JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקולים של הערכת תגובת Tfh ו- GC B במודל העכבר של זיהום וירוס שפעת.

Abstract

תאי T Follicular Helper (Tfh) הם תת-קבוצה עצמאית של תאי CD4+ T המתמחה במתן עזרה לפיתוח מרכז נביטה (GC) ויצירת נוגדנים בעלי זיקה גבוהה. בזיהום וירוס שפעת, חזק Tfh ו- GC B תגובות תאים המושרים כדי להקל על מיגור וירוס יעיל, אשר מעניק מודל עכבר מוסמך למחקר הקשורים Tfh. במאמר זה תיארנו פרוטוקולים באיתור תגובה חיסונית בסיסית הקשורה ל-Tfh במהלך זיהום בנגיף השפעת בעכברים. פרוטוקולים אלה כוללים: חיסון תוך-אנלתי של וירוס שפעת; כתם cytometry זרימה וניתוח של תאי Tfh פוליקלוניים ואנטיגן ספציפי, תאי GC B ותאי פלזמה; זיהוי חיסוני של מחשבים אישיים; בדיקה אימונוסורבנטית (ELISA) הקשורה לאנזימים של נוגדן ספציפי לנגיף שפעת בסרום. מבחנים אלה בעצם לכמת את הבידול והתפקוד של תאי Tfh בזיהום וירוס שפעת, ובכך לספק עזרה למחקרים במנגנון בידול מבהיר ואסטרטגיית מניפולציה.

Introduction

בעשור האחרון, מחקרים רבים התמקדו בקבוצת המשנה החדשה שזוהתה CD4+ T תא, קבוצת משנה של תא Tfh, על תפקידיה החיוניים בהתפתחות מרכז נביטה (GC) B. לימפומה B תא 6 (Bcl6), אשר נחשב בעיקר מדכא גנים, הוא גורם הגדרת שושלת של תאי Tfh עבור הראיות כי ביטוי חוץ רחמי של Bcl6 מספיק כדי לנהוג בידול Tfh תוך מחסור של Bcl6 תוצאות בידול Tfh נעלם1,2,3. שלא כמו קבוצות משנה אחרות CD4+ T helper המבצעות את פונקציית האפקטים שלהן על ידי הגירה לאתרי הדלקת, תאי Tfh מספקים את העזרה לתא B בעיקר באזור הזקיקים של תא B של טחול וצומת לימפה. מולקולות מגרה משותף ICOS ו CD40L, לשחק תפקידים משמעותיים באינטראקציה בין תאי Tfh ו- GC B. במהלך בידול Tfh, ICOS משדר אותות הדרושים מתאי קוגניציה B וגם פועל כקולטן המקבל אותות הגירה מתאי עובר אורח B עבור לוקליזציה של אזור B4,5. CD40L הוא מתווך של אותות מתאי Tfh עבור התפשטות תאי B והישרדות6. גורם נוסף הממלא את התפקיד הדומה ל- CD40L הוא ציטוקינים IL21, המופרשים בעיקר על ידי תאי Tfh. IL21 מווסת ישירות את פיתוח וייצור תאי GC B וייצור נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, אך תפקידו בבידול Tfh עדיין שנוי במחלוקת7,8. PD-1 ו- CXCR5, אשר משמשים כיום בתדירות הגבוהה ביותר בזיהוי תאי Tfh בניתוח cytometry זרימה, גם לשחק תפקידים משמעותיים הבידול והתפקוד של קבוצת משנה זו. CXCR5 הוא הקולטן של כימוקין זקיקי של תא B ומתווך לוקליזציה של תאי Tfh בזקיקי תא B9. PD-1 מזוהה כעת לא רק יש את פונקציית ההנחיה הזקיקית, אלא גם להעביר אותות קריטיים בתהליך של התבגרות תאים GC B10. בהתבסס על ממצאים אלה, הערכת הביטוי של מולקולות אלה יכול בעצם לשקף את ההבשלה והתפקוד של תאי Tfh.

GC הוא מבנה מיקרואנטומי חולף המושרה באיברי הלימפה משניים ותלוי מאוד בתאי Tfh, ובכך להיות קריאה מושלמת כדי להעריך את תגובת Tfh. ב- GC, לאחר קבלת אותות בתיווך ציטוקינים ומולקולות מגרה משותף, תאי B כפופים להחלפת מעמד והיפרמוטציה סומטית כדי ליצור נוגדנים בעלי זיקה גבוהה11. החלפת מחלקת נוגדנים דיפרנציאלית מתרחשת בנישת ציטוקינים דיפרנציאלית, שבה IL4 ו- IL21 גורמים להחלפת מחלקת IgG1 בעוד IFNγ גורמת למיתוג IgG2 מסוג12. תאי פלזמה הם היצרנים של נוגדנים מופרשים והם תאים מובחנים סופניים. כמו תאי Tfh, התפתחות תאי B ב- GC קשורה לביטוי דינמי של מולקולות משמעותיות רבות. בהתבסס על המחקר הנוכחי, ניתן לזהות תאי GC B כ- B220+PNA+Fas+ או B220+GL7+Fas+ תאים ותאי פלזמה, בהשוואה למבשרים שלהם, ביטוי downregulate של B220 וביטוי CD138 upregulate13. מה עוד, שני מאפיינים אלה ניתן לזהות cytometry זרימה וניתוח immunofluorescence, ובכך להיות הערכה מתאימה של תגובת GC.

תגובות תאיות והומוריסטיות חזקות נגרמות בזיהום וירוס שפעת, עם תאי Tfh ו- Th1 השולטים בתגובת CD4+ T cell14, מה שהופך אותו למודל מושלם למחקר בידול תאי Tfh. שפעת A / פורטו ריקו / 8/34 H1N1(PR8), שהוא זן מותאם לעכבר נפוץ, משמש לעתים קרובות במחקר זה14,15,16. כאן, אנו מתארים כמה פרוטוקולים בסיסיים של Tfh מחקר רלוונטי assay בזיהום וירוס שפעת: 1) חיסון תוך-אפי של וירוס PR8; 2) תאי Tfh ספציפיים לאנטיגן, תאי GC B ופלזמה וזיהוי IL21 עם ציטומטריית זרימה; 3) הדמיה היסטולוגית של GC; 4) זיהוי של טיטר נוגדן ספציפי אנטיגן בסרום עם ELISA. פרוטוקולים אלה מספקים את הטכניקות הדרושות לחוקרים חדשים במחקר הקשור ל- Tfh.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של מכון פסטר של שנגחאי, סין. כל הניסויים בוצעו על סמך הפרוטוקולים המוסדיים לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה.

הערה: זיהום וירוס של עכברים ובידוד של איברים צריך להתבצע במצב ABSL2.

1. חיסון של וירוס שפעת PR8 והקלטה של משקל עכברים

  1. הכינו עכברי C57BL/6 זכרים בני 8 שבועות לזיהום בחדר ABSL2.
    הערה: פרוטוקול זה מתאים גם בניסויים עם עכברים נקביים.
  2. דילול של וירוס PR8: להוציא את הנגיף מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס דגירה על קרח עד שהוא נמס לתוך נוזל. וורטקס וירוס המניה ביסודיות לדלל את הנגיף ל 2 PFU / μL עם מלוחים סטריליים פוספט אגירה (PBS, 135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 מ"מNa 2HPO4, 1.8 mM KH2PO4) בצינור מראש מצונן 1.5 mL.
  3. הרדמה עכברים: לשקול כל עכבר ולחשב את נפח (4-פי (μL) משקל העכבר (ז)) של נתרן pentobarbital (2 מ"ג / מ"ל) לשימוש. להזריק את הנפח המחושב של נתרן pentobarbital תוך-פיריטונית.
    הערה: צעד זה הוא לגרום לעכברים לנשום בהתמדה ובשלווה, כך titer מדויק של וירוס יכול להיות מחוסן intranasally. פעימות לב מהירות או איטיות מדי מצביעות על הרדמה בלתי הולמת. בנוסף, מומלץ להשתמש במשחה וטרינרית כדי למנוע יובש בעיניים.
  4. חיסון תוך-אנלתי: מערבולת וירוס PR8 מדולל ביסודיות. צינור 10 μL ולבצע בזהירות חיסון תוך-אנלייתי בצד אחד טיפה אחר טיפה. לאחר סיום החיסון של כל העכברים בכלוב אחד (מקסימום 5 עכברים) בצד זה, חיסון חוזר בצד השני (לשמור על הנשימה של העכבר שלווה ויציבה לאורך כל החיסון). כל עכבר נגוע 40 PFU של וירוס PR8 בסך הכל.
  5. מניחים את העכברים בנסיכות עצם החזה בכלובים חמים לתחייה טובה יותר.
  6. יש לנטר את משקל העכבר מדי יום במשך 10 ימים. (יום ההדבקה נרשם כיום 0).

2. בידוד של לימפוציטים מן הטחול ואת בלוטות הלימפה mediastinal (mLN)

  1. המתת עכבר: לשים את העכברים בתא קטן המתת עכברים על ידי שאיבה לתוך CO2 בשלווה מתחתית התא. להוציא עכברים כאשר הם לא זזים ולבצע נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח עכברים למות לחלוטין. טובלים את העכברים עם 75% אתנול ומעבירים למכסה המנוע.
  2. לשתק את העכברים עם מחטי ניתוח על צלחת קצף ניתוח מכוסה נייר סופג. חותכים את העור לאורך קו האמצע של הבטן ואת הרגליים האחוריות עם מספריים ניתוח למתוח את העור עם פינצטה. לשתק את העור מתוח עם מחטי ניתוח.
  3. מכינים שתי מנות 6 ס"מ עבור כל עכבר ולשמור אותם על הקרח. שים מסננת תאים 70-μm בכל מנה ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM בתוספת 1% סרום שור עוברי (DMEM (1% FBS))
  4. בידוד טחול: לחתוך את הצפק כדי לחשוף את חלל הבטן עם מספריים ניתוח. קח את הטחול ולשים אותו בצלחת מוכנה.
  5. בידוד mLN: לחתוך את הסרעפת ואת החלק התחתון של צלע הכלוב לקרבת התימוס. משוך את הצלע הצידה ולהצמיד אותו עם מחטי ניתוח כדי לחשוף את חלל בית החזה. משוך את הריאה הצידה לצד ימין ולהשתמש פינצטה לקחת mLN, מתחת ללב ליד הצד הגחוני של קנה הנשימה.
  6. שים את mLN בצלחת מוכנה.
  7. להשיג את המתלים תא יחיד: רשת הטחול או mLN בעדינות עם בוכנה של מזרק 3 מ"ל דרך מסננת תאים 70-μm. יש לשטוף את מסננת התאים ב-1 מ"ל של DMEM טרי (1% FBS). להחזיר את השעיית התא ולהעביר לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
  8. צנטריפוגה השעיית התא ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר טבעי במיוחד והוסף 1 מ"ל של DMEM (1% FBS).
  9. Resuspend גלולת התא עם 1 mL-פיפטה ביסודיות. הוסף 4 מ"ל של DMEM (1% FBS) לתוך מתלים תא טחול ולשמור אותם על הקרח עבור הפעולות הבאות.
    הערה: יש צורך resuspend גלולה התא עם 1 מ"ל של בינוני הראשון, לא 5 מ"ל, עבור בידוד מוחלט תאים בודדים מן גלולה.
    משלב זה ואילך, ניתן לבצע את כל הניתוחים במעבדה הרגילה.
  10. ספירת תאי טחול
    1. התחדשו בתאים על ידי סיבוב הצינורות למעלה ולמטה מספר פעמים. קח 10 μL לתוך 90 μL של תא דם אדום (RBC) מאגר תמוגה (10 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות ולהוסיף 900 μL של PBS קר כדי לסיים את התגובה.
    2. צנטריפוגה ב 400 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant. Resuspend עם 100 μL של PBS קר. קח 10 μL של תאים לתוך 10 μL של 0.4% w / v כחול trypan ולקחת 10 μL מתוך התערובת לספירת תאים עם המוציטרומטר.
    3. חישוב: חשב תאים כשיטה רגילה. בקצרה, לספור מספרי תאים בשני ריבועים פינתיים אלכסוניים על המוציטרומטר ולקבל N1, N2 עבור כל ריבוע פינה. יש לחשב את ריכוז התא של השעיית תא 5 מ"ל כ- (N1+N2)/2 x 104 /mL.

3. חיסון של תאי Tfh פוליקלונליים עם PD-1 ו- CXCR5

  1. כתמים עם נוגדן ביוטין נגד CXCR5.
    1. המשך את השעיית התאים על-ידי סיבוב הצינור מעלה ומטה. קח 2 x 106 תאים לתוך הצינור FACS ולהוסיף 2 מ"ל של מאגר כתמים (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). לשטוף על ידי מערבולת על מכשיר תנודות מערבולת.
    2. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את supernatant על ידי שפיכת הנוזל לטבול את הפה צינור על הנייר סופג פעמיים.
    3. לשחרר את גלולת התא עם נוזל שאריות על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור. שים את הצינור במחזיק הצינור על קרח.
      הערה: נפח הנוזל בשאריות הוא כ 25 μL.
    4. הוסף 0.2 μL של CD16/CD32 נגד עכבר (חוסם Fc-קולטן) עבור כל צינור. וורטקס על ידי הקשה על תחתית הצינור בעדינות ודגר על קרח במשך 10 דקות.
      הערה: הכן תערובת נוגדנים לדגימות מרובות על ידי דילול עם 5μL של חיץ כתמים עבור כל צינור. המתכון לתערובת צריך להיות מוכן על ידי דילול (n/10+1) x 0.2 μL Fc-קולטן חוסם לתוך (n/10+1) x 5 מאגר כתמים μL ולהוסיף 5.2 μL תערובת לתוך כל צינור.
    5. הוסף 0.3 μL של ביוטין אנטי עכבר CXCR5 לתוך שאריות 30 μL של חיץ כתמים עבור כל צינור ומערבולת על ידי הקשה על תחתית הצינור.
      הערה: הכן תערובת כמתואר בשלב 3.1.4.
    6. דגירה על קרח במשך 1 שעות עם בעדינות לשימוש חוזר תאים על ידי הקשה על הצינור ב 30 דקות.
      הערה: וורטקס ב 30 דקות היא להימנע אגרגטים התא עבור כתמים טובים יותר.
    7. הוסף 2 מ"ל של חיץ כתמים ומערבולת על התקן תנודות המערבולת. צנטריפוגה ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant כמתואר בשלב 3.1.2. וורטקס על ידי הקשה על הצינור ודגרת על קרח עבור כתמים הבאים.
  2. מכתים עם סמני משטח אחרים.
    1. הכן תערובת נוגדנים (טבלה 1) כמתואר בשלב 3.1.4.
    2. מוסיפים תערובת נוגדנים לכל צינור. וורטקס על ידי הקשה על תחתית הצינור ודגרת על קרח במשך 30 דקות.
    3. לשטוף תאים עם 2 מ"ל של חיץ כתמים. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. השלך את supernatant ולהוסיף 400 μL של חיץ כתמים. וורטקס הצינור על מכשיר תנודות המערבולת ולשמור על הצינור בחושך עד ניתוח cytometry זרימה.

4. חיסון של נגיף שפעת PR8 NP ספציפי תאי Tfh

הערה: פרוטוקול זה של הכתמת תאי Tfh ספציפיים ל- NP הוא ממחקריםקודמים 15,17.

  1. בצע כתמי ביוטין-CXCR5 כמתואר בשלב 3.1, למעט העובדה שמספר התא שנלקח עבור הכתמה הוא 3 x 106 עבור מספיק תאים ספציפיים לאנטיגן שיירשמו בציטומטריית זרימה.
  2. הוסף 0.3 μL של APC-מצומד-IAbNP311-325 MHC מחלקה II (NP311-325)טטרמר לתוך הצינור מ 3.1.7. הכנת תערובת לדגימות מרובות כמו בשלב 3.1.4
    הערה: חשוב להכתים טטרמר לפני הוספת נוגדן אנטי CD4 כמו מחייב בין CD4 ו נוגדן אנטי CD4 יפריע כתמי טטרמר אופטימלית.
  3. מוציאים מחדש את תערובת התאים על ידי הקשה עדינה על הצינור ודגרסיה בחושך ב- RT במשך 30 דקות.
    הערה: לכסות נייר רטוב על הפה של צינורות כדי להפחית את האידוי
  4. מוסיפים את התערובת של סמני משטח אחרים(טבלה 1)וממשיכים דגירה ב- RT במשך 30 דקות.
  5. לשטוף ולהשהות מחדש תאים כמתואר בשלבים 3.2.3 ו 3.2.4.

5. חיסון של Bcl6 בתאי Tfh פוליקלונליים

  1. בצע סמני משטח (טבלה 2) כתמים כמתואר בסעיף 3, למעט כי לשטוף האחרון עם 2 מ"ל של PBS, במקום חיץ מכתים.
  2. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את כדורי התא supernatant ו resuspend על ידי הקשה בעדינות על תחתית הצינור.
  3. הוסף 300 μL של 3.7% פתרון פורמלדהיד (מדולל מ 37% פורמלדהיד עם PBS) לתוך הצינור עבור קיבוע התא. וורטקס על מכשיר תנודות המערבולת והדגירה ב- RT במשך 20 דקות.
  4. מוסיפים 2 מ"ל של חיץ כתמים לכביסה וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 6 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השלך את התאים העל-טבעיים וההתחדשות על-ידי הקשה עדינה על הצינור.
  5. הוסף 300 μL של 0.2% טריטון-X 100 ו resuspend תאים על ידי מערבולת על התקן תנודות מערבולת. דגירה ב RT במשך 15 דקות.
  6. הוסף 2 מ"ל של חיץ כתמים לכביסה. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך תאים על-טבעיים ונצל מחדש על-ידי הקשה עדינה על תחתית הצינור.
  7. הוסף 1.5 μL של נוגדן PE-anti-Bcl6 עבור כל צינור. בעדינות הקשה על תחתית הצינור כדי resuspend את התערובת דגירה ב RT במשך 2 שעות עם הקשה בעדינות על הצינור כל 30 דקות.
    הערה: מכסים נייר רטוב על הפה של צינורות כדי להפחית את אידוי תערובת.
  8. הוסף 2 מ"ל של PBS בתוספת 0.01% טריטון-X 100 לתוך הצינור. וורטקס וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. חזור לשטוף כשלב 5.8. Resuspend תאים עם 400 μL של חיץ מכתים. שמור תאים בחושך על קרח עד ניתוח ציטומטריה זרימה.

6. כתמים תאיים של IL21

  1. לעורר תאים עם PMA (phorbol 12-myristate 13-אצטט) ו ionomycin.
    1. קח 2 x 106 תאים מהשעיית תאים טחול וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את גלולת תא supernatant ו resuspend עם 500 μL של תא T מלא בינוני. מעבירים את התאים לצלחת ה-24 באר.
    2. הוסף 20 nmol PMA ו 2 μmol ionomycin לתוך 500 μL של מדיום שלם18 ומערבבים ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    3. הוסף פתרון מוכן בשלב 6.2 לתוך השעיית התא בצלחת 24-well ומערבבים על ידי טלטול הצלחת. הגדר את הפקד unstimulated על ידי הוספת 500 μL להשלים תא T בינוני ללא תוספת של PMA ו ionomycin לתוך התאים. דגירה באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    4. הוסף 10 מיקרומול BFA (ברפלדין A, מומס עם מתנול) לתוך כל באר כדי לחסום את מנגנון Golgi מתווך העברת חלבון. מחזירים את הצלחת לאינקובטור התא ומדגגרים במשך 2 שעות.
  2. בצע כתמי סמן משטח תא.
    1. השהה מחדש תאים על-ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה והעבר את התאים לצינור FACS. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ כתמים לתוך הצינור וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. בצע כתמי חוסם Fc-קולטן כשלב 3.1.4.
    3. בצע כתמי משטח תאים (טבלה 3) כמתואר בשלבים 3.2.1 עד 3.2.3 למעט תאי כביסה עם 2 מ"ל של PBS.
    4. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את התאים העל-טבעיים וההשתוב מחדש על-ידי הקשה על תחתית הצינור.
  3. הוסף 0.2 μL של מגיב מתוך ערכת כתמים Live /Dead Fixable Aqua Dead Cell ודגר את הצינור בחושך ב- RT למשך 10 דקות כדי לבצע כתמים של תאים מתים.
  4. הוסף 2 מ"ל של PBS לתוך הצינור ומערבולת על מכשיר תנודות מערבולת. צנטריפוגה ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.
  5. בצע את קיבוע התא כמתואר בשלבים 5.3 ו- 5.4.
  6. מוסיפים 300 μL של חיץ כתמים כדי resuspend תאים ולאחסן את הצינורות במקרר 4 מעלות צלזיוס לילה. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את supernatant.
    הערה: ניתן להשמיט שלב זה ולהמשיך לשלב 6.7 ישירות לאחר שלב 6.5.
  7. הוסף 1 מ"ל של מאגר סאפונין (חיץ כתמים בתוספת 0.2%(w/v) סאפונין) לתוך הצינור ומערבולת על התקן תנודות מערבולת. דגירה על קרח במשך 20 דקות כדי לבצע חדירה לתאים.
  8. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך supernatant.
  9. הוסף 0.5 μL של קולטן FC-IL21 אנושי לתוך כל צינור. הכן תערובת נוגדנים עבור מרובים כמו שלב 3.1.4 למעט נוגדן מדולל עם מאגר סאפונין במקום חיץ מכתים.
  10. דגירה ב RT במשך 1 שעות עם הקשה בעדינות על תחתית הצינור כדי resuspend תאים ב 30 דקות.
  11. הוסף 2 מ"ל של מאגר סאפונין לשטוף תאים צנטריפוגה ב 500 x g במשך 6 דקות. יש להשליך שטיפה על-טבעית וחוזרת פעם אחת.
  12. הוסף 0.1 μL של APC-אנטי אדם Ig(H +L) לתוך כל צינור. הכן תערובת לדגימות מרובות כשלב 3.1.4 מלבד הנוגדן המדלל עם מאגר סאפונין במקום חיץ מכתים.
  13. דגירה את הדגימות על קרח במשך 30 דקות.
  14. Resuspend תאים עם 400 μL של חיץ מכתים. שמור את המדגם בחושך על קרח עד ניתוח cytometry זרימה.

7. כתמי GC B ותאי פלזמה

  1. קח תאים ולבצע כתמי נוגדן נגד Fc-קולטן כמו צעדים מ 3.1.1 כדי 3.1.4.
  2. בצע כתמי סמני משטח (טבלה 4) כצעדים מ 3.1.5 עד 3.1.7 אלא שזמן הדגירה הוא 30 דקות במקום 1 שעות.
  3. Resuspend תאים עם 400 μL של חיץ מכתים. שמור את הדגימות בחושך על קרח עד ניתוח ציטומטריה זרימה.

8. בידוד סרום מדם

  1. ביום 14 שלאחר ההדבקה (d.p.i 14), לאסוף את הדם מווריד הפנים ולשמור דגימות דם במקרר 4 מעלות צלזיוס לילה.
    הערה: בצע איסוף דם במצב ABSL2 ומצעד זה ואילך כל ההליכים יכולים להתבצע במעבדה הרגילה.
  2. צנטריפוגה הדם ב 400 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לבודד את הסרום עם פיפטה 200 μL בזהירות, כדי למנוע זיהום של תאים אדומים. Aliquot לתוך 3 צינורות עבור כל מדגם ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.

9. בדיקה של טיטר נוגדן ספציפי HA עם ELISA

  1. מעיל צלחות ELISA עם 50 μL של 2 מיקרוגרם / מ"ל HA פתרון חלבון לכל באר דגירה אותם במקרר 4 מעלות צלזיוס לילה.
  2. לשטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBS מדולל 0.05% tween (PBST). הוסף 100 μL של חלב PBST מדולל 5% דל שומן לתוך כל באר דגירה ב RT במשך 2 שעות כדי לחסום את מחייב לא ספציפי.
  3. דילול וסרום ודגרת: הכינו 3% BSA ב-PBS כמאגר הדילול. לדלל את הנסיוב במאגר דילול כמו 1:50, 1:150, 1:450, ...... ל- 1:36450 (מומלץ דילול סדרתי פי שלושה). מוסיפים 50 μL של סרום מדולל לכל באר ומדגרים במקרר 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. להשליך את הסרום במהירות לשטוף את הבארות פעם אחת על ידי הוספת 200 μL של PBST לתוך כל באר (לנער אותו בעדינות, ולאחר מכן להשליך). ואז לאט לשטוף את הצלחות על שייקר עם 200 μL של PBST שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  5. הוסף 100 μL של נוגדן משני שכותרתו HRP ספציפי עבור IgG הכולל, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, מדולל עם PBST) ואת הדגירה ב RT במשך 1 שעות. לשטוף את הצלחות על ידי PBST כמתואר ב 9.4.
  6. הוציאו נפח שווה של Buffer A ו-Buffer B (TMB) מאחסון בנפח 4 מעלות צלזיוס והתחממו למשך 30 דקות לפחות ב-RT לפני השימוש. מערבבים A ו- B ומוסיפים 100 μL של TMB לתוך כל באר ולהדגיר אותם במשך 10-30 דקות ב RT על ידי רועד ברכות.
    הערה: זהו תיאור קצר של המדריך של ערכת ריאגנט מצע TMB (BD,555214).
  7. פיפטה 100 μL של 2M H2SO4 לתוך כל באר כדי לסיים את התגובה. קרא את ערך OD450 באמצעות מכשיר.
  8. ניתוח נתונים: קבל את ערך OD450 הסופי על-ידי חיסור אות הרקע (ערך OD450 של באר ריקה). צייר את העקומה המתאימה לאיזוטיפ נוגדן של כל דגימה עם גורם הדילול על ציר X ואת ערך OD450 על ציר Y.

10. היסטולוגיה

  1. לבודד את הטחולים ב D.p.i 10. לתקן אותם ב 3.7% פתרון פורמלדהיד עבור 1 שעה ב RT. להשליך את מאגר הקיבעון ולשטוף עם PBS במשך 5 דקות על שייקר במשך שלוש פעמים.
  2. לייבש את הטחולים ב PBS (10% סוכרוז) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה ולאחר מכן לייבש אותם PBS (30% סוכרוז) ב 4 מעלות צלזיוס עם רועד ברכות עד הטחולים לשקוע לתחתית הצינור 15 מ"ל.
  3. מוציאים את הטחולים המיובשים, מטמימים אותם בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית וקיאוקציה.
  4. מצננים מראש את האצטון ב-20°C. דגירה את חלקי הרקמה עם אצטון מצונן מראש במשך 10 דקות. לשטוף את הרקמה עם PBS במשך שלוש פעמים.
  5. לחלחל קטעי הרקמה עם PBS המכיל 0.2% טריטון X-100 במשך 20 דקות ולשטוף אותם במשך שלוש פעמים עם PBS.
  6. חסום את הכריכה הלא ספציפית עם PBS המכיל 10% סרום עזים רגיל (חיץ חסימה) למשך שעה אחת ב- RT ולשטוף את מקטעי הרקמה עם PBS פעם אחת.
  7. חסום את האיגוד הלא ספציפי באמצעות ערכת חסימת STREPTAVIDIN/BIOTIN.
    הערה: אל תתנו לדגימות להתייבש משלב זה ואילך.
  8. כתמים עם נוגדן ראשוני: להוסיף חסימת חיץ מדולל ביוטין-PNA (25 מיקרוגרם / מ"ל) וחולדה נגד עכבר IgD (2.5 מיקרוגרם / מ"ל) על קטעי הרקמה בזהירות. דגירה את חלקי הרקמה בתא הרטוב במקפיא 4 מעלות צלזיוס לילה.
  9. לשטוף במהירות את חלקי הרקמה עם PBST פעם אחת. לשטוף במהירות את חלקי הרקמה PBST עם רועד לאט במשך 5 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים.
  10. לדלל אלקסה פלואור 488-סטרפטבידין (1:500) ואלקסה פלואור 555-עז נגד חולדה IgG (1:500) נוגדנים עם חיץ חסימה ולהוסיף אותם על קטעי הרקמה בזהירות
  11. דגירה ב RT במשך 1 שעות.
  12. לשטוף את חלקי הרקמה כמו שלב 10.8 בזהירות לעלות עם הפתרון להאריך. מכסים את הרקמה עם coverlips בזהירות ולשמור אותם כהים ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח confocal.
  13. נתח את גודל תגובת GC על-ידי ספירת מספרי GC לכל גודל אזור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אפיון תחלואה בעכבר בזיהום בנגיף השפעת
לאחר זיהום בנגיף השפעת, עכברים פעילים פחות אנורקסית עקב מחלה, אשר באה לידי ביטוי על ידי ירידה במשקל חמורה, סימפטום נפוץ כדי לפקח על תחלואה העכבר19. כפי שמוצג באיור 1a, עכברים נגועים בנגיף PR8 החלו לרדת במשק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בשל תפקידים מיוחדים במתן עזרה בתאי B ליצירת נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, תאי Tfh נחקרו בהרחבה במנגנוני הבידול והמניפולציה כדי לספק אסטרטגיות חדשות לעיצוב חיסונים. זיהום וירוס שפעת גורם תגובות נמרצות Tfh ו- GC B תאים, ובכך להיות מודל מתאים לתחום זה של מחקר. במאמר זה, תיארנו פרוטוקולים של זיהום וירוס ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לצוותים של מתקן cytometry זרימה, מתקן ABSL2 ומתקן בעלי חיים SPF של מכון פסטר של שנגחאי על העזרה הטכנית שלהם וייעוץ. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: תוכנית מחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDB29030103), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFA0502202), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31570886).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6
37% formaldehydeSigmaF1635
Anti-CD16/32 mouseThermo Fisher Scientific14-0161-86
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramerNIH
Bcl-6 PEBiolegend358504clone:7D1
Biotin-CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82clone: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82clone:GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42clone:IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82clone:IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150clone:MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070clone:7E.17G9
PD1 PE/Cy7Biolegend135216clone:29F.1A12
Streptavidin BV421BD Pharmingen563259
Streptavidin PEBD Pharmingen554081
Intracelluar staining of IL21
37% formaldehydeSigmaF1635
anti-human IgGJackson ImmunoResearch Laboratories109-605-098
Brefeldin ASigmaB6542
human FCc IL-21 receptorR&D System
ionomycinSigmaI0634
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kitThermo Fisher ScientificL34966
PMASigmaP1585
SaponinMP102855
GC B and plasma cells staining
B220 APCThermo Fisher Scientific17-0452-81clone:RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070clone:281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7BD Pharmingen557653clone:Jo2
IgD eFluor 450Thermo Fisher Scientific48-5993-82clone:11-26c
PNA FITCSigmaL7381
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA
PR8-HASino Biological11684-V08H
BSASSBC
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
TMB Substrate Reagent SetBD Pharmingen555214
Histology
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgGLife TechnologyA21434
anti-mouse IgDBiolegend405702
biotinylated PNAVector laboratoriesB-1075
dilute Alexa Fluor 488-streptavidinLife TechnologyS11223
normal goat serumSouthernBiotech0060-01
Pro-long gold antifade reagentThermo Fisher ScientificP3630
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kitVector laboratoriesSP-2002

References

  1. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  3. Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  4. Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
  5. Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
  6. Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
  7. Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
  8. Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
  9. Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
  10. Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
  11. Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
  12. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
  13. Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
  14. Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
  15. Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495(2014).
  16. He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
  17. León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
  18. Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
  19. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  20. Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
  21. Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  22. Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
  23. Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
  24. Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE160TBcl6immunosorbent assayimmunofluorescence

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved