JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في التصوير الحي هو أداة قوية يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تطوير الجهاز العصبي. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى في الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية.

Abstract

يتطلب تطوير الجهاز العصبي الفقاري تنسيقًا دقيقًا للسلوكيات والتفاعلات الخلوية المعقدة. يمكن أن يوفر استخدام الدقة العالية في تقنيات التصوير الحي نافذة واضحة على هذه العمليات في الكائن الحي. على سبيل المثال، يمكن اتباع تقسيم الخلايا وذريتها في الوقت الحقيقي مع تشكل الجهاز العصبي. في السنوات الأخيرة، أدت التطورات التقنية في التقنيات متعددة الألوان إلى توسيع أنواع الأسئلة التي يمكن التحقيق فيها. يمكن استخدام نهج Brainbow متعدد الألوان ليس فقط للتمييز بين الخلايا الشبيهة ، ولكن أيضًا لرمز اللون متعدد المستنسخين المختلفين للخلايا ذات الصلة التي تستمد كل منها من خلية ذرية واحدة. وهذا يسمح لتحليل النسب متعددة من العديد من المستنسخين مختلفة وسلوكياتهم في وقت واحد أثناء التنمية. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى على مدى الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية. هذا مفيد بشكل خاص لمتابعة التفاعلات الخلوية بين الخلايا مثل، والتي يصعب تسمية بشكل تفاضلي باستخدام الألوان التقليدية التي يحركها المروج. يمكن استخدام نهجنا لتتبع علاقات النسب بين استنساخ مختلفة متعددة في وقت واحد. توفر مجموعات البيانات الكبيرة التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية معلومات غنية يمكن مقارنتها كمًا عبر التلاعب الجيني أو الدوائي. في نهاية المطاف يمكن أن تساعد النتائج التي تم إنشاؤها في الإجابة على أسئلة منهجية حول كيفية تطور الجهاز العصبي.

Introduction

في المراحل المبكرة من التنمية، تنقسم برك الخلايا السلف المتخصصة بشكل متكرر في مناطق تكاثرية، وتنتج صفائف متنوعة من خلايا الابنة. الخلايا التي ولدت خلال هذه الفترة التنموية ثم التفريق والسفر لتشكيل الأعضاء الوليدة. في الجهاز العصبي، السلفمثل غليا شعاعي تؤدي إلى خلايا عصبية غير ناضجة في مناطق البطين. كما تهاجر الخلايا العصبية بعيدا عن البطينين وناضجة, الأنسجة توسيع يشكل في نهاية المطاف هياكل معقدة للغاية من الدماغ1,,2,,3,,4,,5,,6. التنسيق بين تقسيم السلف والتمايز وهجرة الخلايا العصبية سيحدد الحجم النهائي والشكل ، وبالتالي وظيفة الدماغ ، مما يؤثر بشكل مباشر على السلوك7،8،9،10. وفي حين أن الرقابة الصارمة على هذه العمليات أمر بالغ الأهمية لتطور الدماغ الطبيعي، فإن الآليات العالمية التي تنظم هذه الديناميات ليست مفهومة جيداً. هنا نحن نصف أداة لدراسة تطور الجهاز العصبي في قرار الخلوية، مما يسمح للباحثين لتصور الخلايا السلف والخلايا العصبية في الجسم الحي في الدماغ حمار وحشي النامية مع Brainbow وتتبع سلوكهم مع مرور الوقت عن طريق المجهر confocal الفاصل الزمني11. ويمكن أيضا تكييف هذا النهج لتصور أجزاء أخرى من الجنين النامي.

لمراقبة والتمييز بين الخلايا في الدماغ الحمار الوحشي النامية، قمنا بتكييف تقنية تسمية خلايا بقوس قزح11. يستخدم Brainbow التعبير الجمعي المحدد عشوائيًا لثلاثة بروتينات فلورية متميزة (FPs) لتسمية مجموعة من الخلايا. في حين أن التعبير الافتراضي للتعبير Brainbow هو dTomato FP الأحمر ، إعادة التركيب بواسطة الإنزيم Cre recombinase النتائج في التعبير عن mCerulean (بروتين الفلورسنت السماوي ، CFP) أو البروتين الفلوري الأصفر (YFP)12،13. كمية مجتمعة من كل FP أعرب في خلية يعطيها هوى فريدة من نوعها، مما يسمح تمييز بصري واضح من الخلايا المجاورة. بالإضافة إلى ذلك، عندما يقسم خلية السلف، كل خلية ابنة سوف ترث اللون من الخلية الأم، وإنتاج استنساخ مرمزة بالألوان والسماح للباحثين لتتبع نسب الخلية11،14. في حين تستخدم أصلا لتحليل الدوائر العصبية في الفئران12, وقد تم منذ Brainbow وأعرب في مجموعة واسعة من الكائنات الحية نموذج, بما في ذلك حمار وحشي15.

بنيت تقنيتنا على طرق التصوير والتصوير السابقة متعددة الألوان لتصوير العديد من النسخ المرمزة بالألوان بشكل مباشر بمرور الوقت في سمك الحمار الوحشي الحي. نظرا لشفافيتها البصرية كأجنة، والحمار الوحشي هي مناسبة تماما لتجارب التصوير16،وقد استخدمت الدراسات السابقة Brainbow في حمار وحشي لدراسة مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك الجهاز العصبي11،,15،,17،,18،19،,20،,21،,22،,23،,24،,25،, , 26،27. القدرة على الصورة مباشرة في الكائن الحي، جنبا إلى جنب مع تطورها الرحمي السابق السريع، وجعل حمار وحشي نموذجا قيما للتنمية الفقارية. على النقيض من الدماغ الثدييات، والمنطقة التكاثرية بأكملها من hindbrain حمار وحشي هو متاح بسهولة للتصوير دون تعطيل لبيئتها الذاتية6. وهذا يسمح بإجراء التجارب في الكائن الحي، بدلا من في المختبر أو المستحضرات الأنسجة الثابتة. على النقيض من تجارب التصوير الثابتة ، في دراسات الجسم الحي تسمح بتصميم طولي ، وإنتاج ساعات من البيانات التي يمكن تحليلها للأنماط ، وبالتالي زيادة احتمال ملاحظة الأحداث النادرة نسبيًا. اعتمادا على سرعة وطول الأحداث ذات الاهتمام، قد يختار الباحثون لأداء قصيرة (1-2 ساعة) أو طويلة (تصل إلى ~ 16 ح) تجارب التصوير الفاصل الزمني. باستخدام مروج الصدمات الحرارية الحمار الوحشي 70 (hsp70، hsp)، يمكن التحكم في التعبير Brainbow مؤقتا28،29. بالإضافة إلى ذلك، التعبير الفسيفساء الناجمة عن هذا المروج هو مناسبة تماما لوضع العلامات وتتبع العديد من استنساخ11.

القدرة على التعرف بصريا استنساخ متعددة داخل الدماغ الحي هو ميزة من هذه الطريقة. الدراسات السابقة الهامة التي بحثت في دور استنساخ داخل تطوير الجهاز العصبي تستخدم ناقلات الفيروسات الرجعية لتسمية خلية ذرية واحدة وذريتها باستخدام FP واحد أو غيرها من البروتين تصور بسهولة. مثل هذه العلامات يسمح للباحثين لمراقبة استنساخ واحد مع مرور الوقت، إما في المختبر أو في الجسم الحي22،30، 31،,31,32،,33،34،,35،,36،,37،,38., على النقيض من أساليب لتتبع سلوك الخلايا داخل استنساخ واحد ، والألوان المتميزة من Brainbow تسمح للباحثين لمراقبة ديناميات بين استنساخ. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام Brainbow لتسمية العديد من المستنسخين داخل الدماغ، يتم جمع بيانات إضافية عن السلوك البرسيم نسبة إلى التقنيات التي تسمية استنساخ واحد11. والأهم من ذلك، يمكن توسيع النهج الموصوفة هنا لتوليد مقارنات تنموية بين الأسماك التي خضعت لتلاعبات جينية أو دوائية مختلفة18. وعموما، هذه المزايا تجعل الفاصل الزمني في التصوير البؤري في الجسم الحي من Brainbow التعبير عن سمك الحمار الوحشي مثالية للباحثين استكشاف تطوير الجهاز العصبي الفقارية، ولا سيما المهتمين في دور استنساخ.

Protocol

وقد وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرفق بالحيوان (IACUC) في كلية لويس وكلارك على الإجراءات المتعلقة بالمواد الحيوانية.

1. الحقن الدقيق لأجنة حمار وحشي

  1. إعداد نوع البرية، والحمار الوحشي الكبار في خزانات التزاوج الجنس المنفصلة بعد الظهر قبل إجراء الحقن المجهري39،40.
  2. إعداد حل الحمض النووي في الصباح من الحقن المجهرية. تمييع hsp:Zebrabow11 الحمض النووي البلازميد إلى تركيز ~ 10 نانوغرام / μL في 0.1 mM KCl، جنبا إلى جنب مع 2.5٪ فينول الأحمر و 3.75U الأنزيم Recombinase Cre.
  3. إجراء الحقن المجهري ة لمحلول الحمض النووي في أجنة حمار وحشي من خلية واحدة في غضون 45 دقيقة من الإخصاب39،41. حقن ما يقرب من 4.2 nL من هذا المحلول في كل جنين، أي ما يعادل ~ 42 pg من الحمض النووي البلازميد.
    ملاحظة: يمكن حذف خطوة الحقن المجهري إذا تم تزاوج خط حمار وحشي متحول وراثيا، Brainbow- يعبر عن خط بدلا من ذلك، مثل Tg (ubi:Zebrabow)15 و Tg (neurod:Zebrabow)18. يمكن أن يكون إجراء الحقن المجهري مفيدًا لأنه يسمح للباحثين بترقيم رقم النسخة وكثافة وضع العلامات. وعلاوة على ذلك، يمكن حقن بناء الحمض النووي الثاني الذي العلامات أو التلاعب منتج جيني معين جنبا إلى جنب مع Brainbow إذا رغبت في ذلك (على سبيل المثال، بروتين الفلورسنت الحمراء البعيدة التي تكمل Brainbow18).
  4. الحفاظ على الأجنة عن طريق الحقن في أطباق بيتري من متوسط E339 في حاضنة 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

2. صدمة الحرارة للحث على التعبير Brainbow

ملاحظة: إذا كان الحمض النووي البلازميد حقن أو transgene أعرب لا تستخدم hsp70 المروج لدفع التعبير، يمكن تخطي خطوة صدمة الحرارة، وينبغي نقل الأجنة صحية على الفور إلى الفينيلثيووريا (PTU) في 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf).

  1. في 24 hpf، قتل الأجنة الميتة والمشوهة من مجموعة من الأجنة حقن. ثم، نقل الأجنة السليمة إلى أنبوب 50 مل، مع ما يصل إلى 20 جنين/ أنبوب.
  2. ملء الأنابيب مع 10 مل من E3. وضع غطاء على رأس كل أنبوب ولكن لا تغلق بإحكام.
  3. ضع رف الأنبوب الذي يحتوي على أنابيب 50 مل تستقيم في حمام مائي 37 درجة مئوية. تأكد من أن مستوى المياه في الحمام أعلى من مستوى E3 في الأنابيب وتركها لمدة 80 إلى 90 دقيقة.
  4. إزالة رف أنبوب مع الأجنة من حمام الماء والعودة إلى حاضنة 28 درجة مئوية تستقيم. السماح ما يصل إلى 1 ساعة لE3 لتبرد والأجنة لإعادة تكييف تدريجيا إلى درجة الحرارة. ثم، نقل الأجنة إلى أطباق بيتري من 0.2 mM PTU في E3 دافئة في الحاضنة لمنع تصبغ الأجنة.
    تنبيه: وحدة حرارية بريطانية هي مادة كيميائية سامة يجب التعامل معها بعناية والتخلص منها بشكل مناسب. ويقترح ارتداء قفازات.

3. فحص الأجنة للتعبير Brainbow

  1. في 2 إلى 4 ساعة بعد الصدمة الحرارية، فحص الأجنة تحت المجهر تشريح الفلورسال القياسية للتعبير عن CFP أو YFP، مما يشير إلى إعادة تركيبة قوس قزح ناجحة (من التعبير الافتراضي من dTomato).
    ملاحظة: إذا كانت هناك خيارات متعددة لتصفية الفلورسينس متاحة، فإن فحص CFP هو الطريقة الأكثر فعالية لتحديد الأسماك المؤمّرة بشكل جيد. إذا لم تتوفر فلاتر CFP و YFP ، فيمكن أيضًا تصور YFP بشكل خافت تحت فلاتر البروتين الفلوري الأخضر (GFP) بسبب التداخل في ملفاتها الشخصية الطيفية.
  2. حدد الأجنة مع تعبير FP قوي في جميع أنحاء ونقل إلى طبق منفصل مع PTU. صورة الأجنة في يوم واحد بعد الإخصاب (dpf; 28 hpf أو في وقت لاحق) أو الحفاظ على الأجنة في وحدة حرارية بريطانية وصورة في 2 أو 3 dpf.

4. تركيب الأجنة في التصوير في فيفو

  1. قبل يوم التجربة، قم بإعداد غرفة التصوير وأداة التلاعب بالأجنة.
    1. قم بإعداد غرفة التصوير عن طريق لصق حلقة بلاستيكية بعناية إلى وسط طبق بيتري 60 مم.
    2. اختياريا، وإعداد المتلاعبين الأجنة حسب الطلب لنقل الأجنة داخل الطبق وتوجيه الأجنة أثناء تركيب. بناء المتلاعب عن طريق supergluing طول صغير من خط الصيد النايلون (~ 1/2 في، ~ 6 رطل) إلى نهاية عصا مسحة القطن الخشبية التي تم قطعها إلى ~ 4 في الطول.
  2. إذا لزم الأمر (أي التصوير في 2 dpf أو قبل ذلك) ، قبل تركيب الأجنة dechorionate باستخدام المحاقن تحت المجهر تشريح.
  3. تُسْكِنْ أجنة سمك الحمار الوحشي.
    1. ملء طبق بتري 60 ملم في منتصف الطريق مع E3 وإضافة 5-6 قطرات من 4 ملغ / مل MS-222 Tricaine-S إلى تركيز النهائي من ~ 0.2 mM. دوامة لخلط.
      تنبيه: وينبغي التعامل مع الترايكاين بعناية والتخلص منها بشكل مناسب.
    2. نقل الأجنة من وحدة حرارية بريطانية إلى محلول الترايكين، وضمان نقل أقل وحدة حرارية بريطانية قدر الإمكان. في حين أن ردود الفعل الأسماك ينبغي أن تتوقف بعد 1-2 دقيقة, ترك الأجنة في الترايكين لمدة تصل إلى 10 دقيقة لضمان إجراء عمليات تصوير دقيقة لتجارب التصوير الفاصل الزمني.
    3. تأكد من أن الأجنة هي بُسْنِيبشكل صحيح. تقييم منعكس الانفعال من خلال لمس ذيول الجنين بلطف مع المتلاعب الجنين. إذا لوحظت حركة منعكسة، أضف قطرة إضافية من الترايكين إلى الطبق بعيدًا عن الأجنة قدر الإمكان وتدور لتختلط. مراقبة معدل ضربات قلب الجنين تحت نطاق تشريح. إذا كان بطيئا بشكل غير طبيعي، إضافة قطرات إضافية من E3 إلى الطبق للحد من تركيز الترايكين.
  4. جبل الأجنة التي تُسجّب في أغاروز.
    1. نقل الأسماك إلى مركز حلقة بلاستيكية داخل غرفة التصوير وإزالة أكبر قدر ممكن من فائض E3 باستخدام ماصة نقل ذات رؤوس غرامة.
    2. باستخدام ماصة نقل نظيفة، وتغطي الأسماك مع 1.0٪ agarose منخفضة الذائبة (LMA) في E3 المخزنة في 42 درجة مئوية وملء حلقة بلاستيكية كاملة مع طبقة رقيقة من agarose. استخدام ماصة نقل لسحب بلطف الأجنة حتى في طرف ماصة والعودة إلى agarose دون إدخال فقاعات الهواء.
    3. قبل أن يصلب الاغاروز، استخدم سريعًا متلاعبًا بالجنين لتوجيه الأسماك بشكل مناسب. إذا كان التصوير بمجهر منتصب، ضع الأجنة على مقربة من السطح العلوي للأغاروز قدر الإمكان. وضع الأجنة موازية لالجزء السفلي من غرفة التصوير مع الذيل على التوالي.
      ملاحظة: بالنسبة لتصوير الدماغ الخلفي، يمكن وضع الأجنة في عرض الظهر أو الترهل. وينبغي الحرص على ضمان أن رؤوس الأجنة لا تغرق في حين أن agarose لا يزال السائل. قد تكون الاتجاهات الأخرى مناسبة لاستهداف الأنسجة النامية الأخرى للتصوير. لمجاهر مقلوبة، سيتم تركيب بشكل مختلف، وعادة وضع الأسماك بالقرب من الجزء السفلي من طبق بيتري الزجاج القاع.
  5. انتظر حتى تصلب agarose ، ثم ملء غرفة التصوير مع E3. إضافة أكبر قدر ممكن E3 لحساب التبخر على مدى التصوير.

5. الوقت الفاصل بين التصوير من تطوير الحمار الوحشي Hindbrain

  1. ضع غرفة التصوير على المجهر البؤري استعداداً للتصوير.
    1. ضع غرفة التصوير مع السمك وE3 على المجهر البؤري.
    2. حدد هدفًا ذو فتحة عددية عالية ومسافة عمل طويلة، مثل هدف غمر الماء 20x (1.0 NA).
    3. ابحث عن منطقة ذات علامات كثيفة ومشرقة مناسبة لنوع الخلية (الخلايا) ذات الأهمية.
      ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام مرحلة/جهاز يتم التحكم في درجة حرارته على المجهر لتنظيم درجة الحرارة والرطوبة خلال جلسات التصوير الطويلة. وهذا يمكن أن يقلل من التبخر.
  2. إعداد معلمات الاستحواذ لتصوير Brainbow.
    1. صورة كل قناة FP بالتسلسل. إذا كان استخدام برنامج تجاري (على سبيل المثال، برنامج Zen)، يتم ذلك من خلال إعداد ثلاثة "مسارات". استخدام ليزر الأرجون لإثارة CFP في 458 نانومتر وYFP في 514 نانومتر. استخدام ليزر DPSS 561 نانومتر لإثارة dTomato. جمع الانبعاثات بين 463-509 نانومتر لCFP، 519-555 نانومتر لYFP، و 566-691 نانومتر لdTomato.
    2. للعرض على الشاشة، رمز CFP كما الأزرق، YFP كما الأصفر، وdTomato كما الأحمر.
      ملاحظة: تختلف هذه الإعدادات اعتمادًا على خطوط الليزر والميزات الأخرى المتوفرة على المجهر المحوري. لزيادة سرعة التصوير، يمكن تصوير قنوات CFP وdTomato في وقت واحد دون نزيف ملموس من خلال. إذا كان يتم أيضًا صورة FP منفصل، مثل FP أحمر بعيد، يمكن صورة هذا بشكل تسلسلي أو متزامن مع YFP.
    3. قم بإعداد معلمات التصوير العامة لالتقاط صور 16 بت بدقة لا تقل عن 1024 × 1024 ومتوسط مرتين. ضبط التكبير اعتمادا على المنطقة ونوع الخلية من الفائدة (أي لتصوير الدماغ الخلفي مع هدف 20x سوف تتراوح التكبير من 1.0-2.5). تعظيم مجال الرؤية للسماح لنمو الأسماك مع مرور الوقت.
    4. عرض مسار واحد في وقت واحد (وإيقاف تشغيل الليزر الأخرى لمنع التبييض الضوئي)، وتحسين إعدادات الاستحواذ لكل FP على حدة (على سبيل المثال، قوة الليزر، وحجم الثقب، وكسب أنبوب مضاعف ضوئي، الخ).
    5. حدد نطاق Z-stack إلى الصورة.
      ملاحظة: لجلسات التصوير الطويلة (>2 ح)، تأخذ في الاعتبار أن الأسماك سوف تستمر في النمو طوال فترة التصوير، وبالتالي فإن كل من حقل XY ومجموعة Z-المكدس يجب أن تأخذ في الاعتبار هذا مع مساحة إضافية. إذا كان تصوير الدماغ الخلفي، وتشمل مساحة في الميدان للأنسجة لنقل rostrally خلال فترة التصوير. كما يلزم إدراج حيز للنمو في البعد Z. تضمين في الصورة ما يقرب من 10-20 ميكرومتر فوق المنطقة ذات الاهتمام، ما إذا كانت الأسماك موقعة للعرض المترهل أو الظهري.
  3. إعداد معلمات للتصوير الفاصل الزمني.
    1. حدد فاصلًا زمنيًا. يتراوح طول الفاصل الزمني بين 10-30 دقيقة لتتبع الأحداث الميطية والمبرمجة في الدماغ الخلفي النامي. يختلف طول الفاصل الزمني اعتمادًا على سرعة الأحداث ذات الأهمية والوقت الإجمالي المستغرق لالتقاط مكدس Z واحد.
    2. حدد طول جلسة التصوير. جلسات التصوير الفاصل الزمني تحدث عادة بين عشية وضحاها ويمكن أن تستمر على الأقل 16 ساعة.
  4. تشغيل التجربة.
    ملاحظة:     يمكن قتل السمك مباشرة بعد التصوير أو تشريحها بعناية من agarose باستخدام المحاقن وإعادتها إلى E3 للتعافي. ثم يمكن صورة الأسماك المستردة مرة أخرى في وقت لاحق، على الرغم من أن موقف الخلية وعمقها سوف تتحول خلال هذه الفترة بسبب النمو العام.

6. إدارة الملفات الفاصل الزمني

  1. استيراد ملف الصورة إلى برنامج التحليل.
    1. إذا كنت تستخدم برنامج Zen، احفظ الملف بتنسيق .czi بمجرد اكتمال الحصول على الصورة. تأكد من حفظ البيانات الخام في شكل متوافق مع فيجي42 و / أو غيرها من البرامج.
    2. الاستيراد إلى البرمجيات فيجي باستخدام BioFormats المستورد.
      ملاحظة: ستكون ملفات الفاصل الزمني كبيرة ويمكن أن تتطلب كميات كبيرة من الوقت والذاكرة لفتحللتحليل. وبالتالي، فمن المفيد أن تكون استراتيجية في كيفية حفظها وفتحها. يمكن أن يكون من المفيد حفظ إصدار أقل جودة التي يمكن فتحها بسهولة أكبر للبحث عن الأحداث ذات الاهتمام بالعين.
  2. إذا كنت تستخدم فيجي، قم بإنشاء مجموعات فرعية أصغر وأكثر قابلية للإدارة من ملفات الفاصل الزمني. إنشاء مجموعات فرعية إما بالوقت (على سبيل المثال، عرض مكدس Z الكامل عند النقطة الزمنية الأولى) أو حسب العمق (على سبيل المثال، عرض أول 50 مقطعًا من Z في كل نقطة زمنية) بالنقر فوق الصورة| أكوام| أدوات| جعل substack.

7. تحليل اللون الكلوني الكمي من صور بقوس قزح

  1. قياس متوسط قيم كثافة الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) لخلايا الاهتمام في فيجي.
    ملاحظة:     هذه التعليمات خاصة بتحليل الصور في فيجي. ومع ذلك، قد يفضل الباحثون الحصول على قيم كثافة RGB المتوسط في برنامج برنامج بديل.
    1. تأكد من اقتصاص الملف بشكل صحيح بحيث لا توجد مساحة سوداء حول حواف الصورة. سوف الفضاء الأسود بشكل مصطنع خفض قياسات الحد الأدنى كثافة اللازمة للتحليل. إذا كان الملف بحاجة إلى اقتصاص، فحدد زر تحديد المستطيل ورسم منطقة ذات أهمية (ROI) حول حقل العرض، باستثناء كافة المساحة السوداء. انقر على صورة| المحاصيل.
    2. قم بتعيين أداة القياس لأخذ قياسات القيمة الرمادية اللئيمة والدنيا والقصوى. انقر فوق تحليل| تعيين القياسات. تأكد من تحديد خانات الاختيار لقيمة الحد الأقصى والرمادي والقيمة الرمادية المتوسطة.
    3. عرض ملفات البيانات الخام أو مجموعات فرعية Z-أكوام في فيجي، والعثور على خلايا ذات أهمية لتحليل الألوان clonal. في الدماغ الخلفي ، يمكن التعرف على المستنسخين المفترضين بصريًا من خلال هوىهم المشترك بالإضافة إلى اتجاههم الشعاعي. لا تحدد الخلايا التي هي على اتصال وثيق مع، وبالتالي من الصعب حل من، الخلايا المجاورة من لون آخر. قد يكون من الصعب تحديد هوى.
    4. العثور على مركز Z-الطائرة من الخلية ذات الفائدة باستخدام شريط Z-التمرير. انقر بزر الاختيار البيضاوي وحدد زر التحديد البيضاوي. ستكون أدوات التحديد الأخرى مناسبة لأنواع الخلايا المختلفة. رسم عائد الاستثمار بيضاوي الشكل حول المركزية ~ 2/3 من الجسم الخليوي.
    5. باستخدام شريط التمرير C،حدد القناة الحمراء (dTomato). خذ متوسط قياس الكثافة لهذه القناة عن طريق تحديد تحليل| قياس. كرر مع نفس العائد على الاستثمار والمستوى البؤري للقنوات الخضراء (YFP) والأزرق (CFP) وحفظ جميع قيم الكثافة المتوسطة.
    6. انقر في أي مكان على الصورة لإزالة عائد الاستثمار بيضاوي الشكل في خلية الاهتمام.
    7. لقياس مستويات الخلفية للتطبيع، استخدم شريط التمرير C وحدد القناة الحمراء (dTomato). خذ الحد الأدنى لقياس الكثافة للحقل بأكمله في هذه القناة عن طريق تحديد تحليل| قياس. كرر مع نفس المستوى البؤري للقنوات الخضراء (YFP) والأزرق (CFP) وحفظ جميع قيم الحد الأدنى للكثافة.
  2. حساب أوزان قناة RGB النسبية لخلايا الاهتمام.
    ملاحظة:     يمكن إجراء حساب أوزان قناة RGB النسبية من قيم الكثافة هذه في مجموعة متنوعة من البرامج، مثل Microsoft Excel أو R43.
    1. تطبيع متوسط قياس كثافة العائد على الاستثمار الخلية لكل قناة عن طريق طرح الحد الأدنى من كثافة من الحقل بأكمله في تلك القناة والمستوى البؤري.
    2. اجمع قيم كثافة RGB العادية من كل قناة للعثور على إجمالي كثافة RGB العادية للخلية.
    3. احسب وزن القناة النسبي لكل قناة عن طريق تقسيم قيمة الكثافة الوسطى العادية لتلك القناة على إجمالي كثافة RGB العادية.
  3. عرض الأوزان قناة RGB النسبية كمؤامرات ternary باستخدام حزمة Ternary لR43،44. المؤامرات ternary مفيدة لتصور تجميع ألوان مماثلة في مساحة RGB 3D.
  4. احسب معامل انتشار الألوان لتحديد الفرق بين ألوان الخلية.
    1. حساب المسافة الإقليدية بين اللونين في مساحة RGB 3D باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-13837
      حيث R و G و B هي أوزان قناة RGB النسبية المحسوبة في 7.2.
    2. لسهولة الفهم، تطبيع مسافة اللون عن طريق تقسيم ها2 ، المسافة القصوى الممكنة بين الألوان ، للحصول على معامل انتشار اللون بين 0 و 1 ، حيث يشير 0 بالضبط نفس اللون و 1 يشير إلى ألوان مختلفة تمامًا (على سبيل المثال ، نقي الأحمر والأزرق النقي).

النتائج

يوضح هذا القسم أمثلة للنتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام نهج التصوير الفاصل الزمني في الجسم الحي الموضح هنا. نظهر أن استنساخ Brainbow المرمزة بلون الخلايا في منطقة البطين التكاثري من الوحش الوحشي النامية14 (الشكل 1).

عادة، عندما تم ترتيب الخلايا ...

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور استنساخ الخلايا السلف والخلايا العصبية في الدماغ الخلفي الحمار الوحشي النامية ومتابعتها في الجسم الحي باستخدام Brainbow والوقت الفاصل المجهر11. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول بالمقارنة مع في المختبر أو الدراسات الحمراء السابقة هي القدرة على مرا?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر ي. أ. بان، ج. لايفت وز. توبياس على المساهمات التقنية والفكرية. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم (الجائزة 1553764) وصندوق M.J. Murdock الخيري.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL transfer pipette (fine tip)Globe Scientific, Inc.134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Alfa AesarL06690Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubesCorning352070For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing lineSecureLineNMT250For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipetGlobe Scientific, Inc.135010
CaCl2SigmaC3881For E3
Cotton swabsPuritan867-WC NO GLUEFor making embryo manipulators
Cre recombinaseNew England BiolabsM0298M
Digital dry bathGenemate490016-616Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubesWorld Precision InstrumentsTW100F-4
IncubatorForma Scientific3158To maintain embryos at 28 °C
Injection plate moldsAdaptive Science ToolsTU-1
Isotemp water bathFisher Scientific2320For heat shocking embryos
KClAMRESCO0395For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscopeZeissLSM710
LE agaroseGenemateE3120To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA)AMRESCOJ234
Mating tanksAquaneering, Inc.ZHCT100
Methylene blueSigmaM9140For E3
MgSO4Sigma9397For E3
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
MS-222 Tricaine-SWestern Chemical, Inc.Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaClJ.T. Baker4058-01For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm)Genesee Scientific32-107GTo house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol redSigmaP0290
Soft stitch ring markersClover Needlecraft, Inc.354For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control)Loctite1363589For making embryo manipulators
Syringe needlesBeckton DickinsonBD329412For dechorionating embryos

References

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 Brainbow

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved