الكشف عن إنشاء إمدادات الدم المشتركة في الفئران الباربايوتيك عن طريق حقن الجلوكوز في الوريد Caudal

Summary

هنا نصف طريقة جديدة للكشف عن نجاح إنشاء الدورة الدموية المشتركة من اثنين من الباربايوينتس من خلال حقن الوريد caudal من الجلوكوز، والذي يسبب الحد الأدنى من الضرر وليس قاتلا للبارابيوتر.

Abstract

Parabiosis هو طريقة تجريبية للجمع جراحيا اثنين من الحيوانات المتوازية على طول المحور الطولي للجسم. نقدم بروتوكولا للكشف عن نجاح إنشاء التشيميرة الدم في parabionts عن طريق حقن الوريد caudal من الجلوكوز. تم بناء الفئران البارابيوية. تم حقن الجلوكوز في الفأر المانح ة من خلال الوريد الذيل، وتم قياس تقلب مستوى السكر في الدم في كل من الفئران باستخدام مقياس غلوككوز الدم في نقاط زمنية مختلفة. أظهرت نتائجنا أنه بعد حقن الجلوكوز ، زاد مستوى السكر في الدم في الفئران المانحة بشكل حاد بعد دقيقة واحدة وانخفض ببطء بعد ذلك. وفي الوقت نفسه، بلغ مستوى السكر في الدم للفئران المتلقية ذروته بعد 15 دقيقة من الحقن. تم الحصول على نتائج مماثلة مع إيفانز الأزرق, تستخدم كتحكم إيجابي للجلوكوز. يشير التذبذب المتزامن لمستويات السكر في الدم إلى أن تدفق الدم بين الفئران اثنين تم إنشاؤه بنجاح.

Introduction

Parabiosis هو طريقة النمذجة التي يتم فيها ضم اثنين من الكائنات الحية معا جراحيا وتطوير كنظام فسيولوجي واحد مع نظام الدورة الدموية المشتركة^1. وقد استخدمت هذه النماذج على نطاق واسع لدراسة علم وظائف الأعضاء نظرا لميزة أن المواد التي ينتجها فرد واحد يمكن أن تعمل على كل من الحيوانات في نفس الوقت عن طريق نظام الدورة الدموية المشتركة. منذ منتصف 1800s عندما كانت التجارب الباربايوية رائدة من قبل بول بيرت²، أصبحت أساليب بناء النماذج البارابيوية موحدة. ومع ذلك ، فقد طريقة واضحة ومريحة للتحقق من نجاح إنشاء التشيهالدم. وقد أفيد أنه يمكن تقييم التداول عبر بنجاح عن طريق حقن داخل البيتونيا 0.5٪ صبغة زرقاء إيفانز في واحدة من البارابيوات تليها قياس امتصاص الأزرق إيفانز في الدم من كل من الباربايوينتس مع قارئ microplate³. طريقة أخرى تتطلب سلالة الماوس محددة تحتوي على CD45.1^{+ -}وCD45.2⁺- المسمى monocytes في كل بارابيونت. ثم يتم استخدام الخلايا لتحديد التشيميرة الدم عن طريق قياس تواتر اثنين من علامات في monocytes من الطحال أو الدم^4. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون قاتلة أو مرهقة للحيوانات ، وطريقة آمنة وبسيطة للتحقق السريع والموثوق به من النماذج البارابيوية أمر مرغوب فيه للغاية. في هذه الدراسة ، أنشأنا طريقة جديدة لهذا الغرض ، والتي تم التحقق من صحتها في نموذج الماوس من parabiosis. يتم قياس تركيز الجلوكوز في عينات الدم المسحوبة من الوريد الذيل باستخدام مقياس الجلوكوز ، ويعتبر نمط التغيرات في مستوى الجلوكوز في الفئران المانحة والمتلقية مؤشرا على تشيميرية الدورة الدموية. نحن اسمه هذا الأسلوب "طريقة تقلب الجلوكوز". لا يقتصر تطبيق طريقة التحقق هذه على الفئران ولكن يمكن توسيعها إلى نماذج مرضية متنوعة باستثناء أولئك الذين يعانون من dysregulation خطيرة من استقلاب الجلوكوز. الإجراء بسيط، توفير الوقت، وآمنة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات ورعايتها من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة هاربين الطبية.

ملاحظة: يتم سرد الأدوات والمعدات المطلوبة للطريقة في جدول المواد.

1. إعداد المواد والحيوانات

1. اطلب C57BL/6 فئران ذكور بوزن يتراوح بين 20 جم-25 جم من مورد الحيوانات المختبرية القياسي.
2. اعمل على تناول الفئران في دورة من الضوء 12 ساعة: 12 ساعة من الظلام عند 24-26 درجة مئوية مع وصول الإعلانية libitum إلى الماء والغذاء.

2- بارابويس

1. تحقن الفئران بحقن داخل البرتونية من 20 غرام/لتر 2,2,2-تريبروموثانول بتركيز 0.1 مل/10 ز. تأكد من الحقن السليم كما هو مبين باسترخاء العضلات، والتنفس البطيء والمطرد، وفقدان انعكاس تحفيز الجلد، واختفاء منعكس القرنية.
2. تطبيق مرهم العيون مع Q-تلميح لمنع جفاف العينين.
3. تنفيذ إجراء parabiosis كما هو موضح سابقا⁵.
   1. وضع الفئران في موقف supine. اعمل على الإنزلاف الدقيق للجانب الأيسر من فأر ة واحدة والجانب الأيمن من الفأرة الأخرى بدءًا من حوالي 1 سم فوق الكوع إلى 1 سم تحت الركبة باستخدام آلة التكال. استخدام كريم إزالة الشعر لمسح تماما الفراء على الجلد حليق.
   2. مسح المناطق النابة مع iodophor. ضع الفئران على وسادة ساخنة مغطاة بوسادة معقمة.
   3. إنشاء شقوق الجلد الطولية بدءا من 0.5 سم فوق الكوع إلى 0.5 سم تحت مفصل الركبة باستخدام زوج من مقص حاد على الجانب كل الحيوان حليق.
   4. فصل الجلد من اللفافة تحت الجلد بلطف بعد شق.
   5. ربط olecranon والركبة من البارابيون مع خياطة 3-0.
   6. خياطة الجلد الحليق مع خياطة مستمرة 5-0.
4. حقن 0.5 مل من 0.9٪ NaCl تحت الجلد إلى كل فأر ة لمنع الجفاف.
5. حقن الترامادول (10 ملغ/25 غرام/يوم) عضليا لكل فأر لتخفيف الألم.

3. التحقق من صحة التشيميرة الدموية

1. طريقة تقلب الجلوكوز
   ملاحظة: تحقق من البناء الناجح لتشية الدورة الدموية بين الباربايوينت باستخدام طريقة تقلب الجلوكوز (عدم الصيام) في اليوم العاشر بعد جراحة الباربوريس.
   1. تحقن البارابيوتينات بالحقن داخل البراتوران 20 غ/لتر 2,2,2-تريبروموثانول لكل فأر بتركيز 0.1 مل/10 جم.
   2. إصلاح الفئران المانحة في المثبت ذيل الماوس البصرية Venous.
   3. فرك الأوردة الكودالية في جناح أحد ذيل البارابيون مع كرة قطنية غارقة في الكحول 70-75٪ لتنظيف الذيل وتمدد الأوعية الدموية.
   4. احمل حقنة 1.0 مل تحتوي على الجلوكوز في اليد اليمنى وابق الإبرة موازية للوريد (أقل من 15 درجة).
   5. أدخل الإبرة في موضع يبعد حوالي 2-4 سم عن طرف الذيل.
   6. حقن 100 ميكرولتر من الجلوكوز (1.2 غرام/ كجم) في المتبرع في غضون 10 ق.
      ملاحظة: يشير مصطلح المتبرع إلى الباربايوين تتلقي حقن الجلوكوز من خلال الوريد الذيل. المتلقي هو البارابيونة الأخرى، التي لا تتلقى الجلوكوز مباشرة.
   7. تنظيف اللّزوبة مع iodophor. قطع أطفأ الفئران المانحة والمتلقية بمقص وجمع قطرة دم في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن الجلوكوز (دقيقة و5 دقيقة و10 دقيقة و15 دقيقة و20 دقيقة و30 دقيقة و40 دقيقة و50 دقيقة و60 دقيقة). قم بإزالة جلطة الدم في كل نقطة زمنية للجمع لتجنب المزيد من الضرر.
      ملاحظة: كان حجم الدم الذي تم جمعه 10-25 ul لاختبار واحد، و 90-225 ul في المجموع.
   8. التنقيط الدم في مركز شرائط اختبار الجلوكوز للكشف عن مستوى الجلوكوز.
2. استخدام كونترستين الأزرق ايفان كتحكم إيجابي³.
   1. حقن 200 ميكرولتر من 0.5٪ الأزرق إيفان مضادة للبقع داخل داخل الفأر المانحة.
   2. 2 ساعة في وقت لاحق, القتل الرحيم البارابيوتر عن طريق الحقن داخل البريكنتال من 20 ز/لتر 2,2,2,2-تريبروموثانول لكل فأر بتركيز 0.2 مل/10 غرام, وجمع الدم من كل من الباربايوينت عن طريق ثقب القلب.
   3. الطرد المركزي عينات الدم في 916 x ز لمدة 15 دقيقة.
   4. جمع المصل من supernatant.
   5. تمييع المصل مع 0.9٪ NaCl في 1:50.
   6. قياس امتصاص عينات المصل المخفف في 620 نانومتر مع مطياف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في ستة فئران متبرعة، ارتفعت مستويات السكر في الدم بشكل حاد إلى 26.5 ميكرومول/لتر (زيادة 173%) بمعدل دقيقة واحدة بعد حقن 100 ميكرولتر من الجلوكوز (1.2 جرام/كغ) عبر وريد الذيل ثم انخفضت تدريجياً إلى 13.3 ميكرومول/لتر عند 60 دقيقة. في الفئران المتلقية، زاد مستوى السكر في الدم ببطء بعد ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Parabiosis يشير إلى التقنية الجراحية لربط اثنين من الحيوانات الحية لإنشاء نظام الأوعية الدموية المشتركة بالوسائل التجريبية^6،7،8. ميزة هذا النموذج هو أن المواد التي تنتجها فرد واحد يمكن أن تعمل على كل من الحيوانات في نفس الوقت. وهكذا، يمكن استخ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#