JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем документе описаны протоколы оценки tfh и GC B ответ в мышиной модели инфекции вируса гриппа.

Аннотация

T Фолликулярный помощник (Tfh) клетки являются независимымиCD4 и Т-клеток подмножество специализируется на оказании помощи для развития гермызного центра (GC) и генерации антител высокого сродства. При инфицировании вирусом гриппа для содействия эффективному искоренению вируса индуцируются надежные ответные меры Tfh и GC B, что дает квалифицированную модель мыши для исследования, связанного с Tfh. В этом документе мы описали протоколы в обнаружении основных Tfh связанных иммунного ответа во время инфекции вируса гриппа у мышей. Эти протоколы включают: интраназальная прививка от вируса гриппа; окрашивание цитометрии потока и анализ поликлональных и антиген-специфических клеток Tfh, клеток GC B и плазменных клеток; иммунофлуоресценция обнаружения ДК; связанный с ферментом иммуносорбентный анализ (ELISA) специфических антител вируса гриппа в сыворотке крови. Эти анализы в основном количественно дифференциации и функции Tfh клеток в инфекции вируса гриппа, тем самым предоставляя помощь для исследований в выяснении механизма дифференциации и стратегии манипуляции.

Введение

В последнее десятилетие, многочисленные исследования были сосредоточены на недавно выявленныхCD4 И Т-клеток подмножество, Tfh ячейки подмножество, за его основные роли в зародышевой центр (GC) B развития. B-клеточная лимфома 6 (Bcl6), которая в основном рассматривается как репрессор генов, является определяющим фактором линии клеток Tfh для доказательстватого,что эктопическое выражение Bcl6достаточно,чтобы управлять дифференциацией Tfh, в то время как дефицит Bcl6 приводит к исчезновению дифференциации Tfh1,2,3. В отличие от другихподмножества CD4 и T-помощников, выполняющих свою функцию эффектора путем миграции в места воспаления, tfh-клетки оказывают помощь клеткам группы В в основном в фолликулярной зоне В-клеточной селезенки и лимфатического узла. Состимуляторные молекулы ICOS и CD40L играют значительную роль во взаимодействии между Tfh и GC B-клеток. Во время дифференциации Tfh, ICOS передает необходимые сигналы от cognate B клеток, а также выступает в качестве рецептора, принимающего миграционные сигналы от случайных прохожих В-клетокдля локализации В-клеточной зоны 4,5. CD40L является посредником сигналов от Tfh клеток для распространения В-клеток и выживания6. Другим фактором, играющим аналогичную роль CD40L, является цитокин IL21, который в основном выделяется клетками Tfh. IL21 непосредственно регулирует развитие клеток GC B и выработку антител высокого сродства, но его роль в дифференциации Tfh по-прежнемупротиворечива 7,8. PD-1 и CXCR5, которые в настоящее время наиболее часто используются при выявлении клеток Tfh в анализе цитометрии потока, также играют значительную роль в дифференциации и функции этого подмножества. CXCR5 является рецептором В-клеточного фолликулярного хемокина и опосредует локализацию клеток Tfh в В-клеточных фолликулах9. PD-1 в настоящее время определены не только имеют фолликулярную функцию наведения, но и передавать критические сигналы в процессе сродства клеток GC Bсозревания 10. Основываясь на этих выводах, оценка экспрессии этих молекул может в основном отражать созревание и функцию клеток Tfh.

GC является индуцированной переходной микроанатомической структуры во вторичных лимфоидных органов и сильно зависит от Tfh клеток, таким образом, является идеальным считывания для оценки Tfh ответ. В GC, после получения сигналов, опосредовающихся цитокинами и состимуляторными молекулами, В-клетки подвержены классу переключения и соматической гипермутации для генерации антителвысокого сродства 11. Переключение дифференциального класса антител происходит в дифференцированной нише цитокинов, в которой IL4 и IL21 индуцирует переключение класса IgG1, в то время как ИФНЗ индуцирует переключениекласса IgG2 12. Плазменные клетки являются производителями секретных антител и являются неизлечимо дифференцированными клетками. Как и tfh клетки, развитие В-клеток в GC связано с динамическим выражением многих значительных молекул. Основываясь на текущем исследовании, клетки GC Bмогут быть идентифицированы как B220 - PNA-Fas- или B220-GL7-Fas- клетки и плазменные клетки, по сравнению с их предшественниками, downregulate выражение B220 и upregulate CD138выражение 13. Более того, обе эти характеристики могут быть обнаружены в цитометрии потока и иммунофторесценции анализа, таким образом, является надлежащей оценкой реакции ГК.

Надежные клеточные и гуморальные реакции индуцируются при заражении вирусом гриппа, с Tfh и Th1 клетки доминирующейCD4 T-клеток ответ 14, что делает его идеальной моделью для Tfh клетки дифференциации исследования. Грипп A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8), который является широко используемым штаммом, адаптированным к мыши, часто используется вданном исследовании 14,15,16. Здесь мы описываем некоторые основные протоколы Tfh исследования соответствующих анализ в инфекции вируса гриппа: 1) интраназальной прививки от вируса PR8; 2) антиген-специфические клетки Tfh, клетки GC B и плазмы и обнаружение IL21 с цитометрией потока; 3) гистологическая визуализация ГК; 4) обнаружение антиген-специфических антител титр в сыворотке крови с ELISA. Эти протоколы обеспечивают необходимые методы для новых исследователей в Tfh связанных исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Института Пастера Шанхая, Китай. Все эксперименты проводились на основе утвержденных Комитетом по уходу за животными и использованию животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусная инфекция мышей и изоляция органов должны быть выполнены в состоянии ABSL2.

1. Прививка вируса гриппа PR8 и запись веса мышей

  1. Подготовка 8-недельного самца C57BL/6 мышей для инфекции в комнате ABSL2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол также подходит для экспериментов с самками мышей.
  2. Разбавление вируса PR8:вынюхив вирус из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и инкубировать на льду, пока он не расплавится в жидкость. Vortex фондовый вирус тщательно и разбавить вирус до 2 ПФУ / Л с стерильным фосфат-буфером солевого раствора (PBS, 135 мММ NaCl, 2,7 мМ ККл, 10 мМ На2HPO4, 1,8 мММ KH2PO4) в предварительно охлажденной трубке 1,5 мл.
  3. Мышей анестезии: взвесить каждую мышь и рассчитать объем (4 раза (йл) вес мыши (г)) пентобарбитала натрия (2 мг/мл), которые будут использоваться. Ввините рассчитанный объем пентобарбитала натрия интраперитонно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в том, чтобы мышей дышать стабильно и мирно, так что точный titer вируса могут быть привиты интраназально. Слишком быстрое или медленное сердцебиение указывает на ненадлежащую анестезию. Кроме того, рекомендуется использовать ветеринарную мазь, чтобы избежать сухости глаз.
  4. Интраназальная прививка: вихрь разбавленного вируса PR8 тщательно. Pipet 10 L и тщательно выполнять интраназальной прививки с одной стороны капля за каплей. После окончания прививки всех мышей в одной клетке (максимум 5 мышей) на этой стороне, повторите прививку с другой стороны (держать дыхание мыши мирным и устойчивым на всем протяжении прививки). Каждая мышь заражена 40 PFU вируса PR8 в общей сложности.
  5. Поместите мышей в стернальной лежачих в теплых клетках для лучшего возрождения.
  6. Мониторинг веса мыши ежедневно в течение 10 дней. (День заражения регистрируется как День 0).

2. Изоляция лимфоцитов от селезенки и медиастинального лимфатического узла (МЛН)

  1. Мышь эвтанизации: положить мышей в небольшой камере и усытворить мышей путем перекачки в CO2 мирно из нижней части камеры. Возьмите мышей, когда они не двигаются и выполнять дислокации шейки матки, чтобы обеспечить мышей умирают полностью. Опустите мышей с 75% этанола и перенесите на капот биобезопасности.
  2. Обездвижить мышей с вскрытия иглы на абсорбции бумаги покрытые вскрытия пены пластины. Вырезать кожу вдоль брюшной средней линии и задние ноги с рассечением ножницами и растянуть кожу пинцетом. Обездвижить растянутую кожу иглами для вскрытия.
  3. Приготовьте две 6-сантиметровые посуды для каждой мыши и держите их на льду. Положите 70-мкм-клеточный ситечко в каждое блюдо и добавьте 5 мл DMEM, дополненного 1% сывороткой крупного рогатого скота плода (DMEM (1% FBS))
  4. Селезенка изоляции: сократить брюшной полости с рассечением ножницами. Возьмите селезенку и положите ее в приготовленное блюдо.
  5. mLN изоляции: вырезать диафрагму и нижней части клетки ребра в непосредственной близости от тимуса. Потяните ребро в сторону и прикрепите его иглами для вскрытия грудной полости. Потяните легкое в сторону в правую сторону и используйте пинцет, чтобы взять mLN, под сердцем и вблизи брюшной стороны трахеи.
  6. Положите mLN в приготовленное блюдо.
  7. Получить одноклеточные суспензии: сетка селезенки или mLN мягко с поршень 3 мл шприц через 70-мкм клеток ситечко. Промыть клеточный ситечко с 1 мл свежего DMEM (1% FBS). Повторное приостановление подвески клетки и передача в 15 мл центрифуги трубки.
  8. Центрифуга клеточной суспензии при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант и добавьте 1 мл DMEM (1% FBS).
  9. Повторное высасывка клеточных гранул с 1 мл-пипетки тщательно. Добавьте 4 мл DMEM (1% FBS) в подвески клеток селезенки и держите их на льду для следующих операций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо повторно использовать клеточные гранулы с 1 мл среднего во-первых, а не 5 мл, для полной изоляции одиночных клеток от гранул.
    С этого шага все операции могут быть выполнены в обычной лаборатории.
  10. Подсчет селезенки клеток
    1. Повторное использование клеток путем поворота труб вверх и вниз в течение нескольких раз. Возьмите 10 л в 90 л буфера лиза красных кровяных телец (РБК) (10 мМ Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 3 минут и добавить 900 йл холодного PBS прекратить реакцию.
    2. Центрифуга при 400 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия и удалить супернатант. Resuspend с 100 йл холодного PBS. Возьмите 10 МКЛ клеток в 10 МКЛ 0,4% ж / в трипан синий и принять 10 йл из смеси для подсчета клеток с гемоцитометром.
    3. Расчет: вычислить ячейки как обычный метод. Короче говоря, подсчитайте количество ячеек в двух диагональных угловых квадратах на гемоцитометре и получите N1, N2 за каждый угловой квадрат. Концентрация клеток подвески 5-мл клеток должна быть рассчитана как (N1'N2)/2 x 104/mL.

3. Иммуностинирование поликлональных клеток Tfh с PD-1 и CXCR5

  1. Окрашивание антителами биотин-анти-CXCR5.
    1. Повторное приостановление ячейки путем поворота трубки вверх и вниз. Возьмите 2 x 106 ячеек в трубку FACS и добавьте 2 мл буфера окрашивания (PBS (1% FBS, 1 мМ EDTA)). Вымойте вихрем на вихревом осцилляции устройства.
    2. Центрифуга при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта, выливая жидкость и окуните трубку в рот на абсорбаторную бумагу дважды.
    3. Ослабить ячейки гранулы с остатком жидкости, нажав на дно трубки. Положите трубку в держатель трубки на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем остатков жидкости составляет примерно 25 мкл.
    4. Добавьте 0,2 МЛ антимошашки CD16/CD32 (блокатор Fc-рецепторов) для каждой трубки. Vortex, нажав трубку дно мягко и инкубировать на льду в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка смеси антител для нескольких образцов путем разбавления с 5 мл окрашивания буфера для каждой трубки. Рецепт смеси должен быть подготовлен разбавленным (n/10'1) х 0,2 йл блокатором Fc-рецепторов в (n/10'1) x 5 х L окрашивающий буфер и добавить смесь 5,2 мл в каждую трубку.
    5. Добавьте 0,3 МКЛ биотин-антимошейки CXCR5 в остаток 30 МКЛ буфера окрашивания для каждой трубки и вихря, нажав на дно трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка смеси, как описано в шаге 3.1.4.
    6. Инкубировать на льду в течение 1 ч с мягко resuspending клеток, нажав трубку на 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Vortex на 30 мин, чтобы избежать клеточных агрегатов для лучшего окрашивания.
    7. Добавьте 2 мл буфера окрашивания и вихря на устройство колебаний вихря. Центрифуга при 350 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант, как описано в шаге 3.1.2. Vortex, нажав трубку и инкубировать на льду для последующего окрашивания.
  2. Окрашивание другими поверхностными маркерами.
    1. Подготовка смеси антител (таблица1), как описано в шаге 3.1.4.
    2. Добавить смесь антител в каждую трубку. Vortex, нажав на дно трубки и инкубировать на льду в течение 30 минут.
    3. Вымойте клетки с 2 мл буфера окрашивания. Центрифуга при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия.
    4. Отбросьте супернатант и добавьте 400 МКЛ буфера окрашивания. Вихрь трубки на вихревом устройстве колебания и держать трубку в темноте до потока цитометрии анализа.

4. Иммуностигирование pr8 вируса гриппа NP-специфических клеток Tfh

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол окрашивания NP-специфических клеток Tfh из предыдущихисследований 15,17.

  1. Выполните биотин-CXCR5 окрашивания, как описано в шаге 3.1 за исключением того, что номер клетки, принятых для окрашивания составляет 3 х10 6 для достаточного количества антиген-специфических клеток, которые будут записаны в потоке цитометрии.
  2. Добавьте 0,3 л тетрамера APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC II (NP311-325)в трубку от 3.1.7. Подготовка смеси для нескольких образцов, как в шаге 3.1.4
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы пятно теттрамера до добавления анти-CD4 антитела, как связывание между CD4 и анти-CD4 антитела будут мешать оптимальной тетрамер окрашивания.
  3. Resuspend клеточной смеси, осторожно нажав трубку и инкубировать в темноте на RT в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обложка мокрой бумаги на рот труб, чтобы уменьшить испарение
  4. Добавьте смесь других поверхностных маркеров(таблица 1) и продолжайте инкубацию на RT в течение 30 минут.
  5. Вымойте и повторно помимите клетки, описанные в шагах 3.2.3 и 3.2.4.

5. Иммуностинирование Bcl6 в поликлональных клетках Tfh

  1. Выполните поверхностные маркеры (Таблица 2) окрашивание, как описано в разделе 3, за исключением того, что последняя стирка с 2 мл PBS, вместо окрашивания буфера.
  2. Центрифуга при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатантов и повторно потухите клеточные гранулы, осторожно постукивая по дну трубки.
  3. Добавьте 300 МКЛ 3,7% раствора формальдегида (разбавленного из 37% формальдегида с PBS) в трубку для фиксации клеток. Вихрь на вихревом осцилляции устройства и инкубировать на RT в течение 20 минут.
  4. Добавьте 2 мл буфера окрашивания для мытья и центрифуги при 500 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от сверхнатантных и повторного использования клеток, осторожно нажав на трубку.
  5. Добавьте 300 МКЛ из 0,2% Triton-X 100 и повторно потухните клетки вихрем на устройстве колебаний вихря. Инкубация на RT в течение 15 мин.
  6. Добавьте 2 мл буфера окрашивания для мытья. Центрифуга при 500 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от сверхнатантных и повторного использования клеток, мягко нажав на дно трубки.
  7. Добавьте 1,5 мл антител PE-anti-Bcl6 для каждой трубки. Аккуратно нажав трубку дно повторного использования смеси и инкубировать на RT в течение 2 ч с мягко нажав трубку каждые 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обложка мокрой бумаги на рот труб, чтобы уменьшить испарение смеси.
  8. Добавьте 2 мл PBS, дополненные 0,01% Triton-X 100 в трубку. Вихрь и центрифуга при 500 х г в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия.
  9. Повторите стирку в качестве шага 5.8. Resuspend клетки с 400 йл окрашивания буфера. Храните клетки в темноте на льду до анализа цитометрии потока.

6. Внутриклеточное окрашивание IL21

  1. Стимулировать клетки с PMA (phorbol 12-миритат 13-ацетат) и иономицин.
    1. Возьмите 2 х 106 клеток из подвески splenic клеток и центрифуги при 350 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатантных и повторного перерасхода клеточных гранул с 500 йл полной Т-клеточной среды. Перенесите клетки в пластину из 24 колодец.
    2. Добавьте 20 нмоль PMA и 2 ммоль иономицина в 500 л полнойсреды 18 и тщательно перемешайте, трубя вверх и вниз.
    3. Добавить раствор, приготовленный в шаге 6.2 в клеточной подвески в 24-хорошо пластины и перемешать, встряхивая пластины. Настройка нестимулированного контроля путем добавления 500 йл полной Т-клеточной среды без добавления PMA и иономицина в клетки. Инкубация в инкубаторе CO2 при 37 градусов по Цельсию в течение 4 ч.
    4. Добавьте 10 ммоль BFA (Brefeldin A, растворенный метанолом) в каждую колодец, чтобы заблокировать аппарат Golgi опосредованную белковую транспортировку. Положите пластину обратно в клеточный инкубатор и инкубировать в течение 2 ч.
  2. Выполните окрашивание маркера поверхности клетки.
    1. Resuspend клетки, мягко трубы вверх и вниз и передачи клеток в трубку FACS. Добавить 1 мл окрашивания буфера в трубку и центрифугу при 350 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию.
    2. Выполните Fc-рецептор блокатор окрашивания как шаг 3.1.4.
    3. Выполните маркеры поверхности клеток окрашивания (Таблица 3), как описано в шагах 3.2.1 до 3.2.3, за исключением стиральных клеток с 2 мл PBS.
    4. Центрифуга при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте сверхнатантные и повторное использование клеток, нажав на дно трубки.
  3. Добавьте 0,2 мл реагента из комплекта окрашивания живых/мертвых исправленных клеток Aqua Dead Cell и инкубировать трубку в темноте на RT в течение 10 минут для выполнения окрашивания мертвых клеток.
  4. Добавьте 2 мл PBS в трубку и вихрь на устройстве колебаний вихря. Центрифуга при 350 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант.
  5. Выполните фиксацию ячейки, описанную шагами 5.3 и 5.4.
  6. Добавьте 300 МКЛ буфера окрашивания для повторного перерасхода ячеек и храните трубки в холодильнике 4 градусов по Цельсию на ночь. Центрифуга при 500 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы удалить супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть опущен и продолжать шаг 6.7 непосредственно после шага 6.5.
  7. Добавьте 1 мл буфера сапонина (окрашивающий буфер, дополненный 0,2%(w/v) сапонин) в трубку и вихрь на вихревом устройстве колебания. Инкубировать на льду в течение 20 минут для выполнения проницаемой ячейки.
  8. Центрифуга при 500 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант.
  9. Добавьте в каждую трубку 0,5 МЛ рецептора Fc-IL21 человека. Подготовка смеси антител для нескольких как шаг 3.1.4 за исключением того, что разбавить антитела с сапонин буфера вместо окрашивания буфера.
  10. Инкубировать на RT в течение 1 ч с осторожно нажав трубки дно повторного использования клеток на 30 мин.
  11. Добавьте 2 мл буфера сапонина для мытья клеток и центрифуги при 500 x g в течение 6 мин. Откажитесь от супернатанта и повторите мыть один раз.
  12. Добавьте в каждую трубку 0,1 л БТР-анти-человека Ig (H'L). Подготовка смеси для нескольких образцов в качестве шага 3.1.4 за исключением того, что разбавить антитела с сапонин буфера вместо окрашивания буфера.
  13. Инкубировать образцы на льду в течение 30 мин. и мыть как шаг 6.11.
  14. Resuspend клетки с 400 йл окрашивания буфера. Держите образец в темноте на льду до анализа цитометрии потока.

7. Окрашивание клеток ГК В и плазмы

  1. Возьмите клетки и выполнять анти-Fc-рецептор антитела окрашивания в качестве шагов от 3.1.1 до 3.1.4.
  2. Выполните окрашивание поверхностных маркеров(таблица 4)в качестве шагов от 3,1,5 до 3,1,7, за исключением того, что время инкубации составляет 30 минут вместо 1 ч.
  3. Resuspend клетки с 400 йл окрашивания буфера. Храните образцы в темноте на льду до анализа цитометрии потока.

8. Изоляция сыворотки от крови

  1. На 14-й день после заражения (d.p.i 14) собирайте кровь из лицевой вены и храните образцы крови в холодильнике на 4 градуса Цельсия на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнить сбор крови в состоянии ABSL2 и с этого шага и далее все процедуры могут быть выполнены в обычной лаборатории.
  2. Центрифуга крови при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Изолировать сыворотку с 200 МКЛ пипетки тщательно, чтобы избежать загрязнения красных клеток. Aliquot в 3 трубки для каждого образца и хранить их при -80 градусов по Цельсию.

9. Анализ HA-специфических антител титр с ELISA

  1. Пальто ELISA пластины с 50 МКЛ 2 мкг / мл HA белковый раствор на колодец и инкубировать их в холодильнике 4 КК на ночь.
  2. Вымойте три раза с 200 йл из PBS разбавленных 0,05% tween (PBST). Добавьте 100 мл разбавленного PBST 5% обезжиренного молока в каждую колодец и инкубировать в RT в течение 2 ч, чтобы заблокировать неспецифический связывание.
  3. Разбавление и инкубация сыворотки: подготовить 3% BSA в PBS в качестве буфера разбавления. Разбавить сыворотку в буфере разбавления, как 1:50, 1:150, 1:450, ...... до 1:36450 (рекомендуется 3-кратное серийное разбавление). Добавьте 50 мкл разбавленной сыворотки к каждому хорошо и инкубировать в холодильнике 4 градусов на ночь.
  4. Отбросьте сыворотку и быстро вымойте колодцы один раз, добавив 200 МКЛ ПБСТ в каждую скважину (встряхните ее мягко, затем отбросьте). Затем медленно мыть пластины на шейкере с 200 йл PBST три раза в течение 5 минут каждый.
  5. Добавьте 100 мкл вторичного антитела, помеченного HRP, специфичного для всего IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, разбавленного PBST) и инкубировать в RT на 1 ч. Вымойте пластины PBST, как описано в 9.4.
  6. Вывийте равный объем Буфера А и Буфера B (TMB) из хранилища 4 КК и разогрейте в течение по крайней мере 30 минут на RT перед использованием. Смешайте A и B и добавьте 100 МКЛ TMB в каждый колодец и инкубировать их в течение 10-30 минут на RT, встряхивая мягко.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это краткое описание руководства TMB Substrate Reagent Set (BD,555214).
  7. Pipette 100 йл 2M H2SO4 в каждую колодец, чтобы прекратить реакцию. Прочитайте значение OD450 с помощью инструмента.
  8. Анализ данных: получить окончательное значение OD450 путем вычитания фонового сигнала (значение OD450 пустой колодец). Нарисуйте кривую, соответствующую изотипу антитела каждого образца с фактором разбавления на оси X и значением OD450 на оси Y.

10. Гистология

  1. Изолировать селезенку на d.p.i 10. Исправить их в 3,7% формальдегида раствор для 1 ч на RT. Отбросьте буфер фиксации и мыть с PBS в течение 5 минут на шейкере в течение трех раз.
  2. Обезвоживание селезенки в PBS (10% сахарозы) при 4 градусов по Цельсию в течение 1 ч, а затем обезвоживать их в PBS (30% сахарозы) при 4 градусов по Цельсию с тряской мягко, пока селезенки опускаются на дно 15 мл трубки.
  3. Вынул обезвоженные селезенки, встроить их в оптимальное соединение температуры резки и криозиции.
  4. Предварительно охладите ацетон при -20 градусов по Цельсию. Инкубировать секции тканей с предварительно охлажденным ацетоном в течение 10 мин. Вымойте ткань с PBS в течение трех раз.
  5. Permeabilize ткани разделов с PBS, содержащие 0,2% Тритон X-100 в течение 20 минут и мыть их в течение трех раз с PBS.
  6. Блокировать неспецифические связывания с PBS, содержащие 10% нормальной сыворотки козы (блокирующий буфер) в течение 1 ч на RT и мыть ткани разделов с PBS один раз.
  7. Заблокировыв неспецифическую привязку блокирующим комплектом STREPTAVIDIN/BIOTIN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте образцам высохнуть с этого шага вперед.
  8. Окрашивание первичными антителами: добавьте блокирующий буферный биотин-PNA (25 мкг/мл) и крысиный антимоша IgD (2,5 мкг/мл) на секции тканей тщательно. Инкубировать секции тканей во влажной камере в морозильной камере 4 КК на ночь.
  9. Быстро мыть ткани разделов с PBST один раз. Быстро промыть секции тканей в PBST с встряхивания медленно в течение 5 минут. Повторите мыть в течение трех раз.
  10. Разбавить Alexa Fluor 488-стрептавидин (1:500) и Alexa Fluor 555-Коза-анти крыса IgG (1:500) антитела с блокирующим буфером и добавить их на части ткани тщательно
  11. Инкубация на RT в течение 1 ч.
  12. Вымойте секции тканей как шаг 10.8 и тщательно смонтировать с пролонгировать раствор. Обложка ткани с coverslips тщательно и держать их в темноте при 4 градусов по Цельсию до конфокального анализа.
  13. Проанализируйте величину реакции GC, подсчитав номера GC на размер области.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Характеристика заболеваемости мышей при инфицировании вирусом гриппа
После заражения вирусом гриппа, мыши менее активны и анорексией из-за болезни, которая находит свое отражение в тяжелой потере веса, широко используемый симптом для мониторинга заболеваемостим?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Из-за специализированных ролей в предоставлении B-клеточной помощи для генерации антител высокого сродства, Tfh клетки были широко изучены в механизмах дифференциации и манипуляции, чтобы обеспечить новые стратегии для разработки вакцины. Инфекция вирусом гриппа вызывает энергичные о?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Благодарим сотрудников предприятия по цитометрии потока, объекта ABSL2 и животноводского комплекса SPF Института Пастера в Шанхае за техническую помощь и консультации. Эта работа была поддержана следующими грантами: Стратегическая приоритетная исследовательская программа Китайской академии наук (XDB29030103), Национальная ключевая программа НИОКР Китая (2016YFA0502202), Национальный фонд естественных наук Китая (31570886).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6
37% formaldehydeSigmaF1635
Anti-CD16/32 mouseThermo Fisher Scientific14-0161-86
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramerNIH
Bcl-6 PEBiolegend358504clone:7D1
Biotin-CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82clone: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82clone:GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42clone:IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82clone:IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150clone:MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070clone:7E.17G9
PD1 PE/Cy7Biolegend135216clone:29F.1A12
Streptavidin BV421BD Pharmingen563259
Streptavidin PEBD Pharmingen554081
Intracelluar staining of IL21
37% formaldehydeSigmaF1635
anti-human IgGJackson ImmunoResearch Laboratories109-605-098
Brefeldin ASigmaB6542
human FCc IL-21 receptorR&D System
ionomycinSigmaI0634
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kitThermo Fisher ScientificL34966
PMASigmaP1585
SaponinMP102855
GC B and plasma cells staining
B220 APCThermo Fisher Scientific17-0452-81clone:RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070clone:281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7BD Pharmingen557653clone:Jo2
IgD eFluor 450Thermo Fisher Scientific48-5993-82clone:11-26c
PNA FITCSigmaL7381
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA
PR8-HASino Biological11684-V08H
BSASSBC
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
TMB Substrate Reagent SetBD Pharmingen555214
Histology
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgGLife TechnologyA21434
anti-mouse IgDBiolegend405702
biotinylated PNAVector laboratoriesB-1075
dilute Alexa Fluor 488-streptavidinLife TechnologyS11223
normal goat serumSouthernBiotech0060-01
Pro-long gold antifade reagentThermo Fisher ScientificP3630
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kitVector laboratoriesSP-2002

Ссылки

  1. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  3. Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  4. Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
  5. Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
  6. Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
  7. Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
  8. Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
  9. Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
  10. Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
  11. Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
  12. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
  13. Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
  14. Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
  15. Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495(2014).
  16. He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
  17. León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
  18. Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
  19. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  20. Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
  21. Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  22. Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
  23. Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
  24. Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE160TBcl6

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены