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)-Technologie, die eine Neuprogrammierung von leptomeningalen Fibroblasten beinhaltet und sie in Denkzellen in fortgeschrittenen Modellen⁹⁰in Nervenzellen differenziert.

Wenn das Gehirn altert, können auf molekularer, zellulärer und Gewebeebene unterschiedliche Veränderungsprofile auftreten. Jedes Gehirn ist einzigartig. Jeder hat seine eigene Art, auf interne und externe Stressoren zu reagieren; einige widerstehen, während andere erliegen und unterschiedliche Pathologien zeigen. Diskrepanzen zwischen der klinischen Darstellung und dem neuropathologischen Bild bestehen oft, weil die Topographie der Läsionen und nicht ihre molekulare Natur die klinische Darstellung bestimmt. Die richtige und eindeutige Diagnose konnte nur erreicht werden, indem das klinische Syndrom mit den neuropatologischen Befunden kombiniert wurde, die oft wichtige ätiologische Hinweise hinzufügen, die notwendig sind, um die Pathogenese der Krankheiten zu entwirren. In Europa wird versucht, einen Standardansatz für die neuropathologische Diagnose zu schaffen. Unser Diagnoseprotokoll folgt fast vollständig den kürzlich veröffentlichten Richtlinien zur neuropathologischen Diagnostik für Das Gehirnbanking⁹¹. Dies wird es uns ermöglichen, gut dokumentiertes Hirngewebe zu sammeln und zu teilen, mit dem prospektiven Ziel, die erste italienische Brain Bank zu gründen. Tatsächlich gibt es in Italien Gehirn-Repositorys, aber keine Gehirnbanken, die auf Kohortenstudien basieren. Unser Ziel ist es, eine Methode für die Hirngewebeentnahme zu entwickeln, die in ganz Italien breit umgesetzt werden kann, um ein Netzwerk aufzubauen, das ein gemeinsames Protokoll verwendet und vergleichbares Material teilt. Dazu gehören die Einbeziehung anderer Forschungszentren und die Einrichtung einer speziellen Website zu den Hauptzielen für die Zukunft.

Innovative Technologien werden ständig zur Analyse der molekularen Natur neurodegenerativer Erkrankungen und zur Biomarker-Identifikation eingesetzt. In diesem Zusammenhang wird es einen zunehmenden Bedarf an Gehirnen geben, begleitet von Informationen über kognitive und Alternsbahnen, die durch Längsschnittstudien gewonnen werden, wobei die Bedeutung eines neuropathologisch verifizierten epidemiologischen Ansatzes betont wird⁹².

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Electrical saw with 5d blade	CEA	06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm	CEA	70064.250 HHH
Electrode pH needle	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Bovine Serum	Carlo Erba	FA30WS1810500	medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical	Uvex	500XG
Gloves	CEA	01.28.14
Glue	Arcobaleno	2624000800002
Head supporter	Lacor	60456
L-Glutamine (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape	CEABIS	CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide	UHU Bostik	8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140050	medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Surgical mallet and surgical cisel	CEA	79.68.88
Surgical scissor	CEA	27.08.45/79.68.64
	Feather	M130RC