Abbiategrasso Brain Bank Protocol per la raccolta, l'elaborazione e la caratterizzazione dei cervelli di invecchiamento

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per monitorare le singole traiettorie di invecchiamento cerebrale attraverso un programma di donazione di cervello e la corretta caratterizzazione del cervello. I donatori di cervello sono coinvolti in uno studio longitudinale a lungo termine che include valutazioni multidimensionali seriali. Il protocollo contiene una descrizione dettagliata dell'elaborazione del cervello e una metodologia diagnostica accurata.

Abstract

In una popolazione in costante invecchiamento, la prevalenza di disturbi neurodegenerativi è previsto per aumentare. Comprendere i meccanismi della malattia è la chiave per trovare misure preventive e curative. Il modo più efficace per raggiungere questo obiettivo è attraverso l'esame diretto del tessuto cerebrale magro e sano. Gli autori presentano un protocollo per ottenere, elaborare, caratterizzare e memorizzare tessuto cerebrale di buona qualità donato da individui registrati in un programma di donazione del cervello antemortem. Il programma di donazione include un approccio empatico faccia a faccia verso le persone, una raccolta di informazioni cliniche, biologiche, sociali e di stile di vita complementari e valutazioni multidimensionali seriali nel tempo per monitorare le singole traiettorie del normale invecchiamento e del declino cognitivo. Poiché molte malattie neurologiche sono asimmetriche, la nostra banca del cervello offre un protocollo unico per affettare campioni freschi. Le sezioni cerebrali di entrambi gli emisferi sono alternativamente congelate (a -80 gradi centigradi) o fissate in formalina; una fetta fissa su un emisfero corrisponde a una congelata sull'altro emisfero. Con questo approccio, è possibile ottenere una caratterizzazione istologica completa di tutto il materiale congelato e gli studi omici possono essere eseguiti su tessuti istologicamente ben definiti da entrambi gli emisferi offrendo così una valutazione più completa dei meccanismi della malattia neurodegenerativa. Una diagnosi corretta e precisa di queste malattie può essere ottenuta solo combinando la sindrome clinica con la valutazione neuropatologica, che spesso aggiunge importanti indizi eziologici necessari per interpretare la patogenesi. Questo metodo può richiedere tempo, costoso e limitato in quanto copre solo un'area geografica limitata. Indipendentemente dai suoi limiti, l'alto grado di caratterizzazione che fornisce può essere gratificante. Il nostro obiettivo finale è quello di istituire la prima Banca Italiana del Cervello, sottolineando nel contempo l'importanza degli studi epidemiologici neuropatologicalmente verificati.

Introduzione

Secondo l'OMS, circa 50 milioni di persone soffrono attualmente di demenza, una cifra che si prevede triplicherà entro il 2050. Il morbo di Alzheimer è la principale causa di demenza, seguita da malattia cerebrovascolare e altri disturbi neurodegenerativi legati all'età. Nel 2017, l'OMS ha sviluppato l'Osservatorio globale sulla demenza per aumentare la consapevolezza della demenza e incoraggiare un piano d'azione globale contro di^{essa 1}. Ogni individuo ha la propria traiettoria di invecchiamento cerebrale, quindi la ricerca della cura può essere difficile a causa della complessità della patogenesi delle malattie neurodegenerative. Forse, ogni persona possiede la propria patogenesi scritta nel tessuto cerebrale che richiede un approccio personalizzato. Così, lo studio del tessuto cerebrale sarà la chiave per comprendere i meccanismi della neurodegenerazione.

Ripensando alla storia delle neuroscienze, ci rendiamo conto che le scoperte più impressionanti e rivoluzionarie non avrebbero mai potuto essere verificate senza l'esame diretto del cervello umano. Nel corso del tempo, la fonte di tessuto cerebrale da studiare è cambiata da dissezioni grezze, "incontri casuali" e, in alcuni casi, commercio illegale, a raccolte di cervelli organizzate e banche strategiche del cervello moderno. La considerazione di molti aspetti etici è uno dei principali fattori che differenziano le banche del cervello moderno dalle collezioni cerebrali del passato. Le prime vere e moderne Brain Banks (BB) sono state istituite nella seconda metà del^XX secolo. Nicholas Corsellis e Wallace Tourtelotte possono essere considerati pionieri del moderno brain banking. Nel Regno Unito, Corsellis ha assemblato una collezione che contiene oltre 1000 cervelli ben documentati affetti da vari disturbi mentali e neurologici². Inoltre, Corsellis ha contribuito a rivelare la necessità di preservare il tessuto cerebrale fresco nel ghiaccio per il bene dei test biochimici³. Nel frattempo negli Stati Uniti, Wallace Tourtelotte ha introdotto programmi di donazione cerebrale antemortem per facilitare la sollecitazione di potenziali donatori di cervello e garantire che i cervelli raccolti siano accompagnati da una storia medica e neurologica^{completa 4,5}. Per una panoramica storica delle collezioni di cervelli e dei BC moderni, vedere Carlos et al. ⁶.

Allora, perché abbiamo ancora bisogno di cervelli umani? Le malattie cerebrali possono essere date solo una diagnosi definitiva dopo l'esame neuropatologico. La neuropatologia sfida la diagnosi clinica ed è la chiave per una corretta interpretazione dei sintomi clinici e per la scoperta delle basi istologiche di nuove varianti sidromiche. Infatti, la diagnosi può essere ridefinita in base al quadro patologico. Ciò nonostante, il tasso di autopsia è diminuito negli ultimi decenni a causa del recente sviluppo di tecniche di neuroimaging innovative. Attraverso l'imaging cerebrale, le alterazioni morfologiche, funzionali e metaboliche nel cervello, così come l'entità del misfolding delle proteine, possono essere valutate in vivo. Tuttavia, il neuroimaging in vivo e altri studi sui biomarcatori possono solo dare una "stima" del quadro patologico in quanto non sono in grado di rilevare sottili cambiamenti cellulari e molecolari. I progressi nell'imaging molecolare e nella scoperta di nuovi biomarcatori, molecole bersaglio e traccianti⁷ (ad esempio, amiloidi, TAU, traccianti microgliali) rendono il cervello umano ancora più indispensabile per l'interpretazione dei dati ottenuti dalle valutazioni cliniche e dai test sui biomarcatori. Inoltre, le tecnologie omiche (genomica, epigenomica, trascrittiomica, metabolomica, proteomica, lipidomica, ecc.), eseguita su tessuto cerebrale fresco e congelato, ha aperto nuove possibilità per comprendere i meccanismi della malattia e scoprire i geni a rischio, nuovi marcatori diagnostici e prognostici, e potenziali bersagli farmacologici^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}.

Per questi scopi, i moderni BB archiviano tessuti cerebrali ben caratterizzati e di alta qualità rendendoli disponibili per la comunità scientifica^3,24. I cervelli forniti dai BB devono essere accompagnati da una storia clinica completa. L'attività di un BB comprende quanto segue: (1) Riconoscimento e reclutamento di individui mati e sani a programmi di donazione di cervelli; la condizione ideale sarebbe raggiungere un follow-up multidisciplinare dei donatori per tutta la vita per ottenere una storia clinica, di stile di vita e sociale completa e profili di biomarcatori; infatti, riserva cognitiva e struttura del cervello dipendono da stile di vita e fattori socio-educativi^25,26, quindi queste informazioni arricchiscono i dati totali a portata di mano. (2) Acquisizione del cervello (costituito da cerebrum, cervelletto e stelo cerebrale) e tessuti correlati (ad esempio, midollo spinale, nervi cranici e gangli, ecc.) in seguito alla scomparsa del donatore, osservando nel contempo norme legali ed etiche standardizzate. (3) Elaborazione appropriata (dissezione, fissazione, congelamento) del cervello, come definito in un protocollo operativo standardizzato, per ottenere tessuto di alta qualità e consentire un uso futuro nella ricerca multidisciplinare. (4) Caratterizzazione neuropatologica dettagliata che fornisce una diagnosi definitiva. (5) Stoccaggio e distribuzione di materiale tissu/tessuto alla comunità^{di ricerca 27,28}.

Tutti i BB immagazzinano tessuti incorporati congelati e formalin-fixed-paraffin. Ogni BB ha un proprio protocollo. Fatta eccezione per studi particolari, come il protocollo di taglio bihemisferico del Biomedical Research Institute (New Jersey)²⁹ e lo studio del Deramecourt sulla patologia cerebrovascolare³⁰, i più grandi BB del mondo semplicemente tagliare il cervello, cervelletto e tronco encefalico lungo la linea mediana (piano sagittale). Una metà viene sezionata fresca e poi congelata per studi biochimici, mentre l'altra è fissata in formalina per la valutazione itopatologica. Quindi, le analisi biochimiche e ipatologiche vengono condotte separatamente su ogni emisfero. La decisione su quale lato è fisso o congelato (lateralità), dipende dalla singolare banca^{31,32,33,34,35}. Poiché molte malattie neurologiche sono asimmetriche, il nostro BB offre un protocollo unico per affettare cervelli freschi: sezioni adiacenti del tronco encefalico e ogni emisfero sono alternativamente fisse e congelate; una fetta fissa su un emisfero corrisponde a una congelata sull'altro emisfero. Attraverso questo metodo, l'uso del tessuto cerebrale è ottimizzato, e una caratterizzazione istologica completa di tutto il materiale congelato può essere raggiunta con la possibilità di ottenere e confrontare informazioni istologiche e biochimiche da tutte le aree di entrambi gli emisferi.

La cornice del nostro progetto di banca del cervello è la città di Abbiategrasso. Abbiategrasso è una piccola città a circa 22 km a sud-ovest della città di Milano, nel nord Italia. Ha una popolazione di circa 32.600 persone. Ospita la Fondazione Golgi-Cenci (GC). La Fondazione GC fa parte di un grande Ospedale Geriatrico di Riabilitazione (ASP Golgi-Redaelli), ed è un istituto che si concentra sulla ricerca sull'invecchiamento e la cura degli anziani. In particolare, si concentra sullo studio dell'invecchiamento mentale, dei fattori sociali e comportamentali che lo influenzano e della biologia e della patologia alla base dei disturbi neurocognitivi dipendenti dall'età (NCD). Nel 2009, la Fondazione GC ha lanciato un nuovo studio longitudinale con 1321 partecipanti (su 1644 soggetti ammissibili: tasso di risposta iniziale dell'80,3%) nato tra il 1935 e il 1939 (di età compresa tra i 70 e i 75 anni), di etnia caucasica, che vive nella stessa piccola area geografica. Lo studio si chiamava InveCe.Ab (Invecchia cchiamento Cerebrale Abbiategrasso; in inglese: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) ed è attualmente in corso. InveCe.Ab è prevista per ottenere una coorte con massima omogeneità e meno variabilità al fine di valutare l'incidenza, la prevalenza e la storia naturale della demenza, insieme ai suoi possibili fattori di rischio o protettivi, tra cui variabili comportamentali, psicosociali, cliniche e biologiche³⁶. Le caratteristiche della coorte sono illustrate nelle figure 1 e nella tabella 1. I dati epidemiologici sono coerenti con la tendenza della demenza nella popolazione europea^37,,38 e invece.Ab partecipanti hanno caratteristiche genetiche e ambientali omogenee, che rappresentano un buon modello per studiare la traiettoria dal normale invecchiamento ai disturbi neurocognitivi. Infatti, le popolazioni omogenee richiedono meno soggetti per raggiungere un adeguato potere statistico. La metodologia InveCe.Ab è già stata riportata^{altrove 36, ma} è importante sottolineare il suo approccio multidimensionale attraverso controlli periodici (ogni 2-3 anni) utilizzando lo stesso insieme di valutazioni tra cui: campionamento del sangue (pannello metabolico, omocisteina e vitamine, estrazione del DNA per profilo Apolipoproteina E (APOE) e altri polimorfismi genetici legati alla cognizione e all'invecchiamento), misurazioni antropometriche (peso, altezza e vita), Talking While Walking Test (dual task test), un'intervista per valutare lo stile di vita (aderenza alla dieta mediterranea, livelli di attività fisica e impegno cognitivo) e fattori sociali (coinvolgimento sociale, solitudine), un esame clinico Confrontare tali dati longitudinali con i dati neuropatologici postmortem sarebbe fondamentale per la ricerca. Pertanto, il nostro team e in particolare la dott.ssa Michela Mangieri hanno concepito l'approccio neuropatologico di cui sopra. Dal 2014 e durante il secondo follow-up, ai partecipanti inVeCe.Ab è stato chiesto di donare il loro cervello, portando così alla nascita della Abbiategrasso Brain Bank (ABB). I principali donatori di ABB sono i partecipanti InveCe.Ab, ma ABB è ora aperta ad altri donatori volontari. Sono pazienti di ASP Golgi-Redaelli, che ospitano diversi pazienti affetti da diverse malattie neurologiche o volontari adulti che imparano a conoscere il Progetto ABB e appartengono alla stessa area geografica (Abbiategrasso e dintorni). Tutti i donatori sono sottoposti allo stesso protocollo di valutazione.

Gli autori propongono un metodo per tracciare le singole traiettorie del normale invecchiamento e la possibile progressione verso gli NCD, e per gestire, elaborare e caratterizzare con precisione i cervelli acquisiti da tali donatori seguiti longitudinalmente. Inoltre, il nostro obiettivo è quello di incontrare e coinvolgere gli individui in valutazioni neurologiche periodiche, seminari e attività educative per quanto riguarda il benessere del cervello e per aumentare la loro consapevolezza della donazione di cervello per scopi di ricerca.

Protocollo

In linea con il Comitato Etico della Ricerca Umana della nostra istituzione e il Codice di Condotta BNE, l'ABB svolge le sue attività seguendo gli standard^{etici 39,40}. La procedura di raccolta del cervello è stata sottoposta e approvata dal Comitato Etico dell'Università di Pavia nell'ambito dello studio InveCe.Ab³⁶. Le procedure di studio erano conformi ai principi delineati nella dichiarazione di Helsinki del 1964 e ai seguenti emendamenti. Il modulo di consenso è completo e facilmente comprensibile. Partecipare al programma di donazione è una decisione personale ed è necessaria una completa consapevolezza. Nel caso in cui una persona non sia ritenuta competente a firmare il modulo di consenso, è giustificata l'autorizzazione del tutore legale o dei parenti (NOK). La Tabella 2 riporta i criteri di inclusione ed esclusione per la donazione di cervelli. La ricerca è stata condotta sotto la supervisione della Federazione Alzheimer Italia.

1. Reclutamento nel programma di donazione del cervello

1. Convocare i soggetti che avevano espresso interesse per la donazione di cervelli e il loro NOK e/o tutore legale per presentare il progetto (l'ambito del programma di donazione; il processo di rimozione del cervello, conservazione, uso e distribuzione), il diritto di ritirarsi dal programma in qualsiasi momento, la protezione dell'anonimato e le strategie di follow-up. Discutere la possibilità di ulteriori indagini sui biomarcatori e test genetici. Si noti i desideri del potenziale donatore o del suo NOK di essere informati sui risultati.
2. Spiegare tutti gli aspetti economici, tra cui la mancanza di guadagno finanziario sia per la Fondazione che per il donatore (i cervelli sono donati e distribuiti altruisticamente). Informali che ABB copre i costi del trasporto del corpo, mentre la famiglia copre quelli del funerale, della sepoltura o della cremazione.
3. In caso di accettazione, ottenere la firma del consenso a partecipare al programma di donazione. Fornire al donatore un codice numerico individuale per garantire l'anonimato. Annotare il numero di identificazione dei partecipanti allo studio longitudinale e fornire un altro codice per la banca del cervello per separare facilmente i due sottogruppi di donatori (partecipanti o non partecipanti allo studio longitudinale; vedi tabella 3).
4. Dare al donatore una carta d'identità che dichiara il suo status di donatore e visualizza il numero di telefono (disponibile 24/7) per notificare la morte della Banca del cervello.

2. Valutazione del donatore e follow-up seriali

NOTA: È possibile dare il consenso solo per alcuni, e non tutti, dei seguenti esami menzionati. Tutte le valutazioni cliniche sono eseguite dallo stesso team, tra cui un neurologo, un geriatra con esperienza in neurologia e 3 psicologi. Se si sviluppano nuovi sintomi o il declino cognitivo progredisce, l'intervallo di tempo tra i follow-up può essere accorciato.

1. Come nel caso dello studio InveCe.Ab, ottenere un questionario lifestyle-sociale, compreso il grado di autonomia (ADL, IADL), abitudini personali, fattori sociali e di stile di vita che possono influenzare le funzioni mentali. Raccogliere la storia familiare, medica e neurologica con informazioni riguardanti le malattie genetiche, infettive, tossiche, metaboliche, autoimmuni, cardiovascolari, traumatiche, degenerative, neoplastiche e neurologiche. Raccogliere gli esami clinici precedenti ed elencare i trattamenti farmacologici.
2. Eseguire un'ampia valutazione neuro-motoria tra cui test per la funzione dei nervi cranici, fundus oculi, campo visivo, forza muscolare e tono, sensibilità, riflessi tendinei, riflessi eterocettivi e primitivi, segni meningeali, postura, andatura, movimenti, coordinazione, funzioni sfiniche e qualsiasi presenza di segni o Babinski. Valutare il linguaggio, lo stato mentale e qualsiasi cambiamento nel comportamento.
3. Eseguire una vasta valutazione neuro-cognitiva tra cui cognizione globale e una valutazione neuropsicologica completa di specifici domini cognitivi: memoria verbale e visiva, attenzione, velocità psicomotoria, linguaggio, memoria semantica, funzioni esecutive, e capacità visuospatiali(Tabella 4 per i dettagli). Considerare la presenza di depressione (scala CES-D).
4. Ottenere il campione di sangue che viene utilizzato sia per l'analisi chimica del sangue (tabella 5) che per l'isolamento e lo stoccaggio di DNA, plasma e cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Determinare la genotipazione APOE (rs429358 e rs7412) (una profilazione genetica più estesa è stata determinata nei partecipanti InveCe.Ab; vedi Tabella 6). Registrare un ECG (alterazioni cardiache, fibrillazione atriale) e uno stato di riposo Elettroencefalogramma per l'analisi quantitativa (QEEG).
5. Prendere in considerazione test di biomarcatori opzionali tra cui liquido cerebrospinale (CSF) TAU, fosfo-TAU e β-amiloide, e imaging cerebrale (RMI per rilevare degenerazione in vivo, ischemia o infiammazione; FDG-PET per rilevare l'insufficienza metabolica; PIB-PET per rilevare l'amiloidosi cerebrale legata alla fisiopatologia dell'Alzheimer).
6. Pianifica il successivo programma di check-up del donatore cerebrale. Impostare gli intervalli di tempo in base alle diverse fasce di età (fino a 64 anni: ogni 10 anni, 65-74 anni: ogni 3 anni, da 75 anni in poi: ogni 2 anni).
7. Assegnare una diagnosi clinica e/o una diagnosi neurocognitiva secondo DSM-V. Classificare la messa in scena della demenza clinica con il punteggio di Clinical Dementia Rating (CDR). Aggiornare la registrazione per registrazione a disco nell'ultimo periodo precedente la morte.
8. Preparare un database graficamente simile a quello cartaceo. Inserire tutti i dati raccolti nel database Brain Bank. Pianificare una revisione da parte di un altro impiegato per verificare la presenza di eventuali errori.

3. Ora della morte e rimozione del cervello

NOTA: La legge italiana stabilisce che l'asystole deve durare più di 20 minuti per confermare la morte. La registrazione di un elettrocardiogramma piatto (ECG) per almeno 20 min (denominato thanatografia) consente di eseguire l'autopsia entro 24 h dalla morte (DPR 285/90 art. 8 e Legge n. 578 dic 29, 1993). Un tempo postmortem di <24 h& è un buon obiettivo per preservare la qualità complessiva del tessuto. In caso di tempo post-mortem >30 h l'autopsia viene annullata (c'è la tabella 2). L'unità di autopsia è composta da un patologo, un neurologo e/o un neurobiologo, un infermiere, un tecnico di sala anatomica e qualsiasi studenti tirocinanti; i primi due membri del team eseguono anche la diagnosi neuropatologica. Durante la manipolazione e la dissezione dei cadaveri, l'uso di indumenti appropriati (cappotto, guanti, occhiali e rete per capelli) è obbligatorio. In questa sezione, descriviamo i principali strumenti e attrezzature normalmente utilizzati nel nostro laboratorio. I lettori possono scegliere gli strumenti da utilizzare a loro discrezione. Per una descrizione dettagliata dei materiali utilizzati, consultare la Tabella dei Materiali.

1. Assicurarsi che l'agenzia funebre scelta dalla famiglia porti il corpo nelle strutture ABB. Eseguire l'attività di analisi durante la quale l'attività cardiaca deve essere assente. In tal caso, firma un certificato di morte e inizia le procedure di autopsia.
2. Trasporta il cadavere nella sala autopsia. Misurare la circonferenza del cranio a livello della parte più larga della testa. Misurare dal nasion all'ione per ottenere il diametro anteroposterior (APD), mentre la distanza da un orecchio all'altro produce il diametro trasversale (TD). Calcolare l'indice cefalico (CI) utilizzando la formula: CI : TD/APD x 100.
3. Utilizzando un bisturi affilato, fare un'incisione del cuoio capelluto sul piano coronale, dalla punta del processo mastoide da un lato all'altro, passando sopra il vertice. Tagliare i capelli, la pelle e il tessuto sottocutaneo e separare attentamente le due pieghe del cuoio capelluto dal cranio sottostante. Eseguire l'incisione fino a quando il grasso sopraorbitale giallo diventa visibile e riflettere il cuoio capelluto anteriormente. Tirare l'altra parte posteriore.
4. Utilizzando bisturi e forceppa, prendere un piccolo campione del muscolo temporale su ogni lato, mettere uno in 4% formaldeide e congelare l'altro (vedi sezione 7).
5. Tagliare il cranio con una sega elettrica dopo un taglio a V sul lato frontale. Togliere la calotta cranica e tagliare le meningi. I pezzi campione di dura sono entrambi fissati in formaldeide 4% e congelati (c'è la sezione 7).
6. Ottenere circa 10 mL di CSF inserendo un ago 20 G 3.5 in. attraverso il corpo calloso per raggiungere il terzo ventricolo. Valutare l'aspetto, il colore e la torbidità del CSF e misurare il pH. Quindi, fare 10 aliquots di circa 1 mL ciascuno e conservarli a -80 gradi centigradi.
7. Sollevare delicatamente il cervello tirando delicatamente su entrambi i lobi frontali e tagliare entrambi i nervi ottici infundibulum, le arterie carotide interne (ICA) e il terzo, quarto, quinto e sesto nervo cranico. Tagliare il tentorium per raggiungere la fossa posteriore e tagliare le arterie vertebrali e abbassare i nervi cranici. Inserire il bisturi il più in profondità possibile attraverso il foramen magnum, per tagliare la porzione più caudale della medulla. A questo punto, rimuovere l'intero cervello delicatamente.
8. Con il bisturi, perforare l'osso sopra la grotta di Meckel e ottenere il ganglio Gasserian da entrambi i lati. Fissare un ganglio in formaldeide del 4% e congelare l'altro (vedi sezione 7). Fratturare la turcica di sella ossea utilizzando un martello chirurgico e uno scalpello per rimuovere la ghiandola pituitaria e poi fissarla in 4% di formaldeide.
9. Ispezionare il cranio e l'intero cervello per le alterazioni macroscopiche e cambiamenti vascolari. Con un metro a nastro, misurare il cervello ottenendo i diametri trasversale e anteroposterior. Recuperare con cura il cerchio di Willis e valutarlo macroscopicamente (Figura 2E) per la presenza di varianti anatomiche, lesioni o stenosi del vaso.
10. Prendi 1-2 pezzi di leptomeninges di 2-4 cm² dalla convessità e conservali in un mezzo di coltura di Dulbecco (DMEM) completamente ad alto glucosio a 4 gradi centigradi contenente il 20% di siero bovino fetale (FBS), 1% penna/strep, 1% glutammina e 1% aminoacidi non essenziali (come precedentemente pubblicato, con alcune modifiche)⁴¹.
    1. Al fine di ottenere le colture fibroblas, mettere le leptomeninges su un piatto Petri di 10 cm e lavare due volte con salina tampone di fosfato (PBS), ogni volta scartando il liquido.
    2. Utilizzando un bisturi e una punta di pipetta, tagliare le leptomeninges in piccoli pezzi di circa 2 o 3 mm, semi 3-4 pezzi in ogni pozzo di una piastra 6-well precedentemente rivestita con gelatina allo 0,5% e riempire ogni pozzo con 2 mL di mezzo completo integrato con 1% di amphotericin B (condurre l'elaborazione in un armadio di biosicurezza per garantire la sterilità della coltura).
    3. Mettere la piastra in un'incubatrice da 37 gradi centigradi, 5% CO₂ per almeno una settimana e cambiare media spesa ogni 3-4 giorni. Provare le cellule con metapsina sterile 1x quando il pozzo è a circa il 70% della confluenza. Mettere i fibroblasti leptomeningeali in una fiaschetta T75 e riempirla con 12 mL di mezzo completo. Dopo 5 giorni provare e conservarli in 900 L di FBS e 100 l di solfoce di dimetile (DMSO).
11. Separare e ispezionare il cervello, il cervelletto e il tronco encefalico e pesarli singolarmente. Togliere la ghiandola pineale e fissarla in 4% formaldeide. Rimuovere le lampadine olfattive e i nervi ottici e fissare o congelare una di ogni coppia, indipendentemente dal lato. Mantenere il cervello, il cervelletto e il tronco encefalico nel ghiaccio a 4 gradi centigradi per almeno 2-4 h fino a quando non sono pronti per la dissezione per ridurre al minimo l'interruzione dei tessuti e ridurre la morbidezza dei tessuti.
12. Dopo la raccolta, prestare l'attenzione appropriata e la cura al cadavere. Riattaccare l'osso utilizzando una colla super adesivo e cucire indietro il cuoio capelluto utilizzando un ago chirurgico e suture non assorbibili.
13. Mostrare rispetto e gratitudine alla persona deceduta trattando delicatamente il cadavere. Pulire e radere il viso, e lavare e asciugare i capelli, perché il cadavere sarà messo in una bara aperta visibile ai propri cari.
    NOTA: La ricomposizione del cadavere viene eseguita da un tecnico. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Protocollo di dissezione ABB

NOTA: Lo stesso patologo e/o neurologo tagliano il tronco encefalico, il cervelletto e il cerebrum sotto un cappuccio di fumi. Un neurobiologo dispone le fette dopo il sezionamento. Un tirocinante che non gestisce sezioni cerebrali documenta l'intera procedura con foto da caricare nella banca dati per servire come guida durante le successive fasi di lavorazione del tessuto.

1. Utilizzando un coltello da taglio, tagliare il tronco encefalico assia e fare il primo taglio a livello di midbrain rostrale, attraverso il collicolo superiore, per ottenere due fette esponendo il sostanziale nigra (SN).
2. Fare il resto dei tagli per acquisire 8 mm fette di tronco encefalico per ottenere circa 10 sezioni. Fare attenzione a includere i tagli che passano attraverso i pons rostrali vicino ai margini superiori del quarto ventricolo per osservare il locus coeruleus (LC) e attraverso la medulla oblongata inferiore alle striature acustiche appena sopra l'apice inferiore del quarto ventricolo per avere fette tra cui il nucleo motorio dorsale del vago (DMNV).
3. Denominare tutte le sezioni in senso rostrocaudale come BS (cervello) seguito da numeri arabi per identificare le sezioni. Dopo l'ultima sezione del tronco encefalico, utilizzare la designazione SC (midollo spinale) seguita dai numeri 1–n. Si ottengono circa 2–4 fette sc a seconda del numero di metameri spinali rimossi(Figura 2H–I).
4. Etichettare tutte le sezioni da sistemare o da concilente alternativamente e scattare una foto per l'archivio fotografico (Figura 2). Quindi, fissare e congelare tutte le sezioni come descritto di seguito (passaggi 4.7 e 4.8).
5. Tagliare il cervelletto sul piano sagittale per separare i due emisferi cerebellari a livello dei vermi. Eseguire la sezione sagittale per ottenere 5 sezioni da ogni emisfero (Figura 2F–G).
6. Denominare tutte le sezioni da vermis come CBR o CBL (rispettivamente per cervelletto destro e sinistro) e utilizzare i numeri arabi per identificare le sezioni. Etichettare tutte le sezioni da fissato o congelato alternativamente e scattare una foto per l'archivio (Figura 2). Quindi, fissare e congelare tutte le sezioni come descritto di seguito.
7. Separare i due emisferi del cervello attraverso il corpo calloso ( Figura2A–B) e tagliarli singolarmente sul piano coronale. Fare il primo taglio in un piano che passa tra il chiasmo ottico e i corpi mammillary, attraverso lobo frontale, palo temporale, cingulato anteriore, commissure anteriore, nucleo di Meynert e gangli basali.
8. Eseguire il secondo taglio di circa 1 cm posteriorly passando attraverso i corpi mammillary ed esponendo i gangli basali, talamo anteriore, subtalamo e amigdala. Continuare a tagliare per sezionare le regioni anteriore e posteriore per acquisire fette di 1 cm al fine di ottenere da 15 a 20 sezioni per ogni emisfero.
9. Impostare le sezioni su una superficie piana. Disporre la loro posizione originale nella direzione anteropostorerere, dal frontale al polo occipitale, con la porzione continua con la fetta precedente rivolta verso l'alto.
10. Confrontando le sezioni di entrambi gli emisferi, selezionare sezioni alternative di ogni emisfero da mantenere come materiale fisso o congelato. Riconoscere le sezioni principali da sistemare ed elaborare per l'istopatologia compresi i lobi frontali e temporali, cingulate, gangli basali, nucleo basalis di Meynert, amigdala, talamo, ippocampo e corteccia entorinale, giro occipito-temporale, lobi parietale e occipitale.
11. Assegnare a tutte le sezioni il nome L (a sinistra) o R (a destra) seguito da numeri arabi e inserire un'etichetta che indichi se la sezione deve essere fissata o congelata (Figura 2A–D). Per identificare le sezioni, scattare una foto per l'archivio foto. Quindi, fissare e congelare tutte le sezioni come descritto nelle sezioni 7 e 8.

5. Ispezione del cervello e dei vasi e valutazione patologica macroscopica (ad occhio nudo)

1. Eseguire un esame macroscopico generale considerando alterazioni meningeali, atrofia corticale diffusa o localizzata, atrofia ippocampale, allargamento ventricolare, atrofia cerebellare, atrofia del tronco encefalico, sostanziale nigra pallor, alterazioni della materia bianca (specificare il tipo e la posizione).
2. Esaminare il cerchio di Willis considerando l'aterosclerosi e l'occlusione. Assegnare il punteggio 1 in presenza di un ateroma senza stenosi superiore al 50%, punteggio 2 se almeno un'arteria è 50% o più occluso, punteggio 3 se due o più arterie sono 50% o più occlusi⁴². Valutare la presenza o l'assenza di patologia in altri vasi intratrattali.
3. Per rilevare lesioni vascolari parenchimal, esaminare gli emisferi cerebrali, il cervelletto e il tronco encefalico. Si consideri le lesioni lacuna (diametro < 10 mm), infarti ischemici o emorragici ed emorragie (diametro > 10 mm). Se presente, specificare le dimensioni in millimetri, numero e posizione. Inoltre, considerare la presenza o l'assenza di emorragia subaranoide.

6. Controllo della qualità dei tessuti

NOTA: Il punteggio del fattore agonale (AFS) varia tra 0 e 2 ed è importante nella valutazione della qualità dei tessuti. Per determinare l'AFS, considerare le condizioni cliniche che si verificano intorno al momento della morte (in particolare le condizioni che determinano l'acidosi cerebrale) e la durata dello stato agonale (morte improvvisa o agonia prolungata). Se AFS > 1, il tessuto cerebrale potrebbe non essere di qualità ottimale⁴³. Considerare anche cervello e CSF pH; se pH < 6, il tessuto cerebrale potrebbe non essere di qualità^{ottimale 43,44}.

1. Verificare se la morte è stata causata da condizioni che possono danneggiare il tessuto cerebrale tra cui ipossia, acidosi prolungata, ventilazione meccanica, insufficienza multiorgano, febbre alta, grave trauma cranico, ingestione di sostanze neurotossiche, grave disidratazione, grave ipoglicemia, stato epilettico e coma prolungato. Se è presente una di queste condizioni, assegnare 1 punto.
2. Verificare la durata dello stato agonale(rapido se la morte si verifica entro 1 h, intermedio se la morte si verifica tra 1 e 24 h, lento se lo stato agonale dura più di 1 giorno). Se si verifica una morte intermedia o lenta, assegnare 1 punto.
3. Calcolare il punteggio AFS e misurare il pH CSF da un ago di pH di elettrodo e pH del tessuto da un misuratore di pH superficiale su una fetta di cervello da ogni lobo e su una sezione cerebellare.

7. Congelamento dei tessuti

1. Mantenere tutti i tessuti congelati nel ghiaccio a 4 gradi centigradi. Quindi, congelarli rapidamente. Metterli su un vassoio in alluminio prefrozen. Coprire con una piastra di alluminio interbloccante per tenerli piatti. Metteteli in azoto liquido a -120 gradi centigradi per 3 minuti.
2. Posizionare le fette all'interno di un sacchetto di plastica etichettato con il corrispondente codice di identificazione e il numero di fetta. Dividere i sacchetti di plastica in tre scatole criogeniche (per l'emisfero destro, l'emisfero sinistro e il tronco encefalico) e conservarli a -80 gradi centigradi.

8. Fissazione dei tessuti

1. Avvolgere le fette in garza una per una e mettere le fette in una soluzione di formalina tamponata al 10% di fosfati. Dopo 1 giorno, sostituire la soluzione formalina con una soluzione fresca. Lasciarli per circa 5 giorni in una stanza fredda a 4 gradi centigradi.
2. Mantenere tutte le fette nel loro complesso e dividere solo le fette contenenti ippocampo e l'amigdala in due parti (Figura 3). La parte superiore di entrambe le sezioni conterrà il lobo frontale (R10a–L9a nella Figura 3); le parti inferiori conterranno rispettivamente: (1) amigdala, lobo temporale e gangli basali (L9b nella figura 3B) e (2) ippocampo e parte del lobo temporale (R10b nella Figura 3A). Ciò è fatto al fine di mantenere il rapporto tra le varie strutture.
3. Mettere tutte le sezioni nel tampone di fosfati per almeno 2 giorni per lavare e rimuovere i prodotti di collegamento incrociato.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

9. Disidratazione, compensazione, incorporamento di paraffina e preparazione del scivolo

1. Preparare concentrazioni crescenti di alcol etilo dal 70% al 100%, xylene e due serie di cera di paraffina fusa. Posizionare le sezioni cerebrali nel processore automatico per la disidratazione, la procedura di compensazione e l'infiltrazione di paraffina (utilizzare due diversi protocolli di elaborazione del tessuto per macro (fette di cerebrum e cervelletto) e micro campioni (fette di tronco e gli altri piccoli campioni); Tabella 7). Incorporare il tessuto in cera di paraffina su uno stampo metallico o di plastica.
2. Selezionare le sezioni da tagliare per valutare tutte le regioni di interesse applicando l'indice di Montine per la caratterizzazione neuropatologica⁴⁵ (Tabella 8). Quindi, tagliare le sezioni selezionate.
3. Utilizzare un microtome slitta per le macrosezioni e un microtome rotante per piccole sezioni. Tagliare 5 fette di zm per la colorazione Diematossilina ed Eosin (H&E) e 8 fette di m per le altre colorazione e immunohistochimica. Mettere le fette su tre diversi tipi di vetrini statologici: 8,5 cm x 11 cm per le fette più grandi, 5 cm x 7,5 cm per fette medie e i classici 2,5 cm x 7,5 cm per i più piccoli.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

10. Deparaffinizzazione, colorazione istologica e immunostochimica (IHC)

1. Eseguire la deparaffinizzazione per consentire la reazione con soluzioni di tintura aque. Eseguirlo usando lo xylene e diminuendo la concentrazione di alcol (5 min per ogni passo). Reidratare per 5 minuti con acqua distillata.
2. Utilizzare le seguenti colorazioni isolari per valutare le anomalie dei tessuti architettonici e strutturali e la morfologia cellulare: H&E (per lesioni microscopiche vascolari e infiammazione), Cresyl Violet (NISSL; per perdita neuronale), Luxol Fast Blue (LFB; per la demistificazione), Gallyas (per placche neuritiche e fili neuropil).
3. Utilizzare l'immunohistochimica (IHC) per evidenziare la presenza di strutture target specifiche. Anti-NeuN e anti-GFAP sono utilizzati per identificare compartimenti neuronali e gliali; 4G8, AT8, s-SYN e TDP-43 sono utilizzati per identificare le proteine che si aggregano nelle malattie neurodegenerative (Tabella dei materiali).
   1. Sezioni pretrattate dewaxed con 3% H₂O₂ per 10 min poi risciacquare in PBS. Eseguire il trattamento di recupero con buffer di citrato 0,01 M pH 6 (cotto in serie per 2, 1 e 2 min) per gli antigeni 4G8, s-SYN, TDP-43 e NeuN; utilizzare il 70% di acido formico per 4G8 e 1-SYN. Preincubare per 30 min nel 5% siero di capra normale.
   2. Incubare durante la notte a 4 gradi centigradi con l'anticorpo primario. Il giorno dopo, sciacquare le sezioni in PBS prima dell'incubazione con l'anticorpo secondario (Envision - System-HRP etichettato Polymer) ad una diluizione di 1:2 in PBS per 1 h a temperatura ambiente.
   3. Lavare più volte in PBS e incubare nel sistema cromogeno con diaminobenzidina (Liquid DAB-Substrate Chromogen System) guardando lo sviluppo della reazione al microscopio (ingrandimento 4-10x). Infine lavare le sezioni in PBS. Controtessa le sezioni in ematossilina, disidratare e coverlip con montaggio DPX.
      NOTA: nella tabella 8 è riepilogato il protocollo standard. Eseguire la colorazione H&E su tutte le sezioni, mentre macchie speciali /specifiche e reazioni vengono utilizzate su sezioni selezionate. Casi selezionati richiedono aree o reazioni aggiuntive. La tabella dei materiali mostra i dettagli degli anticorpi utilizzati per l'IHC.

11. Caratterizzazione neuropatologica di base

NOTA: Vengono studiate alterazioni non specifiche del tessuto cerebrale, patologia vascolare, patologia del morbo di Alzheimer (AD), patologie non AD, sinocleinopatie, proteine leganti al DNA TAR (TDP-43) e lesioni ippocampali. Un microscopio ottico collegato a una telecamera viene utilizzato per rilevare lesioni microscopiche parenchymal. La valutazione istologica viene eseguita dallo stesso team di personale addestrato in neuropatologia, tra cui un professore di neurologia, un neurologo e un patologo. Si basa sull'approccio di Montine^{modificato 45} (tabella 8) comprendente anche: (1) TAUopatie non ad AD eterogenee che costituiscono il segno patologico della Degenerazione della lobo fronto-temporale (FTLD) relativa ai depositi TAU: malattia di Pick, Afasia progressiva primaria non fluente (TAU-nfPPA), Paralisi supranucleare progressiva (PSP)^46,47 e Degenerazione Cortico-Basale (CBD)⁴⁸. Inoltre, le TAUopatie non AD includono condizioni legate all'invecchiamento e senza alcun significato clinico definito come la TAUopatia Correlata all'età primaria (PART)⁴⁹, L'Astro-Gliopatia TAU correlata all'età (ARTAG)⁵⁰, la malattia del grano argyrofilo⁴⁸. (2) Sicleinopatia di tipo Lewy (LTS) correlata al morbo di Parkinson (PD) e alla demenza dei corpi di Lewy (LBD). Per cercare LTS, applicare i seguenti passaggi gerarchici: in un primo momento, bulbo olfattivo, tronco encefalico, amigdala/corteccia temporale; se le aree precedenti sono positive, aggiungere strutture limbiche (formazione ippocampale, corteccia entorinale, cingulate anteriore), giro frontale medio, lobulo parietale inferiore e corteccia occipitale⁴⁵. Se sono presenti caratteristiche cliniche di LBD corticale (cioè fluttuazioni e/o allucinazioni), considerare le strutture limbiche e l'isocorteccia per il primo passo. (3) Depositi TDP-43, il segno patologico di FTLD relativo ai depositi TDP-43: variante comportamentale della demenza frontale-temporale (bvFTD), demenza semantica (SD o svFTD), TDP-nfPPA e FTD-Motor Neuron Disease (FTD-MND). L'IHC per TDP-43 viene eseguito sulle seguenti sezioni: amigdala, ippocampo, corteccia entorinale e giro frontale medio; nei casi con sospetto FTLD clinico, considerare di esaminare altre sezioni⁵¹.

1. Valutare le alterazioni non specifiche del tessuto cerebrale in sezioni selezionate utilizzando H&E, NISSL, LFB e IHC per GFAP e NeuN. Considerare rarefazione neuronale, neuroni mongolfiera, spongiosi, gliosi, perdita di mielina, la presenza o l'assenza di infiltrati infiammatori o tumorali. Specificare la posizione prevalente di queste modifiche.
2. Per rilevare lesioni vascolari microscopiche, esaminare i vetrini H&E e LFB, tra cui almeno due macro-sezioni emisferiche (il primo passaggio attraverso i corpi mammillari (taglio Charcot) con lobi frontali e temporali, gangli basali, talamo anteriore, amigdala, e il secondo passando attraverso il lobo occipitale), la sezione "genicolata" della formazione ippocampale, una sezione cerebellare, e tutte e tre le sezioni principali del tronco encefalico (attraverso sostanziale nigra, locus coeruleus e DMNV).
   1. Rilevare la malattia dei vasi piccoli, tra cui arteriolosclerosi, lipoidalinosi, dilatazione dello spazio perivascolare, perdita di materia bianca, angiopatia amiloide cerebrale leptomeningeale e/o parenchimica e/o capillare. Specificare la scarpata (0–3) e la posizione^{prevalente 42,52}. Considerare la presenza o l'assenza di perdite di emosiderina, microemorraggi e microinfarti.
   2. Valutare il contributo del danno vascolare al danno cognitivo utilizzando lo schema gerarchico di Deramecourt (alterazioni della parete del vaso –piccola malattia dei vasi-infarti macroscopici). Per questa valutazione si consideri una sezione lobo frontale e temporale, gangli basali e ippocampo (punteggio 0-20)³⁰. Inoltre, stimare la probabilità che la malattia vascolare cerebrale abbia contribuito al danno cognitivo utilizzando il punteggio VCING (basso-intermedio-alto), ottenuto considerando gli infarti macroscopici emisferici e la malattia dei vasi piccoli del lobo occipitale, tra cui arteriolosclerosi da moderata a grave e angiopatia amiloide⁵³.
3. Valutare la patologia AD utilizzando IHC (4G8) per la diffusione dell'amiloide. Definire le fasi di Thal (1-5)⁵⁴, aggregare il punteggio amiloide (0-3)⁴⁵e la morfologia per sito (diffuso, focale, cored).
   1. Valutare la patologia AD Tau utilizzando IHC (AT8) e descrivere la morfologia prevalente per sito (grovigli neurofibrillari, fili di neuropil, placche neuritiche). Definire lo stadio di Braak (I-VI : segno positivo indica la presenza di ulteriori aree di patologia Tau iperfosforicolata non seguendo la gerarchia di Braak)⁵⁵ e punteggio aggregato (0-3)⁴⁵.
   2. Valutare le placche neuritiche utilizzando la colorazione Gallyas e il punteggio CERAD (0-3)⁵⁶. Quindi, definire la probabilità delle caratteristiche neuropatologiche corrispondenti a una sindrome clinica AD utilizzando il punteggio Amyloid-Braak-C ERAD (abc score 0–3): none-low-intermediate-high⁴⁵.
4. Utilizzare AT8 IHC per notare la presenza o l'assenza di patologia TAU non AD specificando la posizione prevalente e l'immagine morfologica peculiare. Considerare le inclusioni neuronali come grovigli a forma di fiamma o globose, inclusioni sferiche-globulari (cioè, corpi di Pick)⁵⁷, fili di neuropil, neuriti distrofici, grani argyrofili; e inclusioni gliali come astrociti trapolti, astrociti spinosi, placche astrocitiche, corpi arrotolato, inclusioni globulari^58,59.
5. Utilizzare l'IHC di syn per rilevare LTS (corpi di Lewy, corpi pallidi e neuriti di Lewy) sulle aree nella nota sopra riportata. In caso di positività, applicare la classificazione di McKeith (0-4) per valutare la gravità delle lesioni⁶⁰; quindi, utilizzare gli stadi di Beach (I-IV) per la distribuzione topografica (bulbo olfattivo, tronco encefalico predominante, limbico predominante, neocorticale)⁶¹. Confronta le fasi di Beach e Braak per definire la relazione tra LBD e AD patologia^60,61,62.
6. Considerare la presenza o l'assenza di Inclusioni Citoplasmiche Gliali (GCI; siercleinopatia gliale non Lewy) che sono il segno distintivo patologico di Multiple System Atrophy (MSA) e specificarne la posizione^{prevalente 63}.
7. Utilizzare TDP-43 IHC per rilevare i depositi TDP-43 sulle aree nella nota precedente. Identificare la morfologia prevalente per sito: Inclusioni citoplasmiche neuronali (RSI), Inclusioni Neurite Distrofiche (DN), Inclusioni nucleari (NI). Definire il modello: A (NI e DN predominanti: bvFTD e nfPPA); B (N NCI predominanti: FTD-MND); C (DN lungo predominante: svPPA e bvFTD)^51,64. Utilizzare lo schema di Nelson per definire la presenza di TDP-43 nei casi AD^65,66.
8. Valutare l'ippocampo a partire dal subiculum e dal settore Sommer (CA1). Usa il punteggio di Rauramaa (0-4): 1-2 rispettivamente per microinfarti e macroinfarti; 3–4 corrispondenti alla perdita neuronale moderata e grave, rispettivamente, e atrofia ippocampale (sclerosi ippocampale: HS). Indicare la presenza o l'assenza di depositi patologici di proteine (in ordine decrescente di frequenza: pTAU, TDP-43, z-syn)⁶⁷.
9. Definire la diagnosi neuropatologica e inserire tutti i dati patologici nel database.
   NOTA: I locali in cui sono conservati il materiale biologico e i dati sensibili dei donatori sono sempre bloccati e solo il personale autorizzato è autorizzato ad entrare, al fine di garantire sia la sicurezza che la privacy. Il materiale biologico congelato viene conservato in congelatori chiusi a -80 gradi centigradi, mentre i tessuti incorporati in paraffina fissati in formalina vengono conservati in armadi chiusi a temperatura ambiente. Vengono utilizzati doppi congelatori a motore ed è presente anche un congelatore di backup. Inoltre, per garantire che i congelatori siano sempre al lavoro, vengono dotati di un sistema di monitoraggio 24/7 che fa scattare un allarme. È presente anche un generatore di emergenza, in caso di interruzione dell'alimentazione. I partecipanti sono anonimizzati con un codice numerico per garantire la loro privacy; non è possibile per il personale non autorizzato tornare all'identità dei donatori e ai loro dati sensibili. Tutte le informazioni vengono raccolte in un database protetto da password; allo stesso modo, una copia cartacea di questi dati viene conservata in archivi bloccati.

Risultati

Donatori di cervello e dati sulla raccolta del cervello
Nel 2014, le assunzioni di donatori sono iniziate durante il secondo follow-up InveCe.Ab, che ha coinvolto 1010 soggetti su 1061 ammissibili (tasso di risposta: 93%; figura 1). Per quanto riguarda lo studio longitudinale InveCe.Ab, 290 partecipanti su 1010 (28,7%) hanno accettato di registrarsi come donatori (160 già registrati e 130 che hanno espresso l'intenzione di registrarsi). Il livello di istruzione è più alto nei donatori che nei non donatori (il 66% dei nostri donatori ha un livello di istruzione medio-alto: 8 o più anni di scuola), indicando l'importanza della cultura e dell'istruzione. Molti individui "sani" hanno anche mostrato interesse per il programma di donazione del cervello. La maggior parte dei nostri "controlli" confessano che possono simpatizzare con i malati e i loro parenti, e vogliono contribuire in qualche modo alla ricerca che porta a una migliore comprensione delle malattie neurologiche. Le persone altrui che si impegnano regolarmente in programmi di donazione di sangue o midollo durante la vita sono più aperte all'idea di donazione del cervello, così come le persone che hanno già accettato di donare organi dopo la morte. Sono consapevoli del fatto che, anche se non ci sarebbe un destinatario vivente, la loro donazione sarebbe di grande importanza per la ricerca. Un altro fattore che contribuisce alla donazione di cervello è la preferenza per essere cremato. Attualmente, la popolazione donatrice ABB comprende un totale di 427 individui (290 partecipanti InveCe.Ab - 137 volontari o pazienti dell'ospedale Geriatrico ASP Golgi-Redaelli), il 75% dei quali ha 70 anni o più. C'è una chiara predominanza delle femmine (64%) e mentalmente intatti anziani (circa l'85%). Finora, 27 cervelli sono stati raccolti su 40 donatori deceduti (67% tasso di autopsia); 13 soggetti non sono stati autopsii per vari motivi, tra cui la mancata segnalazione della morte all'ABB, lesioni gravi che portano alla distruzione cerebrale, malattie infettive pericolose e 1 caso CJD; 4 soggetti hanno revocato il loro consenso. Finora, 24 dei 27 cervelli raccolti hanno ricevuto una completa caratterizzazione neuropatologica con una diagnosi clinico-patologica definita, mentre i restanti 3 cervelli sono ancora all'esame(tabella 3). Ulteriori dati di raccolta del cervello da ABB includono: età media alla morte (81 anni); media dell'intervallo post-mortem (10,37 h); pH CSF (6.64); pH del tessuto medio (6.07); peso medio del cervello (1012.86 gr); AFS era 1 su 90% dei soggetti deceduti.

Biomarcatori neurofisiologici (QEEG)
QEEG fa parte dell'approccio multidimensionale. Si tratta di un metodo semplice, non invasivo e poco costoso, con un probabile potenziale per rilevare la conversione da lieve disturbo neuro-cognitivo (mild-NCD o MCI) a disturbo neuro-cognitivo maggiore (maggiore-NCD o demenza). Attraverso il nostro approccio multidimensionale, viene eseguito un semplice esame QEEG e viene testato il suo possibile ruolo di biomarcatore per la demenza. I nostri dati su una serie preliminare di 36 donatori cerebrali (18 anziani normali (NOLD), 11 mild-NCD e 7 major-NCD; 9 dei quali con una diagnosi neuropatologica definita) indicano che la percentuale media di ritmo alfa era significativamente inferiore nel NCD maggiore rispetto a NCD lieve (p: 0,002) e NOLD (p: 0,033). Al contrario, le frequenze EEG più lente (theta/delta) erano significativamente più elevate in NCD maggiore rispetto a NOLD/mild-NCD (vedi la figura di esempio nella Figura 4). Nella nostra serie, la distribuzione del ritmo EEG può differenziare i soggetti NOLD/mild-NCD dai pazienti con NDC maggiore indipendentemente dalla diagnosi etiologica, suggerendo che i ritmi cerebrali sono influenzati dal peso delle lesioni degenerative indipendentemente dal tipo di lesione. Infatti, 7 su 9 cervelli esaminati mostrano demenza a causa di patologie miste. La specificità per quanto riguarda la natura della patologia sembrerebbe essere bassa e i ritmi elettrici cerebrali sembrano essere influenzati più dal peso e dalla topografia delle lesioni che dalla loro natura molecolare (Poloni, et al. procedimenti di AD/PD 2019, Lisbona, dati inediti).

Casi emblematici
Il protocollo ABB può essere utile e necessario in alcuni casi e condizioni. Un esempio è la presenza di una patologia asimmetrica (Figura 5). Il nostro protocollo è molto adatto per l'identificazione e la corretta caratterizzazione di questo tipo di patologia. Finora, abbiamo esaminato 4 cervelli con coinvolgimento asimmetrico, alcuni dei quali sono mostrati nella Figura 5. Macroscopicamente, l'atrofia del latodestro(Figura 5A ) è presente in un caso con grave dilatazione ventricolare nella sezione coronale destra (Figura 5C) rispetto al lato sinistro (Figura 5B). Un altro caso mostra l'infarto dell'emisfero destro (Figura 5D) e un altro mostra una chiara atrofia del corpo mammillary destro (Figura 5E). A livello microscopico, un caso di FTLD mostra una positività asimmetrica TDP-43 che è più intensa sul lato frontale destro rispetto a sinistra (Figura 5F,G).

Le macrosezioni (Figura 6A,C) vengono utilizzate per ottenere una visualizzazione complessiva. La colorazione LFB aiuta a identificare la perdita di mielina (Figura 6D) e IHC sia per 4G8 che per AT8 (Figura 6B) permette di valutare la distribuzione dell'immunoreattività negli emisferi ad occhio nudo. Nella serie ABB, i cervelli di individui correlati sono disponibili per essere confrontati.

Nella Figura 7, le immagini microscopiche delle sezioni del cervello dei gemelli omozigosi vengono posizionate affiancate per un confronto più semplice (twin 1 (BB137): Figura 7A,C,E,G,I,K rispetto a due gemelli 2 (BB138: Figura 7B,D,F,H,J,L). Come in uno studio precedente simile⁶⁸, entrambi i gemelli sono stati confrontati da valutazioni cliniche e neuropatologiche. I gemelli hanno riportato la stessa diagnosi di NCD maggiore a causa di eziologie multiple, ma sono morti a due anni di distanza, all'età di 83 anni (demenza-esordio a 72 anni) e 85 (demenza-esordio a 76 anni), rispettivamente. I loro cervelli hanno un quadro neuropatologico molto simile, con un'alta patologia AD associata all'angiopatia amiloide. L'immunoreattività 4G8 è diffusa in tutta la corteccia (Figura 7A,B) e gangli basali (Figura 7C,D) con placche diffuse, dense e cored. È anche chiaramente rilevato sia nei vasi parenchymal che leptomeningeal della corteccia e del cervelletto (Figura 7A,B,G-J). A un ingrandimento più elevato, capCAA è chiaramente evidente (Figura 7G,H). Placche immunopositive AT8, grovigli e fili sono diffusi nelle cortice parieli di entrambi i cervelli (Figura 7E,F,L). Per quanto riguarda l'onere della patologia amiloide e NFT, il gemello 1 è considerato un Thal stadio 3 (montine A2) e un Braak stadio 5 (montine B3), mentre il gemello 2 è considerato un Thal stadio 5 (montine A3) e un Braak stadio 6 (montine B3). Avevano gli stessi anni di istruzione e di stile di vita simile; tuttavia, uno (BB137) si sposò e rimase vedovo poco dopo, mentre l'altro era single (BB138). Hanno mostrato diversi gradi di variabilità clinico-patologica con lo stesso inizio e lo stesso corso di malattia, ma in tempi diversi. Ciò conferma il fatto che, sebbene la componente genetica svolga un ruolo chiave nello sviluppo della malattia, la componente epigenetica e ambientale sono fondamentali per determinare manifestazioni leggermente diverse.

In alcuni casi, il quadro clinico non corrisponde alle caratteristiche neuropatologiche. Nella Figura 8,due casi diversi sono stati clinicamente definiti come casi di AD; Le analisi neuropatologiche mostrano, oltre a una patologia intermedia dell'AD, una positività diffusa per la malattia. Nel primo caso, un'immagine grave di LTS (Beach IV) mostra i corpi di Lewy omogeneamente trovati in tutto il giro cingoli (Figura 8A) e in SN come inclusioni citoplasmiche circondate da neuromelanina ( Figura8B,C). Nel secondo caso, i corpi di Lewy associati ai neuriti di Lewy sono diffusi nell'amigdala (Figura 8D,E) e nel nucleo di Meynert (Figura 8F,G) suggerendo una diagnosi di LTS limbica. Infatti, la topografia delle lesioni piuttosto che la loro natura molecolare produce le manifestazioni cliniche.

Figura 1: Diagramma di flusso dello studio Inve.Ce.Ab. Al basale, la prevalenza complessiva della demenza era del 3%. Nel corso dei follow-up, i tassi di prevalenza sono stati: 4,4% (1^st)⁶⁹, 7,1% (2^nd), 10,9% (3^rd). Il tasso di incidenza a otto anni era di 15 p/1000/anno (95% CI: 13-18 p/1000/anno). Le assunzioni dei donatori sono iniziate nel 2014 (durante il secondo follow-up). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Protocollo di dissezione del cervello (A), del cervelletto (F) e del tronco encefalico (H). Cerchio di Willis e singoli emisferi sono mostrati in (E) e (B). I tagli coronali di destra (C) e del lato sinistro (D) sono numerati e in alternativa fissi ("F") e congelati ("C"). Vengono visualizzate le sezioni di cervelletto sagittale (G) e le sezioni assialidel tronco encefalico( I ). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Vengono mostrate fette coronali del lobo fronto-temporale fisso (A) e sinistro (B).
Ippocampo e lobo temporale (A, R10b) sono divisi dal lobo frontale (A, R10a) sulla fetta destra. Sulla fetta opposta, l'amigdala e i gangli basali (B, L9b) sono divisi dal lobo frontale (B, L9a). Barra della scala: 1,7 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Distribuzione relativa della potenza spettrale nei soggetti NOLD e NCD principali. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini rappresentative di patologie asimmetriche. (A) Primo caso: cervello con atrofia destra. Le sezioni coronali (B) e (C) mostrano una dilatazione ventricolare a destra particolarmente evidente nelle sezioni 10–12 (C, frecce). Nelle sezioni (B) e (C), "F" sta per fisso e "C" per congelato (in italiano: congelato). (D) Secondo caso: grave infarto dell'emisfero destro. (E) Terzo caso: atrofia del corpo mammillary destro (freccia). (F, G) Quarto caso: le immagini microscopiche mostrano un'immunoreattività TDP-43 più intensa nella corteccia frontale destra (G) rispetto a quella sinistra (F) in caso di demenza frontotemporale. Barre di scala: 183 m (F, G). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Macrosezioni. (A, C) Fette coronali di lobo fronto-temporale fisso (A) e lobo parietale fresco (C). (B) Sezione fronto-temporale itologica immunoimato con anticorpo AT8. L'immunoreattività è chiaramente distribuita in tutta la corteccia, ma più intensa nel lobo temporale. (D) Sezione parietale ilogica macchiata con LFB. La freccia indica un'area di demelinazione della materia bianca. Barra di scala: 1,55 cm (B, D). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Gemelli. Confronto tra i cervelli di due gemelli omozigous: BB137 (A, C, E, G, I, K) e BB138 (B, D, F, H, J, L). Le immagini neuropatologiche sono molto simili. (A) e (B) mostrano la positività diffusa 4G8 nel lobo occipitale con placca amiloide, leptomeningeal (frecce) e parenchymal (frecce) vasi. L'angiopatia amiloide capillare (asterischi) è ben riconosciuta agli ingrandimenti più elevati (G) e (H). 4G8 è diffuso in tutti i gangli basali (C, D) e intorno alle navi leptomeningeal di cervelletto (I, J: frecce). L'immunoreattività AT8 identifica grovigli, fili e placche (frecce) nella corteccia parietale (E, F). La colorazione di Gallyas (K) rivela placche neuritiche come fa l'anticorpo AT8 (L). Barre di scala: 470 m (A-F; I-J); 90 m (G-H; K-L). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Diagnosi clinica contro neuropatologica. In questa cifra, sono riportati due diversi casi in cui la diagnosi neuropatologica differisce dalla diagnosi clinica. L'immunoreattività per il valore di -syn è un risultato inaspettato. (A–C) Primo caso: Gyrus cingoli (A) mostra una distribuzione omogenea dei corpi di Lewy in SN (B-frecce). In un neurone di SN, viene mostrato un doppio corpo di Lewy circondato da neuromelanina (C). (D–G) Secondo caso: una positività diffusa per il nucleo di sina-z è rilevabile nel nucleo di amigdala (D, E) e Meynert (F, G). I corpi cellulari e i neuriti lewy (asterisco) sono ben marcati. Barre di scala: 154 m (A, D, F); 37 M (B, E, G); 20 m (C). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: modello di contratto di trasferimento. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

		N	%
Genere	Maschi	607	45.9
	Femmine	714	54.1
Coorte di nascita	1935	236	17.8
	1936	219	16.6
	1937	264	20.0
	1938	305	23.1
	1939	297	22.5
Stato civile	Sposato	872	66.1
	Convivente	13	1.0
	Separato/Divorziato	29	2.2
	Vedova	325	24.6
	Singolo	80	6.1
Occupazione della vita primaria	Operai	666	50.6
	Colletti bianchi	459	34.9
	Casalinga	191	14.5
Anni di istruzione	5 anni	754	57.2
	>5 anni	565	42.8

Tabella 1: Caratteristiche socio-demografiche dei partecipanti allo studio InveCe.Ab.

CRITERI DI INCLUSIONE	CRITERI DI ESCLUSIONE
Tutte le persone dai 18 anni in su	Persone che rifiutano palesemente la donazione
Persone che vivono all'interno del territorio di Abbiategrasso	Persone che vivono al di fuori della Regione Lombardia
Volontari che danno il consenso da soli	Discrepanze tra il potenziale donatore e i desideri dei NOK per quanto riguarda la donazione di cervelli
Soggetti incapaci di decidere con il permesso di NOK	Situazioni che distruggono notevolmente la consistenza del cervello
Morte per causa naturale	Corso clinico di <2 anni a meno che non sia stata esclusa la possibilità di una malattia prisma
	Morte causata da omicidio o suicidio, con la necessità di un rapporto del coroner
	Intervallo post mortem >30 ore

Tabella 2: Criteri per la donazione di cervelli.

N	Sesso	CODICE BB	CODICE InveCe	Età	edu (anni)	Diagnosi clinica			Cdr	Afs	PM (ore)	tessuto pH	pH liquore	diagnosi neuropatologica
1	F	BB 37		87	5	NcD principale a causa di AD (BPSD)			5	2	29	Nd	Nd	Patologia ad alto livello AD, SVD moderata, TDP43, ctx LTS, HS
2	F	BB 105		94	5	Major-NCD a causa di AD			5	1	5	5.72	6.78	Patologia ad ALTO livello, SVD lieve, HS
3	F	BB 137		83	3	NCD principale a causa di molteplici eziologie (AD-VaD)			5	1	16	Nd	Nd	Alta patologia AD, SVD moderato, infarto occipitale, CAA-capCAA
4	M	BB 181		71	13	NcD principale a causa di AD (BPSD)			5	2	3	Nd	Nd	Grave LTS (Beach IV), patologia intermedia AD, mildSVD, mCAA
5	M	BB 115	I 636	78	18	Major-NCD a causa di AD			5	1	6	Nd	Nd	AD intermedio, SVD moderato, Infiammazione, ILBD (Spiaggia IIa), HS
6	F	BB 23	I 65	79	3	NCD maggiore a causa di malattia vascolare			5	1	14	Nd	Nd	CAA grave e diffusa, patologia intermedia ad AD
7	M	BB 102	I 412	79	8	NCD maggiore a causa di malattia vascolare			3	1	8	Nd	Nd	Demenza vascolare, ILBD
8	M	BB 224	I 16	80	3	NCD principale a causa di eziologie multiple			5	1	11	Nd	5.99	SVD moderato, Patologia ad AD bassa, ILBD (Beach IIa), HS
9	F	BB 47		78	5	Da NCD principale a più etiologie (LBD-VaD BPSD)			5	0	8	Nd	Nd	Patologia ad ALTO ad, patologia BG TAU, ARTAG, SVD lieve, HS
10	F	BB 153	I 965	79	5	Mild-NCD (morte a causa di cancro al colon con metastasi diffusa)			0.5	1	8	Nd	6.73	Patologia ad AD bassa, BG-SVD moderata
11	M	BB 118	I 1211	79	13	NOLD (morte a causa di cancro al fegato)			0	2	3	Nd	6.51	SVD moderato
12	M	BB 236	I 521	80	3	NcD principale a causa di AD (BPSD)			4	1	15	Nd	6.15	Patologia ad ALTO livello ad AD, grave BG-SVD (diversi microerragia), HS
13	F	BB 138		85	3	NCD principale a causa di molteplici eziologie (AD-VaD BPSD)			4	0	15	Nd	6.75	Alta patologia AD, SVD moderata, CAA, TDP43 limbico
14	M	BB 109	I 876	79	8	NOLD (morte a causa di tumore al cervello - GBL)			0	1	16	Nd	6.4	Patologia ad ACTIVE, ILBD (Beach IIa), SVD lieve
15	F	BB 271		84	8	NcD principale a causa di AD (BPSD)			4	1	2	Nd	6.7	AD intermedio, LTS limbico, BG-SVD moderato, mCAA, TDP
16	F	BB 71	I 1080	79	8	NOLD (morte per insufficienza cardiaca)			0	0	6	Nd	6.26	BG-SVD moderato, ILBD, amy TDP, basso AD
17	F	BB 189	I 858	80	5	NcD principale a causa di AD (BPSD)			3	0	20	Nd	6.42	AD intermedio, CAA-capCAA, TDP43, BG-SVD moderato, HS
18	F	BB 278	I 924	80	5	NCD principale a causa di LBD (BPSD)			3	1	5	6.02	7.05	AD intermedio, limbico LTS (Beach IV), TDP limbico, HS
19	F	BB 247		104	8	NCD principale a causa di eziologie multiple (probabilmente patologia mista)			3	0	6	6.48	7.22	Patologia TAU (PART-ARTAG), HS
20	M	BB 85	I 19	83	10	NCD principale a causa di LBD (BPSD)			3	1	9	6.26	7.3	Grave LTS limbico, AD intermedio, SVD moderato, grave CAA-capCAA, HS
21	F	BB 14	I 222	82	8	NCD principale a causa di molteplici eziologie (AD-VaD)			2	1	11	5.59	6.4	Patologia AD intermedia, SVD moderata
22	F	BB 282		76	8	NCD frontotemporale principale (nfPPA BPSD)			3	1	10	6.07	6.39	TDP (tipo A), ILBD, SVD moderato, basso AD, HS
23	F	BB 154	I 1079	80	5	NOLD (morte a causa di cancro con metastasi diffusa)			0	1	5	6.49	6.9	SVD moderato, CAA, basso AD, encefalite limbica
24	F	BB 290		65	13	NCD frontotemporale principale (bvFTD BPSD)			5	1	12	5.73	6.42	TDP (tipo A)
25	F	BB 210		89	8	NcD principale a causa di AD (BPSD)			5	1	15	5.94	6.4	in corso
26	M	BB 293		75	18	NCD frontotemporale principale (bvFTD BPSD)			5	1	8	6.14	6.83	in corso
27	F	BB 99	I 1370	79	9	NOLD (morte dovuta a shock settico)			0	2	14	6.3	7.12	in corso
	M/F			Significare	Significare				Significare	Significare	Significare	Significare	Significare
	0.5			81	7.7				3.2	1.0	10.4	6.1	6.6

Tabella 3: Diagnosi clinica/neuropatologica della serie ABB. BB: Banca del cervello; edu (anni): anni di istruzione; CDR: Valutazione della demenza clinica (0 - nessuna demenza; 0,5 - lieve danno cognitivo; 1 - demenza lieve; 2 - demenza moderata; 3 - demenza grave; 4 - demenza molto grave; 5 - demenza terminale); AFS: Punteggio del fattore agonale; PM (ore): ore post Mortem; nd: non fatto; M/F: Maschi/Femmine; BPSD: Sintomi comportamentali e psicologici di demenza; VaD: Demenza vascolare; NOLD: Anziani normali; GBL: Glioblastoma; nfPPA: Afasia progressiva primaria non fluente; bvFTD: variante comportamentale della demenza frontotemporale; SVD: Malattia dei vasi piccoli; LTS: Synucleinopatia di tipo Lewy; HS: Sclerosi ippocampale; CAA: Angiopatia amiloide cerebrale; capCAA: CAPIllare CAA; mCAA: meningeal CAA; ILBD: Malattia incidentale del corpo di Lewy; BG: Ganglia basale; ARTAG: Astro-Gliopatia TAU legata all'età; PARTE: TAUopatia primaria correlata all'età; amy: amigdala.

Dominio	Nome del test
Depressione	Center for Epidemiologic Studies Depression Scale (CES-D) [2]
Cognizione globale	Esame di stato mini-mentale (MMSE) [1]
Memoria verbale e visiva	Test di promemoria selettivo gratuito e cued [3]
	Test di Corsi [4]
	Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) Richiamo [5]
Attenzione / velocità psicomotoria	Sentiero che fa A [6]
	Matrici attenzioni [4]
Memoria semantica della lingua	Fluenza verbale semantica (colori, animali, frutta, città) [4]
Funzioni esecutive	Trail making B [6]
	Matrici colorate di Raven [7]
Abilità visuospatiali	Test di disegno dell'orologio (CDT) [8]
	Copia della figura complessa di Rey-Osterrieth (ROCF) [5]

Tabella 4: Valutazione neuropsicologica per i donatori di cervello.

Metaboliti

Conteggio completo del sangue

Colesterolo HDL e LDL

Trigliceridi

Glucosio

Emoglobina glicata (HbA1c)

Omocisteina

Cobalamina (vitamina B12)

Folato

Albumina

Urea

Creatinina

Transaminazioni (ALT e AST)

Gamma Glutamyl transferase

Ormone stimolanti della tiroide (TSH)

Vitamina D (25-idrossi-vitamina D)

Proteina C-Reattiva (CRP)

Elettroliti

Tabella 5: Pannello metabolico per i donatori di cervello.

NOME GENE	dbSNP
Apolipoproteina E (APOE)	rs429358
	rs7412
Catalasi (CAT)	rs1001179
Dismutasi del superossido 2 (SOD2)	rs4880
Angiotensinogen (AGT)	rs699
Sirtuin 2 (SIRT2)	rs10410544
Translocase della membrana mitocondriale esterna 40 (TOMM40)	rs2075650
Integratore di bridging 1 (BIN1)	rs7561528
Catechol-O-methyltransferase (COMT)	rs4680
Reducta di metilenetetraidrofolato (MTHFR)	rs1801133
	rs1801131
Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)	rs6265
famiglia di portatoi portaerei soluta 6, membro 4 (SLC6A4 o 5HTT)	Regione polimorfica legata al trasportatore di idrossimetrieptamina (5-HTTLPR)
	rs25531

Tabella 6: SNP analizzati per donatori di cervelli InveCe.Ab.

Processo	Soluzione	Durata
		ESEMPI DI MACRO	MICRO CAMPIONI
Fissazione	10% FORMALIN MEMORIZZATO NEL BUFFER	8 giorni a 4 gradi centigradi	8 giorni a 4 gradi centigradi
Lavaggio	BUFFER FOSFATO	2-15 giorni a temperatura ambiente	2-15 giorni a temperatura ambiente
Lavaggio	H2O LAVAGGIO	2-3 h, acqua del rubinetto	2-3 h, acqua del rubinetto
Disidratazione	ETHYL ALCOL 70%	24 h	8 h
Disidratazione	ALCOOL ETILO 80%	24 h	4 h
Disidratazione	ETHYL ALCOL 90%	60 h (di solito durante il fine settimana)	4 h
Disidratazione	ETHYL ALCOL 95%	12 h	4 h
Disidratazione	ETHYL ALCOL 95%	12 h	4 h
Disidratazione	ETHYL ALCOL 100%	6 h	4 h
Disidratazione	ETHYL ALCOL 100%	6 h	4 h
Compensazione	XYLENE I	12 h	10 h
Compensazione	XYLENE II	12 h	10 h
Infiltrazione	PARAFFINA I	12 h	11 h
Infiltrazione	PARAFFINA II	12 h	11 h
Incorporamento	Paraffina

Tabella 7: Protocollo di elaborazione dei tessuti ABB.

Regione	H&E	CRESIL VIOLA	LFB	GALLYAS	4G8	AT8	SYN-SYN	TDP-43	Neun	Gfap
BRAINSTEM
Medulla- Nucleo Motorio Dorsale di Vagus	X					X	X
Pons - Locus Coeruleus	X					X	X
Midbrain - Sostanziale Nigra	X				X	X	X
Cervelletto
Corteccia cerebellare e nucleo di Dentate	X	X	X		X
Cervello
Giro frontale medio	X	X	X		X	X	X	X
Basal Ganglia - nucleo di Meynert	X	X	X		X				X	X
Cingulate, anteriore	X	X	X		X		X		X	X
Amigdala	X					X	X	X	X	X
Talamo e nucleo subtalomico	X					X
Gyri temporale superiore e medio	X	X	X	X	X	X	X		X	X
Ippocampo e corteccia entorinale	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Lobulo parietale inferiore	X	X	X	X	X	X	X
Corteccia occipitale	X		X		X	X	X
Lampadina olfattiva	X						X

Tabella 8: Regioni valutate, colorazione e immunostochimica.

Discussione

Passaggi critici del protocollo
Il nostro obiettivo è quello di ottenere, caratterizzare e conservare tessuti di buona qualità provenienti da soggetti con una storia dettagliata derivata dall'osservazione longitudinale. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario affrontare i seguenti aspetti chiave. Come descritto in precedenza, il protocollo inizia con il reclutamento di donatori, che è il primo passo cruciale. Quindi, è necessario che i donatori continuino il programma di follow-up e mantengano l'adesione al progetto nel tempo fino all'effettiva donazione del cervello. Al momento del decesso, è necessario che il personale ABB sia tempestivamente informato per convocare l'autopsia entro 24 ore, essendo importante per un'adeguata qualità dei tessuti. Il taglio fresco degli emisferi cerebrali richiede una mano ferma e un allenamento specifico. Per evitare danni cellulari causati da congelamento lento e ottenere fette di buona qualità per il criostato e l'Omics, è importante che siano congelati rapidamente. Considerando la velocità di penetrazione della soluzione di formalina (1 mm/ora), per preservare l'antigenicità tissunte il tempo di ammollo della singola fetta viene mantenuto al minimo.

Risoluzione dei problemi del metodo
Al fine di affrontare i passaggi critici di cui sopra offriamo il seguente approccio. Reclutamento dei donatori e aderenza ai follow-up: Ci sono diversi fattori che ostacolano la donazione del cervello, tra cui i timori di danneggiare la figura del corpo, la purezza e l'integrità, o della possibilità di provare dolore dopo la morte. Alcuni temono addirittura che l'autopsia possa essere condotta mentre sono ancora vivi^70,71. Sono inoltre presenti 72 preoccupazioni circa l'interruzione degli accordi funebri^{e l'onere finanziario.} Inoltre, la mancanza di conoscenza da parte del personale medico delle procedure post-mortem e l'incapacità di affrontare le preoccupazioni dei potenziali donatori o del loro NOK possono scoraggiare la registrazione. Tutti questi fattori possono produrre un basso livello di consapevolezza con un basso numero di partecipanti iscritti e un'alta possibilità di perdita del donatore nel tempo. In effetti, il programma di reclutamento dei donatori dovrebbe essere efficace nel diffondere la consapevolezza, infondere fiducia e convincere le persone a registrarsi e mantenere alti tassi di partecipazione al follow-up. Nella nostra esperienza, questo viene fatto attraverso un'attenta selezione di potenziali donatori e una spiegazione approfondita degli scopi del BB. Offriamo attività educative e un approccio empatico per affrontare le paure e le esigenze delle persone sane e delle persone afflite e delle loro famiglie. Troviamo che i potenziali donatori sono più propensi a dare il loro consenso quando vengono contattati di persona. Un approccio faccia a faccia crea una relazione basata sulla fiducia reciproca e sul rispetto che è fondamentale per ottenere un'alta percentuale di registrazione alle donazioni cerebrali e valutazioni di follow-up. Uno staff altamente qualificato con un forte senso dell'etica si avvicina prima al potenziale donatore, discute la possibilità di donare il cervello dopo la morte, spiega il valore del tessuto cerebrale umano alla ricerca neuroscientifica e chiarisce ogni dubbio sulle procedure post-mortem. Il passaparola favorevole è altrettanto importante. Dopo la raccolta del cervello, viene prestata un'attenzione e una cura adeguate per ricomporre il cadavere. È importante mostrare rispetto e gratitudine alla persona deceduta trattando delicatamente il cadavere. Pochi mesi dopo, è previsto un incontro per comunicare i risultati dell'analisi neuropatologica ogni volta che richiesto dai membri della famiglia.

L'ora del decesso e la raccolta del cervello: Quando la persona accetta, diventa un donatore e viene data una carta d'identità con un numero da contattare 24 ore al giorno, 7 giorni /settimana (il numero di ricezione dell'ospedale geriatrico ASP Golgi-Redaelli che è collegato a noi). Inoltre, un'etichetta adesivo viene data ai parenti da utilizzare in caso di ricovero in ospedale. Le agenzie funebri della zona sono state precedentemente informate per portare il corpo nelle strutture ABB, dove viene convocata la squadra di autopsia. L'unità di autopsia è composta da un patologo, un neurologo e/o un neurobiologo, e un tecnico di sala anatomica, che sono a chiamata dalle 6:00 alle 23:00 ogni giorno; alcuni studenti tirocinanti sono spesso presenti per assistere e scattare foto.

La precisione e la coerenza delle nuove procedure di taglio sono garantite dal coinvolgimento degli stessi due operatori (un neurologo e un patologo) che hanno sviluppato il metodo e hanno diversi anni di esperienza in neuropatologia. Quando congelano le fette, vengono messe su un vassoio di alluminio prefrozen e coperte con una piastra di alluminio intrecciata per mantenerle ben piatte. Immediatamente dopo, vengono messi in azoto liquido per 3 minuti, prima di conservarli a -80 gradi centigradi. Le fette da sistemare sono avvolte singolarmente in garza e imbevute in una soluzione di formalina tamponata al 10% di fosfato, che viene sostituita dopo un giorno. Successivamente, sono tenuti in formalin non più di 5 giorni aggiuntivi; tuttavia, considerando che la soluzione formalina penetra a 1 mm/giorno, vorremmo accorciare ulteriormente il tempo di ammollo.

Limitazioni del metodo
Il metodo di ricerca qui descritto copre solo un'area geografica limitata, e gli individui coinvolti nel programma di donazione possiedono caratteristiche che non rappresentano interamente la popolazione generale. Anche se più che accettabile, un intervallo post-mortem fino a 24 ore può produrre alterazioni in alcune strutture proteiche, enzimi e RNA del tessuto cerebrale. La determinazione di AFS e pH potrebbe non essere del tutto adeguata per determinare la qualità del tessuto⁷³ e stiamo sviluppando altri modi di autenticare la qualità dei tessuti in base all'integrità dell'RNA.

Per quanto riguarda la procedura di taglio dei microtomi, anche se molto utile per ricostruire le relazioni anatomiche, va notato che l'uso di macrosezioni non è semplice e presenta alcune difficoltà tecniche. Il nostro metodo è impegnativo e richiede molto tempo. I costi sono piuttosto elevati e il finanziamento non è sempre facile. Il finanziamento proviene principalmente da fonti pubbliche (OSPEDALE Geriatrico ASP Golgi-Redaelli) e private (Fondazione Golgi-Cenci), donazioni private, organizzazioni no profit (ad esempio "Federazione Alzheimer Italia") e sovvenzioni alla partecipazione.

L'importanza del metodo ABB rispetto ai metodi esistenti/alternativi
All'inizio, il nostro programma di donazione di cervelli ha preso di mira le persone che partecipano allo studio longitudinale InveCe.Ab. Di conseguenza, i cervelli donati sono accompagnati da informazioni cliniche, biologiche e sociali dettagliate raccolte nel corso degli anni. La forza di ABB deriva proprio da questa origine distintiva. Infatti, studiare un gruppo di persone socialmente e geneticamente correlate che condividono caratteristiche biologiche ed esposizioni ambientali migliora l'analisi statistica. Inoltre, lo studio comprende i seguenti vantaggi: 1) Prendersi cura e provvedendo alle esigenze della comunità (l'atto di "dare prima di chiedere"): le persone ricevono un controllo periodico gratuito di cui il medico generico è informato, un numero di telefono del nostro segretario è previsto per le consultazioni e le persone gravemente disabili sono visitate a casa; 2) coinvolgere i partecipanti, le persone con ruoli pubblici e i medici generici nelle attività educative attraverso l'organizzazione di seminari periodici (relativi alla salute del cervello, alla donazione del cervello e alla salute generale) e alla pianificazione di corsi tematici (ad esempio l'uso di dispositivi ittici per anziani); 3) Incontrare le persone e adottare un approccio faccia a faccia. Tutti questi elementi costituiscono la forza del progetto ABB. Inoltre, il progetto migliora le capacità cliniche del personale medico coinvolto, in quanto acquisiscono esperienza sia nelle valutazioni antemortem che nelle valutazioni neuropatologiche post-mortem. A questo proposito, vorremmo menzionare l'esperienza molto particolare di "Lo studio di ricerca sull'invecchiamento delle minoranze". Questo studio ha coinvolto un numero limitato e selezionato di afroamericani residenti nell'area di Chicago (784 su 1.357 soggetti ammissibili: tasso di risposta del 57%). I partecipanti sono stati visitati ogni anno a casa e sono stati invitati a partecipare al programma di donazione del cervello. Questo studio si basa su un approccio insolito con alcune somiglianze con la nostra ottenendo alte percentuali di risposta positiva al programma di donazione del cervello (352 donatori su 784 partecipanti sono stati iscritti: 44%), anche se il tasso di autopsia non era abbastanza soddisfacente (53%)⁷⁴. Proprio come in "The minority aging research study", offriamo attività educative e un approccio empatico, ottenendo ottimi risultati. In particolare, il nostro tasso di risposta è del 93%, la percentuale di iscrizione è del 28,7% e il tasso di autopsia al momento è del 67%. Questi tassi mostrano che i progetti che impegnano direttamente le persone hanno una percentuale più consistente di donazioni. Altri programmi di donazione del cervello, con meno attenzione nella costruzione di una relazione con i potenziali donatori, hanno generalmente una bassa percentuale di iscrizione, essendo intorno al 10-15%^{o meno 73,75}.

Ci sono pochi studi di coorte precedenti che terminano con un'analisi neuropatologica. Inoltre, la maggior parte delle banche cerebrali e repository sono centrato sulla malattia e c'è una scarsità di cervelli "di controllo" da donatori sani rispetto al numero di cervelli "malattia". Solo un numero limitato di BB si basa su studi di popolazione che coinvolgono soggetti sia matidi che normali al fine di studiare le traiettorie^{di invecchiamento 73,74,76,77,78,79,80}. Alcuni studi come "The minority aging research study" negli Stati Uniti⁷⁴ e "The Vantaa 85' studio" in^{Finlandia 76} sono simili al nostro, ma tendono a esarsi con la cessazione della coorte. Invece, il programma di donazione di ABB è previsto per continuare per lungo tempo in futuro, arruolando potenziali donatori e programmando follow-up anche dopo la fine dello studio longitudinale InveCe.Ab. Questo approccio rende il nostro metodo di reclutamento simile a quello del "Sun Health Research Institute (SHRI) programma di donazione del cervello" che si rivolge a una comunità di pensionamento⁷³. Il protocollo SHRI per la donazione di cervelli è molto efficiente con l'intervallo post-mortem medio più breve al mondo (3,92 ore). Simile ai più grandi BB del mondo, il protocollo SHRI ha semplicemente tagliato il cervello, il cervelletto e il tronco encefalico nella linea mediana (piano sagittale), quindi una metà viene sezionata fresca e congelata per gli studi biochimici, mentre l'altra è fissata in formalina per la valutazione istopatologica. Tuttavia, uno dei punti di forza del protocollo di dissezione SHRI è la fissazione di singole fette invece dell'intero emisfero. Infatti, fissare un emisfero nel suo complesso non è ottimale, a causa dei diversi gradienti di fissazione tra la superficie e il nucleo. Inoltre, le proteine corticali possono essere influenzate dall'esposizione prolungata alla soluzione di formalina. Così, il motivo per cui abbiamo deciso di fissare singole fette.

La decisione su quale lato è fisso o congelato, dipende dalla singolare banca (sempre la stessa, assegnata o assegnata in modo casuale a seconda che il giorno della dissezione sia dispari o pari)^{31,32,33,34,35}. Quindi, l'analisi biochimica e istopatologica sono condotte separatamente su ogni emisfero. Poiché molte malattie neurologiche sono asimmetriche, il nostro BB offre un protocollo unico per affettare campioni freschi: sezioni alternative dal tronco encefalico e da ogni emisfero di cervelletto e cerebrum vengono mantenute come materiale fisso o congelato; una fetta fissa su un emisfero corrisponde a una congelata sull'altro emisfero. Il nostro metodo dà l'opportunità di ottenere una caratterizzazione stologica completa di tutto il materiale congelato e di confrontare i risultati di tutte le aree di entrambi i lati. Come detto nell'introduzione, il metodo descritto ci permette di ottenere il maggior numero possibile di informazioni dal tessuto cerebrale. Inoltre, il metodo di ABB produce una caratterizzazione neuropatologica di base ma completa, tra cui quasi tutte le proteine cerebrali conosciute e la patologia vascolare. A causa del controverso ruolo delle lesioni vascolari nel determinare il danno cognitivo, abbiamo deciso di utilizzare un doppio punteggio per l'onere vascolare^30,53.

Come spiegato nel protocollo, usiamo un approccio multidisciplinare. Anche se questo è un metodo che richiede tempo e lavorato, crediamo che fornisce diversi vantaggi per la ricerca. Per esempio, in un lavoro precedente, abbiamo dimostrato che l'alto tHcy di per sé, o MTHFR C677T TT associato all'allele APOE-4, può essere correlato a disfunzioni esecutive piuttosto che alla perdita di^{memoria 81}. Pertanto, può essere interessante valutare soggetti con questo particolare profilo genetico a livello neuropatologico. Questo è un esempio di come tale follow-up approfondito sia utile per creare nuove ipotesi di ricerca verificabili attraverso lo studio del materiale biologico raccolto nella nostra banca. Un'altra dimostrazione del vantaggio del nostro approccio è l'inclusione del QEEG tra le valutazioni che eseguiamo regolarmente, per la sua originalità e la relativa facilità d'uso. Infatti, EEG rileva l'attività sinaptica della corteccia cerebrale registrando i potenziali elettrici dei dendriti appartenenti ai neuroni piramidali corticali⁸². QEEG può essere considerato un biomarcatore per la stima dell'attività sinaptica corticale che è legata alla cognizione⁸³. In particolare, una diminuzione dei ritmi alfa nella parte posteriore del cervello con un aumento generale delle frequenze più basse (ritmi theta e delta) è stata correlata alla rottura della connessione corticale. Va considerato che la maggior parte degli studi di correlazione diagnostica sono stati basati su una diagnosi clinica che è solo una diagnosi probabile e non definitiva^84,85,86,87. Solo pochissimi studi mirati hanno confrontato i dati QEEG con il quadro neuropatologico per studiare la correlazione tra le varianti QEEG e LTS^88,89e la distinzione tra FTLD e AD⁸³. Terminando il nostro studio con una definizione della diagnosi neuropatologica, è quindi possibile interpretare correttamente le osservazioni fatte sull'attività elettrica cerebrale. Inoltre, eseguendo QEEG seriale in ogni soggetto possiamo tracciare la traiettoria delle onde EEG intra-individuali e le loro correlazioni con il quadro neuropatologico. A seguito di singole modifiche dell'attività elettrica corticale nel tempo può portare a una migliore comprensione del suo significato come biomarcatore per la demenza incipiente.

Applicazioni future e direzione del metodo
L'implementazione della distribuzione dei tessuti è uno dei nostri principali obiettivi potenziali. Per fare questo, abbiamo appena istituito una commissione scientifica che include il direttore della Fondazione GC (geriatra), un accademico di Neurologia dell'Università di Pavia, un neurologo e un patologo sia della Fondazione GC e dell'Ospedale Geriatrico ASP Golgi-Redaelli. Quando si distribuisce tessuto cerebrale, diapositive istologiche e altri campioni biologici, è importante ricordare che i donatori hanno accettato la donazione per il bene della ricerca. La distribuzione del materiale dovrebbe quindi avvenire con prudenza, proprio come descritto nel Codice di condotta BNE⁴⁰. Qualsiasi parte che presenta una richiesta di materiale deve indicare il tipo e la quantità del campione necessario, fornire una descrizione del progetto di ricerca e come verranno utilizzati i campioni e, ove possibile, fornire prove di pubblicazioni precedenti (per il contratto di trasferimento, vedere la figura 9). La banca del cervello non funziona per il guadagno finanziario. Quindi, le tasse pagate dai ricercatori dovrebbero coprire solo le spese di approvvigionamento, lavorazione, stoccaggio e distribuzione dei tessuti.

Sono in moto piani per iniziare ad analizzare i casi con il sequenziamento dell'esoma e le tecniche Omics, come la proteomica e la trascrittiomica. La nostra metodologia di campionamento alternativo permetterà di eseguire studi sull'omica su tessuti istologicamente ben definiti di entrambi gli emisferi. Attraverso questo approccio, sarà possibile confrontare il modello di attivazione genica in diverse aree cerebrali dello stesso emisfero e nelle aree corrispondenti dell'altro emisfero, ed essere in grado di correlare l'attivazione genica con l'istopatologia. In questo campo, le applicazioni di deep learning sarebbero di grande interesse, tra cui l'analisi computerizzata delle diapositive istologiche e la correlazione all'avanguardia dei dati clinici, istologici e omici. Altre correlazioni tra molte variabili diverse possono essere identificate così come altre possibili applicazioni tecnologiche. La disponibilità di materiale congelato da entrambi gli emisferi consentirà una topografia accurata dell'attivazione genica e della distribuzione delle proteine. Questo sarà di particolare interesse anche in soggetti sani, considerando che entrambe le funzioni cerebrali e alcune malattie sono asimmetriche.

Inoltre, possiamo ottenere colture cellulari da donatori cerebrali ben caratterizzati. Infatti, le colture cellulari dei leptomeninges dei cervelli raccolti forniscono cellule viventi che possono essere utilizzate per ulteriori indagini di malattie o meccanismi di invecchiamento, attraverso la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che prevede la riprogrammazione dei fibroblasti leptomeningeali e la loro differenziazione in cellule neurali nei modelli^{avanzati 90}.

Con l'età del cervello, possono verificarsi diversi profili di cambiamento a livello molecolare, cellulare e tissunte. Ogni cervello è unico. Ognuno ha il proprio modo di rispondere ai fattori di stress interni ed esterni; alcuni resiste, mentre altri soccombono e mostrano patologie distinte. Le discrepanze tra la presentazione clinica e il quadro neuropatologico spesso esistono perché la topografia delle lesioni, piuttosto che la loro natura molecolare, determina la presentazione clinica. La diagnosi corretta e definita potrebbe essere ottenuta solo combinando la sindrome clinica con i risultati neuropatologici che spesso aggiungono importanti indizi eziologici necessari per svelare la patogenesi delle malattie. In Europa, c'è uno sforzo per creare un approccio standard alla diagnosi neuropatologica. Il nostro protocollo diagnostico segue quasi completamente le linee guida recentemente pubblicate sulla diagnosi neuropatologica per il brain banking⁹¹. Questo ci permetterà di raccogliere e condividere tessuti cerebrali ben documentati, con l'obiettivo potenziale di istituire la prima Banca Italiana del Cervello. Infatti, in Italia ci sono depositi di cervello, ma non banche del cervello basate su studi di coorte. Il nostro obiettivo è quello di sviluppare un metodo per la raccolta del tessuto cerebrale che possa essere implementato in generale in tutta Italia, per creare una rete che utilizzi un protocollo comune e condivida materiale comparabile. A tal fine, il coinvolgimento di altri centri di ricerca e la creazione di un sito web specifico sono tra i principali obiettivi per il futuro.

Tecnologie innovative vengono costantemente utilizzate per l'analisi della natura molecolare delle malattie neurodegenerative e per l'identificazione dei biomarcatori. In questo contesto, ci sarà un crescente bisogno di cervelli accompagnati da informazioni sulle traiettorie cognitive e di invecchiamento ottenute attraverso studi longitudinali, sottolineando l'importanza di un approccio epidemiologico neuropatologicalmente verificato⁹².

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Electrical saw with 5d blade	CEA	06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm	CEA	70064.250 HHH
Electrode pH needle	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Bovine Serum	Carlo Erba	FA30WS1810500	medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical	Uvex	500XG
Gloves	CEA	01.28.14
Glue	Arcobaleno	2624000800002
Head supporter	Lacor	60456
L-Glutamine (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape	CEABIS	CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide	UHU Bostik	8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140050	medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Surgical mallet and surgical cisel	CEA	79.68.88
Surgical scissor	CEA	27.08.45/79.68.64
	Feather	M130RC