카달 정맥 포도당 주사에 의한 파라바이오틱 마우스의 공유 혈액 공급 확립 감지

요약

여기에서 우리는 포도당의 꼬리 정맥 주입을 통해 2개의 parabionts의 공유 혈액 순환의 성공적인 설치를 검출하는 새로운 방법을 기술합니다, 이는 최소한의 손상을 일으키는 원인이 되고 parabionts에 치명적이지 않습니다.

초록

파라바이오시스는 신체의 세로 축을 따라 두 마리의 평행 동물을 외과적으로 결합시키는 실험적인 방법입니다. 우리는 포도당의 꼬리 정맥 주입에 의하여 parabionts에 있는 혈액 키메증의 성공적인 설치를 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 파라바이오틱 마우스를 시공하였다. 포도당은 꼬리 정맥을 통해 기증자 마우스에 주입되었고, 혈당 수치의 변동은 서로 다른 시점에서 혈액 글루컴터를 사용하여 두 마우스모두에서 측정되었다. 우리의 결과는 포도당 주입 후에, 기증자 마우스에 있는 혈액 포도당 수준이 1 분 후에 급격하게 증가하고 그 후에 천천히 감소한다는 것을 보여주었습니다. 한편, 수용자 마우스의 혈당 수준은 주사 후 15분 만에 정점을 찍었다. 유사한 결과 에반스 블루와 함께 얻은, 포도 당에 대 한 긍정적인 제어로 사용. 혈액 포도당 수준의 동기 변동은 두 마우스 사이의 혈류가 성공적으로 확립되었다는 것을 나타냅니다.

서문

파라바이오시스는 두 개의 살아있는 유기체가 외과적으로 결합되어 공유^{순환계통1을}가진 단일 생리시스템으로 발전하는 모델링 방법이다. 이러한 모델은 한 개인에 의해 생성된 물질이 공유 순환 계통을 통해 동시에 두 동물에 작용할 수 있다는 이점 때문에 생리학을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다. 1800년대 중반 폴^버트(PaulBert 2)가 파라바이오틱 실험을 개척한 이래, 파라바이오틱 모델을 만드는 방법이 표준화되었다. 그러나 혈액 키메라의 성공적인 확립을 확인하는 간단하고 편리한 방법이 누락되었습니다. 교차 순환은 0.5% 에반스 청색 염료를 파라비오엔트 중 하나에 주입한 후 마이크로플레이트 판독기를 가진 두 파라비오트의 혈액에서 에반스 블루의 흡광도를 측정함으로써 성공적으로 평가될 수 있다고 보고되었다^3. 또 다른 방법은 각 파라비올트에 CD45.1⁺및 CD45.2⁺-표지된 단핵구를 포함하는 특정 마우스 품종을 필요로 한다. 세포 세포측정은 비장 또는 혈액^4에서단핵구에 있는 2개의 마커의 주파수를 측정하여 혈액 키메라증을 결정하기 위하여 그 때 이용됩니다. 그러나, 이러한 방법은 종종 동물에게 치명적이거나 번거롭고, 파라바이오틱 모델의 신속하고 신뢰할 수 있는 검증을 위한 안전하고 간단한 방법이 매우 바람직하다. 이 연구에서는, 우리는 이 목적을 위한 새로운 방법을 설치했습니다, 이는 parabiosis의 마우스 모형에서 검증되었습니다. 꼬리 정맥에서 가져온 혈액 샘플의 포도당 농도는 글루컴터를 사용하여 측정되며, 기증자 및 수용자 마우스의 포도당 수준 변화 패턴은 순환 키메라의 표시로 간주됩니다. 우리는이 방법을 "포도당 변동 방법"이라고 명명했습니다. 이 검증 방법의 적용은 마우스에 한정되지 않지만 포도당 대사의 심각한 dysregulation을 가진 사람들을 제외하고 다양한 병리학 적 모델로 확장 될 수있다. 절차는 간단하고, 시간을 절약하고, 안전합니다.

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프로토콜

동물과 그들의 배려를 관련시키는 모든 절차는 하얼빈 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

참고: 이 방법에 필요한 도구와 장비는 재료 표에나열되어 있습니다.

1. 재료 및 동물의 준비

1. 표준 실험실 동물 공급 업체에서 20 g-25 g 사이의 무게를 가진 C57BL/6 남성 마우스를 주문하십시오.
2. 12 시간 빛의 주기에 마우스를 집: 물과 음식에 광고 libitum 액세스와 24-26 °C에서 12 시간 어둠.

2. 파라바이오시스

1. 0.1 mL/10 g의 농도로 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol의 복강 내 주사로 마우스를 마취.
2. 안구 건조를 방지하기 위해 Q-tip으로 안과 연고를 바르십시오.
3. 앞서 설명한 대로 파라바이오시스 절차를^수행5.
   1. 마우스를 척추 위치에 놓습니다. 한 마우스의 왼쪽과 다른 마우스의 오른쪽을 전기 면도기로 무릎 아래 1cm까지 팔꿈치 위 약 1cm에서 시작하십시오. 제모 크림을 사용하여 면도한 피부의 털을 완전히 지웁히 치웁습니다.
   2. 요오드도프로 면도 부위를 닦으소서. 생쥐를 멸균 패드로 덮은 가열된 패드에 놓습니다.
   3. 각 동물의 면도면에 날카로운 가위를 사용하여 팔꿈치 위 0.5cm에서 무릎 관절 아래 0.5cm까지 세로 피부 절개를 만듭니다.
   4. 절개 후 피하 근막으로부터 피부를 부드럽게 분리합니다.
   5. 파라비올라논과 무릎을 3-0 봉합사와 연결합니다.
   6. 연속 5-0 봉합과 면도 피부를 봉합.
4. 탈수를 방지하기 위해 각 마우스에 0.5 mL의 0.9 % NaCl을 피하로 주입하십시오.
5. 트라마돌 (10 mg / 25 g / 일)을 각 마우스에 심근으로 주입하여 통증을 완화하십시오.

3. 순환 키메라의 유효성 검사

1. 포도당 변동 방법
   참고 : 파라 바이오시스 수술 후 10 일째에 포도당 변동 방법 (금식 없음)을 사용하여 파라비오인 사이의 순환 키메라의 성공적인 건설을 확인하십시오.
   1. 0.1 mL/10 g의 농도로 각 마우스에 20 g/L 2,2,2 트리브로모에탄올을 주입하여 파라비오엔트체를 마취시다.
   2. 정맥 시각 마우스 꼬리 고정기에서 기증자 마우스를 수정합니다.
   3. 꼬리를 청소하고 혈관을 팽창하기 위해 70-75 % 알코올에 담근 면봉으로 parabiont의 꼬리 중 하나의 측면에 꼬리 정맥을 문질러.
   4. 오른손에 포도당을 포함하는 1.0 mL 주사기를 잡고 바늘을 정맥 (15° 미만)에 평행하게 유지하십시오.
   5. 꼬리 끝에서 약 2-4cm 떨어진 위치에 바늘을 삽입합니다.
   6. 10s 이내 기증자에 포도당 (1.2 g/kg)의 100 μL를 주입하십시오.
      참고: 용어 기증자는 꼬리 정맥을 통해 포도당 주입을 수신하는 parabiont를 나타납니다. 수령인은 포도당을 직접 수신하지 않는 그밖 parabiont입니다.
   7. 요오드도프로 발가락을 청소합니다. 가위로 기증자 및 수용자 마우스의 발가락을 잘라 내고 포도당 주입 후 다른 시점에서 혈액 한 방울을 수집합니다 (1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 및 60 분). 더 많은 피해를 피하기 위해 각 수집 시점에서 혈전을 제거하십시오.
      참고: 수집된 혈액의 부피는 1회 검사에 대해 10-25 ul, 총 90-225 ul이었다.
   8. 포도당 수준 검출을 위한 글루컴터 시험 스트립의 중앙으로 혈액을 적물.
2. 에반의 파란색 카운터스테인을 포지티브 컨트롤^3으로사용하십시오.
   1. 200 μL의 0.5% 에반의 청색 카운터스테인을 복강내 마우스에 주입합니다.
   2. 2 시간 후, 복강 내 주입에 의해 파라비오엔트 20 g/L 2,2,2-트리브로모에탄올을 각 마우스에 0.2 mL/10 g의 농도로 안락사시키고, 심장 천자에 의해 두 파라비온제로부터 혈액을 수집한다.
   3. 15 분 동안 916 x g에서 혈액 샘플을 원심 분리합니다.
   4. 상급에서 혈청을 수집합니다.
   5. 1:50에 0.9% NaCl로 세럼을 희석합니다.
   6. 분광광도계로 620 nm에서 희석 된 혈청 샘플의 흡광도를 측정합니다.

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결과

6명의 기증자 마우스에서, 혈액 포도당 수준은 꼬리 정맥을 통해포도당 (1.2 g/kg)의 100 μL의 주입 후에 1 분의 평균에서 26.5 μmol/L (173% 증가)로 급격히 증가한 다음 60 분에 13.3 μmol/L로 점차적으로 감소했습니다. 수용자 마우스에서, 혈액 포도 당은 주입 후 천천히 증가하고 15 분 (47 % 증가, 12.2 μmol / L)에서 첫 번째 피크 수준에 도달했습니다. 상기 결과에 기초하여, 순환 키메?...

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토론

파라바이오시스는 실험수단^6,7,8에의해 일반적인 혈관시스템을 확립하기 위해 두 마리의 살아있는 동물을 연결하는 외과적 기법을 말한다. 이 모델의 장점은 한 개인이 생산한 물질이 동시에 두 동물에 작용할 수 있다는 것입니다. 따라서, 파라바이오시스 모델은 관련 질환에서 물질 또는 요인의 역할을 탐구하는데 사용될 수 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#