JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الورقة بروتوكولات تقييم استجابة تفه و GC B في نموذج الماوس للعدوى بفيروس الإنفلونزا.

Abstract

T مُساعد الجريب (Tfh) الخلايا هي مجموعة فرعية مستقلة من الخلايا CD4+ T متخصصة في تقديم المساعدة لتطوير مركز الجراثيم (GC) وتوليد الأجسام المضادة عالية التقارب. وفي عدوى فيروس الأنفلونزا، يتم حث استجابات خلايا تفه وGC B القوية لتسهيل القضاء الفعال على الفيروس، مما يمنح نموذج فأر مؤهل للدراسة المرتبطة بـ Tfh. في هذه الورقة، وصفنا البروتوكولات في الكشف عن الاستجابة المناعية الأساسية المرتبطة بـ Tfh أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا لدى الفئران. وتشمل هذه البروتوكولات: تلقيح فيروس الأنفلونزا داخل الأنف؛ ولقاح فيروس الأنفلونزا؛ ولقاح فيروس الأنفلونزا؛ واللقاحات واللقاحات؛ واللقاحات واللقاحات؛ تدفق التلطخات للخلايا وتحليل خلايا التفح الفارقة البولي كلينال ومضاد خاص, GC B الخلايا والخلايا البلازما; الكشف المناعي من الفلوروس؛ إنزيم مرتبط بالمناعة (ELISA) من الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا في المصل. هذه المقايسة أساسا كمي التمايز و وظيفة خلايا تف في عدوى فيروس الأنفلونزا، وبالتالي توفير المساعدة للدراسات في توضيح آلية التمايز واستراتيجية التلاعب.

Introduction

في العقد الأخير، ركزت العديد من الدراسات على مجموعة CD4+ T الخلية الفرعية التي تم تحديدها حديثًا، مجموعة الخلايا Tfh الفرعية، لأدوارها الأساسية في تطوير مركز الجراثيم (GC) B. B سرطان الغدد الليمفاوية الخلية 6 (Bcl6), الذي يعتبر أساسا ككبوت الجينات, هو عامل تحديد النسب من خلايا تف للدليل على أن التعبير خارج الرحم من Bcl6 كافية لدفع التمايز تف بينما نقص Bcl6 النتائج في التمايز تف اختفت1,2,3. على عكس مجموعات فرعية أخرى من المساعد CD4+ T تؤدي وظيفتها المؤثرة عن طريق الترحيل إلى مواقع الالتهاب ، توفر خلايا التف خلية B المساعدة بشكل رئيسي في منطقة الخلية B الجريبة من الطحال والعقدة الليمفاوية. الجزيئات المشتركة المحفزة ICOS و CD40L، تلعب أدوارا هامة في التفاعل بين خلايا Tfh و GC B. خلال التمايز Tfh، ICOS ينقل الإشارات الضرورية من الخلايا B cognate وأيضا بمثابة مستقبل استقبال إشارات الهجرة من خلايا المارة B لتوطين منطقة الخلية B4،5. CD40L هو وسيط من الإشارات من خلايا Tfh لتكاثر الخلايا B والبقاء6. عامل آخر يلعب دور مماثل كما CD40L هو cytokine IL21، الذي يفرز أساسا من قبل خلايا تف. IL21 ينظم مباشرة GC B تطوير الخلايا وإنتاج الأجسام المضادة عالية التقارب، ولكن دورها في التمايز Tfh لا يزال مثيرا للجدل7،8. PD-1 و CXCR5، والتي هي الآن الأكثر استخداما في تحديد خلايا تف في تحليل تدفق الخلايا، كما تلعب أدوارا هامة في التمييز وظيفة هذه المجموعة الفرعية. CXCR5 هو مستقبلات من B الخلية chemokine الجريب ويتوسط توطين خلايا تف في بصيلات الخلية B9. تم تحديد PD-1 الآن ليس فقط أن يكون لها وظيفة التوجيه الجريب ولكن أيضا إرسال إشارات حاسمة في عملية GC B خلايا تقارب النضج10. وبناء على هذه النتائج، فإن تقييم التعبير عن هذه الجزيئات يمكن أن يعكس أساسا نضوج ووظيفة خلايا التف.

GC هو بنية ميكرو مجهرية مستحثة في الأعضاء اللمفاوية الثانوية وتعتمد بشكل كبير على خلايا التنفّس، وبالتالي كونها قراءة مثالية لتقييم استجابة Tfh. في GC، بعد تلقي إشارات بوساطة السيتوكينات والجزيئات المشتركة المحفزة، تخضع الخلايا B لتحول الطبقة والتبدل الجسدي لتوليد أجسام مضادة عالية التقارب11. يحدث تبديل فئة الأجسام المضادة التفاضلية في مكانة السيتوكين التفاضلية ، والتي IL4 و IL21 تحفز IgG1 فئة التبديل بينما IFNγ يدفع IgG2 فئة التبديل12. خلايا البلازما هي منتجي الأجسام المضادة المفرزة وخلايا متمايزة بشكل نهائي. مثل خلايا تف، ويرتبط تطوير الخلايا B في GC مع التعبير الديناميكي من العديد من الجزيئات الهامة. استنادا إلى الدراسة الحالية، يمكن التعرف على خلايا GC B كما B220+السلطة الوطنية الفلسطينية+فاس+ أو B220+GL7+فاس+ الخلايا والخلايا البلازما، بالمقارنة مع السلائف، والتعبير downregulate من B220 و upregulate CD138 التعبير13. والأكثر من ذلك، يمكن اكتشاف كل من هذه الخصائص في تحليل قياس تدفق التحاليل والتحاليل المناعية، وبالتالي يتم التقييم المناسب لاستجابة GC.

يتم حث الردود الخلوية والخلطية القوية في عدوى فيروس الأنفلونزا ، مع خلايا Tfh وTh1 التي تهيمن على CD4+ T الخليةاستجابة 14، مما يجعلها نموذجًا مثاليًا لدراسة تمايز خلايا Tfh. الأنفلونزا A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8)، وهي سلالة يشيع استخدامها في استخدام الماوس، وكثيرا ما تستخدم في هذه الدراسة14،15،16. هنا، نحن وصف بعض البروتوكولات الأساسية من فحص دراسة تف ذات الصلة في عدوى فيروس الأنفلونزا: 1) التلقيح داخل الأنف من فيروس PR8; 2) الخلايا Tfh مستضد محددة، GC B وخلايا البلازما والكشف IL21 مع تدفق الخلايا الجذعية؛ 3) التصور النسيجي للGC؛ 4) الكشف عن الأجسام المضادة للجسم المستضد محددة في مصل الدم مع ELISA. وتوفر هذه البروتوكولات التقنيات اللازمة للباحثين الجدد في الدراسة المرتبطة بـ Tfh.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات التابعة لـ Institut Pasteur في شنغهاي بالصين على التجارب على الحيوانات. وقد أجريت جميع التجارب استنادا إلى بروتوكولات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها التي وافقت عليها لجنة.

ملاحظة: ينبغي أن يتم تنفيذ العدوى الفيروسية الفئران وعزل الأعضاء تحت شرط ABSL2.

1. تلقيح فيروس انفلونزا PR8 وتسجيل وزن الفئران

  1. إعداد 8 أسابيع الذكور C57BL/6 الفئران للعدوى في غرفة ABSL2.
    ملاحظة: هذا البروتوكول هو أيضا مناسبة في التجارب مع الفئران الإناث.
  2. تخفيف فيروس PR8: إخراج الفيروس من -80 درجة مئوية الفريزر واحتضان على الجليد حتى يذوب في السائل. دوامة فيروس المخزون جيدا وتمييع الفيروس إلى 2 PFU / μL مع المالحة المعقمة الفوسفات المخزن (PBS، 135 mM NaCl، 2.7 mM KCl، 10 mM Na2HPO4، 1.8 mM KH2PO4) في أنبوب 1.5 مل ما قبل المبردة.
  3. ازن الماوس تخدير: وزن كل فأرة وحساب حجم (4 أضعاف (μL) وزن الفأرة (ز)) من بينتوبربيتال الصوديوم (2 ملغ / مل) لاستخدامها. حقن الحجم المحسوب من بينتوباربيتال الصوديوم intraperitoneally.
    ملاحظة: هذه الخطوة هي جعل الفئران تتنفس باطراد وسلمي، بحيث يمكن تلقيح تتر دقيق للفيروس داخل الفم. تشير ضربات القلب السريعة أو البطيئة إلى تخدير غير مناسب. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام مرهم الطبيب البيطري لتجنب جفاف العين.
  4. التلقيح داخل الأنف: دوامة فيروس PR8 المخفف بدقة. Pipet 10 μL وأداء بعناية التلقيح داخل الأنف على جانب واحد قطرة قطرة. بعد الانتهاء من التطعيم من جميع الفئران في قفص واحد (الحد الأقصى 5 الفئران) على هذا الجانب، وتكرار التطعيم على الجانب الآخر (الحفاظ على التنفس من الماوس السلمية وثابتة من خلال التطعيم). يصاب كل فأرة مع 40 PFU من فيروس PR8 في المجموع.
  5. وضع الفئران في إعادة شغل القص في أقفاص دافئة لإحياء أفضل.
  6. مراقبة وزن الماوس يوميا لمدة 10 أيام. (يتم تسجيل يوم العدوى كـ اليوم 0).

2. عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال والعقدة الليمفاوية الوسيطة (mLN)

  1. القتل الرحيم الماوس: وضع الفئران في غرفة صغيرة والقتل الرحيم الفئران عن طريق ضخ في CO2 سلميا من الجزء السفلي من الغرفة. إخراج الفئران عندما لا تتحرك وتؤدي خلع عنق الرحم لضمان وفاة الفئران تماما. تراجع الفئران مع 75٪ الإيثانول ونقلها إلى غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية.
  2. قم بشل حركة الفئران بإبر تشريح على لوحة رغوة التشريح المغطى بالرق الماصة. قطع الجلد على طول خط الوسط البطني والساقين الخلفيتين مع مقص تشريح وتمتد الجلد مع ملاقط. شل حركة الجلد الممدد بإبر تشريح.
  3. إعداد اثنين من أطباق 6 سم لكل فأرة والاحتفاظ بها على الجليد. وضع مصفاة 70-μm خلية في كل طبق وإضافة 5 مل من DMEM تكملها مع 1٪ مصل الأبقار الجنين (DMEM (1٪ FBS))
  4. العزل الطحال: قطع الصفاق لفضح تجويف البطن مع مقص تشريح. خذ الطحال وضعه في الطبق المعد.
  5. mLN العزلة: قطع الحجاب الحاجز والجزء السفلي من القفص الضلع إلى محيط الغدة الصعترية. سحب الضلع جانبا ودبابيس مع الإبر تشريح لفضح تجويف الصدر. اسحب الرئة جانباً إلى الجانب الأيمن واستخدم ملاقط لأخذ mLN، تحت القلب وبالقرب من الجانب البطني من القصبة الهوائية.
  6. وضع mLN في طبق المعدة.
  7. الحصول على تعليق خلية واحدة: شبكة الطحال أو mLN بلطف مع المكبس من حقنة 3 مل من خلال مصفاة خلية 70-μm. شطف مصفاة الخلية مع 1 مل من DMEM الطازجة (1٪ FBS). إعادة تعليق الخلية ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 مل.
  8. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية في 350 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة فائقة وإضافة 1 مل من DMEM (1٪ FBS).
  9. Resuspend بيليه الخلية مع 1 مل ماصة بدقة. إضافة 4 مل من DMEM (1٪ FBS) في تعليق خلية الطحال والاحتفاظ بها على الجليد للعمليات التالية.
    ملاحظة: من الضروري إعادة تعليق بيليه الخلية مع 1 مل من المتوسط أولا، وليس 5 مل، لعزل الخلايا الفردية تماما من بيليه.
    من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن تنفيذ جميع العمليات في المختبر العادي.
  10. عد خلية الطحال
    1. خلايا إعادة الانتفير عن طريق تحويل الأنابيب صعودا وهبوطا لعدة مرات. خذ 10 ميكرولتر إلى 90 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة (10 mM تريس-HH 7.5، 155m NH4Cl). احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق وإضافة 900 μL من برنامج تلفزيوني الباردة لإنهاء التفاعل.
    2. جهاز طرد مركزي في 400 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة فائقة. Resuspend مع 100 μL من برنامج تلفزيوني الباردة. تأخذ 10 ميكرولتر من الخلايا إلى 10 ميكرولتر من 0.4٪ ث / v trypan الأزرق واتخاذ 10 ميكرولتر من الخليط لعد الخلايا مع قياس الهيموسيت.
    3. الحساب: حساب الخلايا كطريقة عادية. باختصار، عد أرقام الخلايا في اثنين من المربعات الزاوية قطري على قياس ال hemocytometer والحصول على N1، N2 لكل مربع الزاوية. يجب حساب تركيز الخلية من تعليق الخلية 5 مل كما (N1 + N2) / 2 × 104 / مل.

3. المناعة من خلايا متعددة النخلة مع PD-1 و CXCR5

  1. تلطيخ مع الأجسام المضادة للبيوتين المضادة CXCR5.
    1. تعليق الخلية ريسوسينيد عن طريق تحويل أنبوب صعودا وهبوطا. خذ 2 × 106 خلايا في أنبوب FACS وأضف 2 مل من مخزن البقع (PBS (1٪ FBS، 1 mM EDTA)). غسلها من قبل دوامة على جهاز التذبذب دوامة.
    2. جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الماحشة عن طريق صب السائل وتراجع أنبوب الفم على ورقة ماصة مرتين.
    3. تخفيف بيليه الخلية مع السائل بقايا عن طريق التنصت على الجزء السفلي من أنبوب. وضع أنبوب في حامل أنبوب على الجليد.
      ملاحظة: حجم السائل بقايا حوالي 25 ميكرولتر.
    4. إضافة 0.2 μL من المضادة للماوس CD16/CD32 (Fc-مستقبلات مانع) لكل أنبوب. دوامة عن طريق التنصت على أسفل أنبوب بلطف واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: إعداد خليط الأجسام المضادة لعينات متعددة عن طريق التخفيف مع 5μL من مخزن البقع لكل أنبوب. وينبغي إعداد وصفة للخليط عن طريق تخفيف (n/10+1) × 0.2 ميكرولتر Fc-مستقبلات مانع في (n/10+1) × 5 ميكرولتر تلطيخ العازلة وإضافة 5.2 ميكرولتر المخلوط في كل أنبوب.
    5. إضافة 0.3 μL من الماوس المضادة البيوتين CXCR5 في بقايا 30 ميكرولتر من تلطيخ العازلة لكل أنبوب ودوامة عن طريق التنصت على أسفل الأنبوب.
      ملاحظة: تحضير الخليط كما هو موضح في الخطوة 3.1.4.
    6. احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة مع خلايا resuspending بلطف عن طريق التنصت على أنبوب في 30 دقيقة.
      ملاحظة: دوامة في 30 دقيقة هو لتجنب مجاميع الخلية لتلطيخ أفضل.
    7. إضافة 2 مل من البقع العازلة ودوامة على جهاز تذبذب دوامة. أجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق كما هو موضح في الخطوة 3.1.2. دوامة عن طريق التنصت على أنبوب واحتضان على الجليد لتلوين اللاحقة.
  2. تلطيخ مع علامات سطح أخرى.
    1. إعداد خليط الأجسام المضادة (الجدول 1) كما هو موضح في الخطوة 3-1-4.
    2. إضافة خليط الأجسام المضادة في كل أنبوب. دوامة عن طريق التنصت على أسفل أنبوب واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. غسل الخلايا مع 2 مل من البقع العازلة. جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. تجاهل عظمى وإضافة 400 ميكرولتر من البقع العازلة. دوامة الأنبوب على جهاز تذبذب دوامة والحفاظ على أنبوب في الظلام حتى تدفق تحليل القياسات.

4. المناعة من فيروس PR8 الأنفلونزا خلايا Tfh محددة NP

ملاحظة: هذا البروتوكول من تلطيخ خلايا Tfh NP محددة هو من الدراسات السابقة15,17.

  1. تنفيذ تلوين البيوتين-CXCR5 كما هو موضح في الخطوة 3.1 إلا أن عدد الخلايا التي اتخذت لتلطيخ هو 3 × 106 للخلايا المضادة الخاصة بما فيه الكفاية ليتم تسجيلها في تدفق القياس الخلوي.
  2. إضافة 0.3 ميكرولتر من APC-مترافق- IAbNP311-325 MHC الفئة II (NP311-325)رباعي في الأنبوب من 3.1.7. إعداد الخليط لعينات متعددة كما في الخطوة 3-1-4
    ملاحظة: من المهم وصمة التترامير قبل إضافة الأجسام المضادة CD4 كما الربط بين الأجسام المضادة CD4 ومضادة لـ CD4 سوف تتداخل مع تلطيخ tetramer الأمثل.
  3. Resuspend خليط الخلية عن طريق النقر بلطف على الأنبوب واحتضانه في الظلام في RT لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: تغطية ورقة مبللة على فم الأنابيب لتقليل التبخر
  4. إضافة خليط من علامات سطح أخرى(الجدول 1)ومواصلة الحضانة في RT لمدة 30 دقيقة.
  5. غسل الخلايا وإعادة تعليقها كما هو موضح في الخطوتين 3.2.3 و3.2.4.

5. مناعة من Bcl6 في خلايا الزهة البولي كلينال

  1. أداء علامات السطح (الجدول 2) تلطيخ كما هو موضح في القسم 3 إلا أن غسل الماضي مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، بدلا من تلطيخ العازلة.
  2. جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الكريات الخلية فائقة و resuspend عن طريق النقر بلطف أسفل الأنبوب.
  3. إضافة 300 ميكرولتر من 3.7٪ حل الفورمالديهايد (المخفف من 37٪ الفورمالديهايد مع برنامج تلفزيوني) في أنبوب لتثبيت الخلية. دوامة على جهاز تذبذب دوامة واحتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
  4. إضافة 2 مل من مخزن البقع للغسيل والطرد المركزي عند 500 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من الخلايا الفائقة والمرتدة عن طريق النقر بلطف على الأنبوب.
  5. إضافة 300 μL من 0.2٪ تريتون X 100 والخلايا resuspend من قبل دوامة على جهاز تذبذب دوامة. احتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
  6. إضافة 2 مل من مخزن البقعة للغسيل. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الخلايا الفائقة و resuspend عن طريق النقر بلطف أسفل الأنبوب.
  7. أضف 1.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة PE-المضادة Bcl6 لكل أنبوب. التنصت بلطف أسفل أنبوب لإعادة تعليق الخليط واحتضان في RT لمدة 2 ساعة مع النقر بلطف على الأنبوب كل 30 دقيقة.
    ملاحظة: تغطية ورقة مبللة على فم الأنابيب لتقليل تبخر الخليط.
  8. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 0.01٪ تريتون X 100 في الأنبوب. دوامة وطاردة مركزية عند 500 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجة مئوية.
  9. كرر الغسيل كخطوة 5.8. خلايا إعادة النيامد مع 400 ميكرولتر من عازلة تلطيخ. إبقاء الخلايا في الظلام على الجليد حتى تحليل تدفق العمليات.

6. تلطيخ داخل الخلايا من IL21

  1. تحفيز الخلايا مع PMA (phorbol 12-myristate 13-خلات) والأيونوميسين.
    1. خذ 2 × 106 خلايا من نظام التعليق الخلوي والطرد المركزي عند 350 × ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه الخلية الفائقة و resuspend مع 500 ميكرولتر من خلية تي كاملة المتوسطة. نقل الخلايا إلى لوحة 24-جيدا.
    2. إضافة 20 PMA 20 و 2 ميكرومول أيونوميسين في 500 ميكرولتر من18 متوسطة كاملة وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
    3. إضافة حل المعدة في الخطوة 6.2 في تعليق الخلية في لوحة 24-well ومزيج عن طريق هز لوحة. إعداد التحكم غير المنشط بإضافة 500 ميكرولتر خلية كاملة متوسطة دون إضافة PMA والأيونوميسين في الخلايا. احتضان في حاضنة CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    4. إضافة 10 ميكرومول BFA (Brefeldin A، حل مع الميثانول) في كل بئر لمنع جهاز غولجي توسط نقل البروتين. وضع لوحة العودة إلى حاضنة الخلية واحتضان لمدة 2 ساعة.
  2. تنفيذ تلطيخ علامة سطح الخلية.
    1. خلايا إعادة بناء عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ونقل الخلايا إلى أنبوب FACS. إضافة 1 مل من عازلة تلطيخ في أنبوب والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية.
    2. أداء Fc-مستقبلات تلطيخ كتل كخطوة 3.1.4.
    3. تنفيذ علامات سطح الخلية تلطيخ (الجدول 3) كما هو موضح في الخطوات 3.2.1 إلى 3.2.3 باستثناء خلايا الغسيل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
    4. جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الخلايا الفائقة و resuspend عن طريق النقر على أسفل الأنبوب.
  3. إضافة 0.2 μL من الكاشف من حية / الميت قابل للإصلاح أكوا خلية الميت تلطيخ عدة واحتضان أنبوب في الظلام في RT لمدة 10 دقيقة لأداء تلطيخ الخلايا الميتة.
  4. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب ودوامة على جهاز تذبذب دوامة. جهاز طرد مركزي في 350 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق.
  5. تنفيذ تثبيت الخلية كما هو موضح في الخطوتين 5.3 و 5.4.
  6. إضافة 300 μL من البقع العازلة لالخلايا resuspend وتخزين الأنابيب في ثلاجة 4 ° C بين عشية وضحاها. جهاز طرد مركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية لإزالة فائقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة قد يكون حذف ثم متابعة الخطوة 6.7 مباشرة بعد الخطوة 6.5.
  7. إضافة 1 مل من العازلة سابونين (تلطيخ العازلة تكملة مع 0.2٪ (ث / الخامس) سابونين) في أنبوب ودوامة على جهاز تذبذب دوامة. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة لتنفيذ permeabilization الخلية.
  8. جهاز طرد مركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق.
  9. إضافة 0.5 μL من مستقبلات FC-IL21 الإنسان في كل أنبوب. إعداد خليط الأجسام المضادة لعدة خطوة كخطوة 3.1.4 إلا أن تخفيف الأجسام المضادة مع العازلة السابونين بدلا من تلطيخ العازلة.
  10. احتضان في RT لمدة 1 ساعة مع النقر بلطف أسفل الأنبوب للخلايا ريسوسنيد في 30 دقيقة.
  11. إضافة 2 مل من العازلة سابونين لغسل الخلايا والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق. تخلص من الغسل الفائق والتكرار مرة واحدة.
  12. إضافة 0.1 μL من APC-المضادة للإنسان Ig (H + L) في كل أنبوب. إعداد خليط لعينات متعددة كخطوة 3.1.4 إلا أن تخفيف الأجسام المضادة مع العازلة السابونين بدلا من تلطيخ العازلة.
  13. احتضان العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة وغسل كخطوة 6.11.
  14. خلايا إعادة النيامد مع 400 ميكرولتر من عازلة تلطيخ. إبقاء العينة في الظلام على الجليد حتى تحليل تدفق القياسات.

7. GC B وخلايا البلازما تلطيخ

  1. اتخاذ الخلايا وتنفيذ الأجسام المضادة المضادة للمستقبلات Fc تلطيخ كخطوات من 3.1.1 إلى 3.1.4.
  2. أداء علامات السطح تلطيخ (الجدول 4) كخطوات من 3.1.5 إلى 3.1.7 إلا أن وقت الحضانة هو 30 دقيقة بدلاً من 1 ساعة.
  3. خلايا إعادة النيامد مع 400 ميكرولتر من عازلة تلطيخ. إبقاء العينات في الظلام على الجليد حتى تحليل تدفق القياسات.

8. عزل المصل من الدم

  1. في اليوم 14 بعد العدوى (d.p.i 14) ، وجمع الدم من وريد الوجه والحفاظ على عينات الدم في ثلاجة 4 °C بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: تنفيذ جمع الدم في شرط ABSL2 ومن هذه الخطوة فصاعداً يمكن تنفيذ كافة الإجراءات في المختبر العادي.
  2. جهاز طرد مركزي الدم في 400 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. عزل المصل مع ماصة 200 ميكرولتر بعناية لتجنب تلوث الخلايا الحمراء. Aliquot في 3 أنابيب لكل عينة وتخزينها في -80 درجة مئوية.

9. مقايسة من الأجسام المضادة HA محددة تتر مع ELISA

  1. معطف ELISA لوحات مع 50 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل هه حل البروتين في البئر واحتضان لهم في 4 ° C ثلاجة بين عشية وضحاها.
  2. غسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني المخفف 0.05٪ توين (PBST). إضافة 100 ميكرولتر من PBST المخفف 5٪ الحليب منزوع الدسم في كل بئر واحتضان في RT لمدة 2 ساعة لمنع الربط غير محدد.
  3. تخفيف واحتضان المصل: إعداد 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني كما عازلة التخفيف. تمييع المصل في عازلة التخفيف كما 1:50, 1:150, 1:450, ...... إلى 1:36450 (يوصى بتخفيف المسلسل 3 أضعاف). أضف 50 ميكرولتر من المصل المخفف لكل بئر وحضن في الثلاجة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  4. تخلص من المصل وغسل الآبار بسرعة مرة واحدة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من PBST في كل بئر (اهزها بهدوء ، ثم تجاهلها). ثم غسل ببطء لوحات على شاكر مع 200 ميكرولتر من PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل من.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من مضادة هدبة مضادة الثانوية محددة لIgG مجموع، IgM، IgG1، IgG2b، IgG2c (1:5000، مخففة مع PBST) واحتضان في RT لمدة 1 ساعة. غسل لوحات من قبل PBST كما هو موضح في 9.4.
  6. قم بأخذ حجم مساوٍ من المخزن المؤقت A و Buffer B (TMB) من 4 درجة مئوية التخزين والاحماء لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT قبل الاستخدام. مزيج A وB وإضافة 100 μL من TMB في كل بئر واحتضان لهم لمدة 10-30 دقيقة في RT عن طريق اهتزاز بهدوء.
    ملاحظة: هذا وصف مختصر لـ مجموعة الركيزة TMB Set (BD,555214) يدوي.
  7. ماصة 100 ميكرولتر من 2M H2SO4 في كل بئر لإنهاء التفاعل. قراءة قيمة OD450 من خلال الصك.
  8. تحليل البيانات: الحصول على قيمة OD450 النهائية عن طريق طرح إشارة الخلفية (OD450 قيمة فارغة جيدا). ارسم المنحنى المقابل لنمط ايزوي للأجسام المضادة لكل عينة مع عامل التخفيف على محور X وقيمة OD450 على محور ص.

10. علم الأنسجة

  1. عزل الطحال في d.p.i 10. إصلاحها في 3.7٪ حل الفورمالديهايد ل 1 ح في RT. تجاهل العازلة التثبيت وغسل مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على شاكر لمدة ثلاث مرات.
  2. يجفف الطحال في PBS (10٪ سكروز) في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم يجففها في PBS (30٪ سكروز) في 4 درجة مئوية مع اهتزاز بهدوء حتى تغرق الطحالات إلى أسفل أنبوب 15 مل.
  3. أخرج الطحال المجففة ، وتضمينها في مركب درجة حرارة القطع الأمثل والمبكوم.
  4. قبل ابرد الأسيتون في -20 درجة مئوية. احتضان أقسام الأنسجة مع الأسيتون المبردة مسبقا لمدة 10 دقائق. اغسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث مرات.
  5. Permeabilize أقسام الأنسجة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة وغسلها لمدة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  6. منع الربط غير محددة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي (العازلة منع) لمدة 1 ساعة في RT وغسل أقسام الأنسجة مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة.
  7. حظر الربط غير المحدد مع مجموعة حظر STREPTAVIDIN/BIOTIN.
    ملاحظة: لا تدع العينات تجف من هذه الخطوة فصاعداً.
  8. تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية: إضافة منع العازلة المخفف البيوتين السلطة الوطنية الفلسطينية (25 ميكروغرام / مل) والجرذان المضادة للفأرة IGD (2.5 ميكروغرام / مل) على أقسام الأنسجة بعناية. احتضان أقسام الأنسجة في الغرفة الرطبة في 4 درجات مئوية الفريزر بين عشية وضحاها.
  9. اغسل بسرعة أقسام الأنسجة مع PBST مرة واحدة. سرعان ما يغسل أقسام الأنسجة في PBST مع اهتزاز ببطء لمدة 5 دقائق. كرر الغسل ثلاث مرات.
  10. تمييع اليكسا فلور 488-streptavidin (1:500) واليكسا فلور 555- الماعز المضادة الفئران IgG (1:500) الأجسام المضادة مع عازلة حظر وإضافتها إلى أقسام الأنسجة بعناية
  11. احتضان في RT لمدة 1 ساعة.
  12. غسل أقسام الأنسجة كخطوة 10.8 وتتصاعد بعناية مع حل إطالة. تغطية الأنسجة مع الأغطية بعناية والاحتفاظ بها في الظلام عند 4 درجة مئوية حتى تحليل confocal.
  13. تحليل حجم رد فعل GC عن طريق عد أرقام GC لكل حجم المساحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

توصيف اعتلال الماوس في عدوى فيروس الأنفلونزا
بعد عدوى فيروس الأنفلونزا، الفئران هي أقل نشاطا وفقدان الشهية بسبب المرض، والذي ينعكس من قبل فقدان الوزن الشديد، وهو عرض شائع الاستخدام لرصد المراضة الماوس19. كما هو مبين في الشكل 1أ، بدأت الفئر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ونظراً للأدوار المتخصصة في توفير المساعدة في الخلية ب لتوليد أجسام مضادة عالية التقارب، فقد تمت دراسة خلايا الت إفه على نطاق واسع في آليات التمايز والتلاعب لتوفير استراتيجيات جديدة لتصميم اللقاحات. إن عدوى فيروس الأنفلونزا تحفز استجابات خلايا تفه و GC B القوية، وبالتالي فهي نموذج مناسب له...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر موظفي مرفق تدفق استئصال الدراجات ، ومرفق ABSL2 ومرفق الحيوانات SPF من معهد باستور في شنغهاي على مساعدتهم التقنية والمشورة. وقد دعم هذا العمل المنح التالية: برنامج البحوث الاستراتيجية ذات الأولوية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB29030103)، البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFA0502202)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31570886).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6
37% formaldehydeSigmaF1635
Anti-CD16/32 mouseThermo Fisher Scientific14-0161-86
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramerNIH
Bcl-6 PEBiolegend358504clone:7D1
Biotin-CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82clone: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82clone:GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42clone:IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82clone:IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150clone:MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070clone:7E.17G9
PD1 PE/Cy7Biolegend135216clone:29F.1A12
Streptavidin BV421BD Pharmingen563259
Streptavidin PEBD Pharmingen554081
Intracelluar staining of IL21
37% formaldehydeSigmaF1635
anti-human IgGJackson ImmunoResearch Laboratories109-605-098
Brefeldin ASigmaB6542
human FCc IL-21 receptorR&D System
ionomycinSigmaI0634
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kitThermo Fisher ScientificL34966
PMASigmaP1585
SaponinMP102855
GC B and plasma cells staining
B220 APCThermo Fisher Scientific17-0452-81clone:RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070clone:281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7BD Pharmingen557653clone:Jo2
IgD eFluor 450Thermo Fisher Scientific48-5993-82clone:11-26c
PNA FITCSigmaL7381
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA
PR8-HASino Biological11684-V08H
BSASSBC
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
TMB Substrate Reagent SetBD Pharmingen555214
Histology
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgGLife TechnologyA21434
anti-mouse IgDBiolegend405702
biotinylated PNAVector laboratoriesB-1075
dilute Alexa Fluor 488-streptavidinLife TechnologyS11223
normal goat serumSouthernBiotech0060-01
Pro-long gold antifade reagentThermo Fisher ScientificP3630
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kitVector laboratoriesSP-2002

References

  1. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  3. Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  4. Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
  5. Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
  6. Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
  7. Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
  8. Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
  9. Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
  10. Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
  11. Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
  12. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
  13. Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
  14. Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
  15. Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495(2014).
  16. He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
  17. León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
  18. Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
  19. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  20. Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
  21. Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  22. Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
  23. Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
  24. Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160 T A Bcl6 fluorescence

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved