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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Zusammenfassung

Die Entwicklung des Wirbeltiernervensystems erfordert eine präzise Koordination komplexer zellulärer Verhaltensweisen und Wechselwirkungen. Der Einsatz hochauflösender in vivo-Bildgebungstechniken kann ein klares Fenster in diese Prozesse im lebenden Organismus geben. Zum Beispiel können zellteilungsmittelteilungende Zellen und ihre Nachkommen in Echtzeit verfolgt werden, wenn sich das Nervensystem bildet. In den letzten Jahren haben technische Fortschritte in multicolor-Techniken die Arten von Fragen erweitert, die untersucht werden können. Der mehrfarbige Brainbow-Ansatz kann nicht nur verwendet werden, um zwischen gleichartigen Zellen zu unterscheiden, sondern auch mehrere verschiedene Klone verwandter Zellen, die jeweils aus einer Vorläuferzelle stammen, zu kodieren. Dies ermöglicht eine Multiplex-Linienanalyse vieler verschiedener Klone und deren Verhalten gleichzeitig während der Entwicklung. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren. Dies ist besonders nützlich für die Verfolgung zellulärer Wechselwirkungen zwischen ähnlichen Zellen, die mit traditionellen, von Einem Promoter angetriebenen Farben nur schwer differenziell zu kennzeichnen sind. Unser Ansatz kann verwendet werden, um Linienbeziehungen zwischen mehreren verschiedenen Klonen gleichzeitig zu verfolgen. Die großen Datensätze, die mit dieser Technik generiert werden, liefern umfangreiche Informationen, die quantitativ über genetische oder pharmakologische Manipulationen hinweg verglichen werden können. Letztlich können die generierten Ergebnisse helfen, systematische Fragen zu beantworten, wie sich das Nervensystem entwickelt.

Einleitung

In den frühen Entwicklungsphasen teilen sich Pools spezialisierter Vorläuferzellen wiederholt in proliferativeZonen und produzieren verschiedene Arrays von Tochterzellen. Die Zellen, die während dieser Entwicklungsperiode geboren werden, werden sich dann differenzieren und reisen, um die entstehenden Organe zu bilden. Im Nervensystem führen Vorläufer wie radiale Glia zu unreifen Neuronen in ventrikulären Zonen. Wenn Neuronen von Ventrikeln wegwandern und reifen, bildet das expandierende Gewebe schließlich die hochkomplexen Strukturen des Gehirns1,2,3,4,5,6. Die Koordination zwischen Derliganundierung und Differenzierung und Migration von Neuronen wird die endgültige Größe, Form und damit Funktion des Gehirns bestimmen, direkt beeinflussenverhalten7,8,9,10. Während eine strenge Kontrolle über diese Prozesse eindeutig entscheidend für die normale Gehirnentwicklung ist, sind die globalen Mechanismen, die diese Dynamik regulieren, nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir ein Werkzeug, um die Entwicklung des Nervensystems mit einer zellulären Auflösung zu untersuchen, so dass Forscher Progenitorzellen und Neuronen in vivo im sich entwickelnden Zebrafischhirn mit Brainbow visualisieren und ihr Verhalten im Laufe der Zeit über die Zeitraffer-Konfokalmikroskopie11verfolgen können. Der Ansatz kann auch angepasst werden, um andere Teile des sich entwickelnden Embryos zu visualisieren.

Um zellenimimim entwickelnden Zebrafischhirn zu beobachten und zu unterscheiden, haben wir die Brainbow-Zellbeschriftungstechnik11angepasst. Brainbow verwendet die zufällig ermittelte, kombinatorische Expression von drei verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (FPs), um eine Population von Zellen zu kennzeichnen. Während die Standardexpression für brainbow Expression die rote FP dTomato ist, führt die Rekombination durch das Enzym Cre recombinase zur Expression von mCerulean (Cyan fluoreszierendes Protein, CFP) oder gelbem fluoreszierendem Protein (YFP)12,13. Die kombinierte Menge jedes FP, die in einer Zelle ausgedrückt wird, verleiht ihm einen einzigartigen Farbton, der eine klare visuelle Unterscheidung von benachbarten Zellen ermöglicht. Wenn sich eine Vorläuferzelle teilt, erbt jede Tochterzelle die Farbe von ihrer Mutterzelle, erzeugt farbcodierte Klone und ermöglicht es Forschern, die Zelllinie11,14nachzuverfolgen. Während ursprünglich verwendet, um neuronale Schaltkreise bei Mäusen12zu analysieren, Brainbow wurde seitdem in einer Vielzahl von Modellorganismen exprimiert, einschließlich Zebrafisch15.

Unsere Technik baut auf früheren mehrfarbigen Etikettierungs- und Bildgebungsmethoden auf, um mehrere farbcodierte Klone im Laufe der Zeit direkt in lebenden Zebrafischen abzubilden. Aufgrund ihrer optischen Transparenz als Embryonen eignen sich Zebrafische gut für bildgebende Experimente16, und frühere Studien haben Brainbow in Zebrafischen verwendet, um eine Vielzahl von Geweben zu studieren, einschließlich des Nervensystems11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Die Fähigkeit, sich direkt in den lebenden Organismus einbilden zu können, zusammen mit ihrer schnellen Ex-Utero-Entwicklung, machen Zebrafische zu einem wertvollen Modell der Wirbeltierentwicklung. Im Gegensatz zum Säugetierhirn ist die gesamte proliferative Zone des Zebrafisch-Hinterhirns leicht für die Bildgebung ohne Störung seiner endogeneUmgebung6 verfügbar. Dies ermöglicht Experimente im lebenden Organismus, anstatt in vitro oder festen Gewebepräparaten. Im Gegensatz zu festen bildgebenden Experimenten ermöglichen In-vivo-Studien ein Längsdesign, das stundenlange Datenergebnisse erzeugt, die auf Muster analysiert werden können, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, relativ seltene Ereignisse zu beobachten. Je nach Geschwindigkeit und Länge der Ereignisse von Interesse können die Forscher kurze (1-2 h) oder lange (bis zu 16 h) Zeitraffer-Bildgebungsexperimente durchführen. Durch die Verwendung des Zebrafisch-Wärmeschockpromotors 70 (hsp70, hsp) kann der Brainbow-Ausdruck zeitlich gesteuert werden28,29. Darüber hinaus eignet sich der von diesem Promotor induzierte Mosaikausdruck gut zum Etikettieren und Verfolgen vieler Klone11.

Die Fähigkeit, mehrere Klone im lebenden Gehirn visuell zu identifizieren, ist ein Vorteil dieser Methode. Wichtige frühere Studien, die die Rolle von Klonen in der Entwicklung des Nervensystems untersuchten, nutzten retrovirale Vektoren, um eine einzelne Vorläuferzelle und ihre Nachkommen mit einem einzigen FP oder einem anderen leicht visualisierten Protein zu kennzeichnen. Eine solche Kennzeichnung ermöglicht es Forschern, einen einzelnen Klon im Laufe der Zeit zu beobachten, entweder in vitro oder in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Im Gegensatz zu Methoden, um das Verhalten von Zellen innerhalb eines Klons zu verfolgen, ermöglichen die unterschiedlichen Farben von Brainbow forschern, die Dynamik zwischen Klonen zu beobachten. Darüber hinaus werden durch die Verwendung von Brainbow, um viele Klone im Gehirn zu kennzeichnen, zusätzliche Daten über das klonale Verhalten im Verhältnis zu Techniken gesammelt, die einen einzelnen Klon11kennzeichnen. Wichtig ist, dass die hier beschriebenen Ansätze erweitert werden können, um Entwicklungsvergleiche zwischen Fischen zu erzeugen, die unterschiedliche genetischen oder pharmakologischen Manipulationen unterzogen wurden18. Insgesamt machen diese Vorteile die Zeitraffer-in-vivo-Konfokalbildgebung von Brainbow-exprimierenden Zebrafischen ideal für Forscher, die die Entwicklung des Wirbeltiernervensystems erforschen, insbesondere für diejenigen, die an der Rolle von Klonen interessiert sind.

Protokoll

Verfahren, an denen tiertierische Personen beteiligt sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Lewis & Clark College genehmigt.

1. Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen

  1. Richten Sie wilde Art, erwachsene Zebrafische in sex-getrennten Paarungtanks am Nachmittag vor der Durchführung von Mikroinjektionen39,40.
  2. Bereiten Sie die DNA-Lösung am Morgen der Mikroinjektionen vor. Verdünnung hsp:Zebrabow11 Plasmid-DNA in einer Konzentration von 10 ng/l in 0,1 mM KCl, zusammen mit 2,5% Phenolrot und 3,75U Cre Rekombinantase-Enzym.
  3. Führen Sie Mikroinjektionen von DNA-Lösung in einzellige Zebrafisch-Embryonen innerhalb von 45 min der Befruchtung39,41. Injizieren Sie etwa 4,2 nL dieser Lösung in jeden Embryo, was 42 pg Plasmid-DNA entspricht.
    HINWEIS: Der Mikroinjektionsschritt kann weggelassen werden, wenn stattdessen eine transgene, Brainbow-extierende Zebrafischlinie gepaart wird, wie Tg(ubi:Zebrabow)15 und Tg(neurod:Zebrabow)18. Die Durchführung von Mikroinjektionen kann von Vorteil sein, da es Forschern ermöglicht, die Kopiernummer und DieBeschriftungsdichte zu tittieren. Darüber hinaus kann ein zweites DNA-Konstrukt, das ein bestimmtes Genprodukt markiert oder manipuliert, auf Wunsch neben Brainbow injiziert werden (z. B. ein weitrotes fluoreszierendes Protein, das Brainbow18ergänzt).
  4. Injizierte Embryonen in Petrischalen von E3 medium39 in einem 28 °C-Inkubator für 24 h aufbewahren.

2. Hitzeschock, um Brainbow Expression zu induzieren

HINWEIS: Wenn die injizierte Plasmid-DNA oder das transgene Exprimierte den hsp70-Promotor nicht zum Antrieb der Expression verwendet, kann der Hitzeschockschritt übersprungen werden, und gesunde Embryonen sollten sofort bei 24 h nach der Befruchtung (hpf) auf Phenylthiourea (PTU) übertragen werden.

  1. Bei 24 hpf, keulen tote und deformierte Embryonen aus der Gruppe der injizierten Embryonen. Übertragen Sie dann die gesunden Embryonen in ein 50 ml-Rohr mit bis zu 20 Embryonen/Rohr.
  2. Füllen Sie die Rohre mit 10 ml E3. Legen Sie eine Kappe auf jede Röhre, aber nicht fest schließen.
  3. Legen Sie das Rohrträger mit den 50 ml Rohren aufrecht in ein 37 °C Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand im Bad höher ist als der Niveau des E3 in den Rohren und lassen Sie sie für 80 bis 90 min.
  4. Entfernen Sie das Rohrgestell mit den Embryonen aus dem Wasserbad und kehren Sie aufrecht zum 28 °C-Inkubator zurück. Lassen Sie bis zu 1 h für die E3 abkühlen und die Embryonen allmählich wieder auf die Temperatur zu akklimatisieren. Dann übertragen Sie die Embryonen auf Petrischalen von 0,2 mM PTU in E3 erwärmt im Inkubator, um Pigmentierung von Embryonen zu verhindern.
    ACHTUNG: PTU ist eine giftige Chemikalie, die mit Sorgfalt behandelt und entsprechend entsorgt werden sollte. Es wird empfohlen, Handschuhe zu tragen.

3. Screening-Embryonen für Brainbow Expression

  1. Untersuchen Sie die Embryonen nach dem Hitzeschock 2 bis 4 h nach dem Hitzeschock unter einem Standardfluoreszenz-Dissektionsmikroskop auf expression von GFP oder YFP, was auf eine erfolgreiche Brainbow-Rekombination (von der Standardexpression von dTomato) hinweist.
    HINWEIS: Wenn mehrere Fluoreszenzfilteroptionen verfügbar sind, ist das Screening auf CFP die effizienteste Möglichkeit, gut rekombinierte Fische zu identifizieren. Wenn GFP- und YFP-Filter nicht verfügbar sind, kann YFP aufgrund der Überlappung in ihren Spektralprofilen auch unter GFP-Filtern (Green Fluorescent Protein) nur wenig visualisiert werden.
  2. Wählen Sie Embryonen mit robuster FP-Expression durch und übertragen Sie sie auf eine separate Schale mit PTU. Bild-Embryonen bei 1 Tag nach der Befruchtung (dpf; 28 hpf oder höher) oder pflegen Embryonen in PTU und Bild bei 2 oder 3 dpf.

4. Montage von Embryonen für In Vivo Imaging

  1. Bereiten Sie vor dem Tag des Experiments die Bildgebungskammer und das Werkzeug zur Embryonenmanipulation vor.
    1. Bereiten Sie die Bildkammer vor, indem Sie einen Kunststoffring sorgfältig in die Mitte einer 60 mm Petrischale überkleben.
    2. Optional bereiten Sie einen maßgeschneiderten Embryomanipulator vor, um Embryonen innerhalb der Schale zu bewegen und Embryonen während der Montage zu orientieren. Konstruieren Sie den Manipulator, indem Sie eine kleine Länge der Nylon-Angelschnur (1,5 000, 6 lb) bis zum Ende eines hölzernen Wattestäbchens, der auf eine Länge von 4 Dollar geschnitten wurde, überkleben.
  2. Falls erforderlich (d.h. Bildgebung bei 2 dpf oder früher), bevor die Embryonen mit Spritzen unter einem Seziermikroskop montiert werden.
  3. Anästhesisieren Zebrafisch Embryonen.
    1. Füllen Sie eine 60 mm Petrischale auf halbem Weg mit E3 und fügen Sie 5–6 Tropfen von 4 mg/ml MS-222 Tricaine-S zu einer Endkonzentration von 0,2 mM hinzu. Wirbel nieren.
      ACHTUNG: Tricaine sollte mit Sorgfalt behandelt und entsprechend entsorgt werden.
    2. Übertragen Sie Embryonen von der PTU auf die Tricain-Lösung, um sicherzustellen, dass so wenig PTU wie möglich übertragen wird. Während Fischreflexe nach 1–2 min aufhören sollten, lassen Sie die Embryonen in Tricain bis zu 10 min, um eine gründliche Anästhesie für Zeitraffer-Bildgebungsexperimente zu gewährleisten.
    3. Bestätigen Sie, dass die Embryonen richtig anästhesisiert sind. Bewerten Sie den Erdreflex, indem Sie die Embryoschwänze sanft mit dem Embryomanipulator berühren. Wenn eine Reflexbewegung beobachtet wird, fügen Sie der Schale einen zusätzlichen Tropfen Tricain so weit wie möglich von den Embryonen hinzu und wirbeln Sie zum Mischen. Beobachten Sie die Embryo-Herzfrequenz unter einem Sezierbereich. Wenn es ungewöhnlich langsam ist, fügen Sie zusätzliche Tropfen E3 in die Schale, um die Tricain-Konzentration zu reduzieren.
  4. Mount anästhesierte Embryonen in Agarose.
    1. Übertragen Sie den Fisch in die Mitte des Kunststoffrings innerhalb der Bildkammer und entfernen Sie so viel überschüssiges E3 wie möglich mit einer feingekippten Transferpipette.
    2. Mit einer sauberen Transferpipette die Fische mit 1,0% schmelzarmer Agarose (LMA) in E3 bei 42 °C lagern und den gesamten Kunststoffring mit einer dünnen Agaroseschicht füllen. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Embryonen sanft in die Pipettespitze und zurück in die Agarose zu ziehen, ohne Luftblasen einzuführen.
    3. Bevor die Agarose verhärtet, verwenden Sie schnell einen Embryo-Manipulator, um den Fisch angemessen auszurichten. Wenn Sie die Bilder mit einem aufrechten Mikroskop abbilden, positionieren Sie die Embryonen so nah wie möglich an der oberen Oberfläche der Agarose. Positionieren Sie die Embryonen parallel zur Unterseite der Bildkammer mit dem Geraden des Schwanzes.
      HINWEIS: Für die Hinterhirnbildgebung können die Embryonen in einer dorsalen oder sagittalen Ansicht positioniert werden. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Köpfe der Embryonen nicht sinken, während die Agarose noch flüssig ist. Andere Orientierungen können geeignet sein, andere sich entwickelnde Gewebe für die Bildgebung zu zielen. Bei invertierten Mikroskopen würde die Montage anders erfolgen, da der Fisch in der Regel in der Nähe des Bodens einer Glasboden-Petrischale positioniert wird.
  5. Warten Sie, bis die Agarose aushärtet, und füllen Sie dann die Bildkammer mit E3. Fügen Sie so viel E3 wie möglich hinzu, um die Verdunstung im Verlauf der Bildgebung zu berücksichtigen.

5. Zeitraffer Konfokalbildgebung der Entwicklung zebrafish Hindbrain

  1. Legen Sie die Bildgebungskammer in Vorbereitung auf die Bildgebung auf das konfokale Mikroskop.
    1. Legen Sie die Bildkammer mit dem Fisch und E3 auf das konfokale Mikroskop.
    2. Wählen Sie ein Ziel mit einer hohen numerischen Blende und einem langen Arbeitsabstand, z. B. ein 20-faches Wassertauchziel (1,0 NA).
    3. Suchen Sie einen Bereich mit entsprechend dichter und heller Beschriftung des/der Zelltyps von Interesse.
      HINWEIS: Ein temperaturgeregeltes Stadium/Gerät am Mikroskop kann auch verwendet werden, um Temperatur und Luftfeuchtigkeit während langer Bildgebungssitzungen zu regulieren. Dies kann die Verdunstung verringern.
  2. Richten Sie die Erfassungsparameter für die Brainbow-Bildgebung ein.
    1. Bildn jeder FP-Kanal sequenziell. Bei Verwendung einer kommerziellen Software (z.B. Zen-Software) erfolgt dies durch die Vorbereitung von drei "Tracks". Verwenden Sie einen Argon-Laser, um CFP bei 458 nm und YFP bei 514 nm zu begeistern. Verwenden Sie einen DPSS 561 nm Laser, um dTomato zu begeistern. Sammeln Sie Emissionen zwischen 463–509 nm für CFP, 519–555 nm für YFP und 566–691 nm für dTomato.
    2. Für die Bildschirmanzeige code CFP als blau, YFP als gelb und dTomato als rot.
      HINWEIS: Diese Einstellungen variieren je nachdem, welche Laserlinien und andere Funktionen auf dem konfokalen Mikroskop verfügbar sind. Um die Geschwindigkeit der Bildgebung zu erhöhen, können CFP- und dTomato-Kanäle gleichzeitig ohne nennenswerte Durchblutung abgebildet werden. Wenn auch ein separates FP abgebildet wird, z. B. ein rot-rotes FP, kann dies sequenziell oder gleichzeitig mit YFP abgebildet werden.
    3. Richten Sie die allgemeinen Bildgebungsparameter ein, um 16-Bit-Bilder mit einer Auflösung von mindestens 1024 x 1024 und einer durchschnittlichen Gesamtauflösung von zwei Personen aufzunehmen. Passen Sie den Zoom abhängig von der Region und dem Zelltyp des Interesses an (d. h. für die Hinterhirnbildgebung mit einem 20-fachen Objektiv reicht der Zoom von 1,0 bis 2,5). Maximieren Sie das Sichtfeld, um das Wachstum der Fische im Laufe der Zeit zu ermöglichen.
    4. Anzeigen einer Spur nach der anderen (und Ausschalten anderer Laser, um Photobleichungen zu verhindern), optimieren Sie die Erfassungseinstellungen für jedes FP einzeln (z. B. Laserleistung, Lochgröße, Photomultiplierrohrverstärkung usw.).
    5. Wählen Sie Z-Stack-Bereich zum Abbild aus.
      HINWEIS: Bei langen Bildgebungssitzungen (>2 h) sollten Sie berücksichtigen, dass die Fische im Laufe der Bildgebung weiter wachsen werden, so dass sowohl das XY-Feld als auch der Z-Stack-Bereich dies mit zusätzlichem Raum berücksichtigen sollten. Wenn die Abbildung des Hinterhirns, enthalten Raum im Feld für das Gewebe rostral während der Bildgebungsphase zu bewegen. Auch für das Wachstum in der Z-Dimension muss Der Raum einbezogen werden. Fügen Sie in das Bild ca. 10–20 m über dem Interessengebiet ein, unabhängig davon, ob der Fisch für sagittale oder dorsale Sicht positioniert ist.
  3. Richten Sie Parameter für die Zeitraffer-Bildgebung ein.
    1. Wählen Sie ein Zeitintervall aus. Intervalllänge reicht zwischen 10 und 30 min, um mitotische und apoptotische Ereignisse im sich entwickelnden Hinterhirn zu verfolgen. Die Intervalllänge hängt von der Geschwindigkeit der Ereignisse ab, die von Interesse sind, und der Gesamtzeit, die zum Erfassen eines einzelnen Z-Stacks benötigt wird.
    2. Wählen Sie die Länge der Imaging-Sitzung aus. Zeitraffer-Bildgebungssitzungen treten in der Regel über Nacht auf und können mindestens 16 h dauern.
  4. Führen Sie das Experiment aus.
    HINWEIS:     Der Fisch kann unmittelbar nach der Bildgebung eingeschläfert oder vorsichtig von der Agarose mit Spritzen seziert und zur Genesung an E3 zurückgegeben werden. Zurückgewonnene Fische können dann zu einem späteren Zeitpunkt wieder abgebildet werden, obwohl sich Die Zellposition und -tiefe während dieses Zeitraums aufgrund des Gesamtwachstums verschieben wird.

6. Zeitraffer-Dateiverwaltung

  1. Importieren Sie die Bilddatei in die Analysesoftware.
    1. Wenn Sie Zen-Software verwenden, speichern Sie die Datei im .czi-Format, sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist. Stellen Sie sicher, rohdaten in einem Format zu speichern, das mit Fidschi42 und/oder anderer Software kompatibel ist.
    2. Importieren Sie in Fidschi-Software mit BioFormats Importer.
      HINWEIS: Zeitrafferdateien sind groß und können erhebliche Zeit- und Arbeitsspeichermengen erfordern, um sie für die Analyse zu öffnen. Daher ist es hilfreich, strategisch zu sein, wie sie gespeichert und geöffnet werden. Es kann nützlich sein, eine version mit geringerer Qualität zu speichern, die leichter geöffnet werden kann, um nach Ereignissen von Interesse per Auge zu suchen.
  2. Wenn Sie Fidschi verwenden, erstellen Sie kleinere, leichter verwaltbare Teilmengen von Zeitrafferdateien. Generieren Sie Teilmengen entweder nach Zeit (z. B. Anzeigen des vollständigen Z-Stacks beim ersten Zeitpunkt) oder nach Tiefe (z. B. Anzeigen der ersten 50 Z-Abschnitte zu jedem Zeitpunkt), indem Sie auf Bild| Stapel| Werkzeuge| Machen Sie Substack.

7. Quantitative Clonal Color Analysis of Brainbow Images

  1. Messen Sie die mittleren roten, grünen und blauen (RGB) Intensitätswerte für die Zellen, die in Fidschi von Interesse sind.
    HINWEIS:     Diese Anweisungen sind spezifisch für die Bildanalyse in Fidschi. Jedoch, Forscher können es vorziehen, mittlere RGB-Intensitätswerte in einem alternativen Software-Programm zu erhalten.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Datei korrekt zugeschnitten ist, sodass an den Rändern des Bildes kein schwarzer Raum vorhanden ist. Schwarzer Raum senkt die für die Analyse erforderlichen Minimalintensitätsmessungen künstlich. Wenn die Datei zugeschnitten werden muss, wählen Sie die Rechteckauswahlschaltfläche aus, und zeichnen Sie einen Bereich von Interesse (ROI) um das Sichtfeld, ohne den gesamten schwarzen Raum. Klicken Sie auf Bild| Ernte.
    2. Legen Sie das Messwerkzeug so fest, dass Mittelwert-, Minimal- und maximaler Grauwert gemessen werden. Klicken Sie auf Analysieren| Stellen Sie Messungen ein. Stellen Sie sicher, dass die Kontrollkästchen für Min & Max Gray Value und Mean Gray Value ausgewählt sind.
    3. Anzeigen der Rohdatendateien oder subsetted Z-Stacks in Fidschi, finden Sie Zellen von Interesse für klonale Farbanalyse. Im Hinterhirn können vermeintliche Klone visuell durch ihren gemeinsamen Farbton sowie ihre radiale Ausrichtung identifiziert werden. Wählen Sie keine Zellen aus, die in engem Kontakt mit benachbarten Zellen einer anderen Farbe stehen und daher schwer aufzulösen sind. Es kann schwierig sein, ihren Farbton zu quantifizieren.
    4. Mit der Z-Scrollbarfinden Sie die mittlere Z-Ebene der Zelle von Interesse. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Ovale Auswahl, und wählen Sie die Schaltfläche "Elliptische Auswahl"aus. Andere Auswahlwerkzeuge sind für verschiedene Zelltypen geeignet. Zeichnen Sie einen elliptischen ROI um die zentrale Nr. 2/3 des Zellkörpers.
    5. Wählen Sie mit der C-Scrollbarden roten (dTomato) Kanal aus. Nehmen Sie die mittlere Intensitätsmessung für diesen Kanal, indem Sie Analysieren| Maßnahme. Wiederholen Sie dies mit demselben ROI und der gleichen Fokusebene für die grünen (YFP) und blauen (CFP) Kanäle und speichern Sie alle mittleren Intensitätswerte.
    6. Klicken Sie auf eine beliebige Stelle auf dem Bild, um den elliptischen ROI in der betreffenden Zelle zu entfernen.
    7. Um Hintergrundebenen für die Normalisierung zu messen, verwenden Sie die C-Scrollbar und wählen Sie den roten (dTomato) Kanal aus. Nehmen Sie die minimale Intensitätsmessung für das gesamte Feld in diesem Kanal, indem Sie Analysieren| Maßnahme. Wiederholen Sie dies mit derselben Brennweite für die grünen (YFP) und blauen (GFP) Kanäle, und speichern Sie alle Minimalintensitätswerte.
  2. Berechnen Sie relative RGB-Kanalgewichtungen für die von Interesse sindden Zellen.
    HINWEIS:     Die Berechnung der relativen RGB-Kanalgewichtungen aus diesen Intensitätswerten kann in einer Vielzahl von Softwareprogrammen wie Microsoft Excel oder R43durchgeführt werden.
    1. Normalisieren Sie die mittlere Intensitätsmessung des Zell-ROI für jeden Kanal, indem Sie die minimale Intensität vom gesamten Feld in diesem Kanal und der Brennebenen subtrahieren.
    2. Summiert die normalisierten mittleren RGB-Intensitätswerte aus jedem Kanal, um die gesamte normalisierte RGB-Intensität für die Zelle zu ermitteln.
    3. Berechnen Sie die relative Kanalgewichtung für jeden Kanal, indem Sie den normalisierten mittleren Intensitätswert für diesen Kanal durch die gesamte normalisierte RGB-Intensität dividieren.
  3. Relative RGB-Kanalgewichtungen als ternäre Plots mit dem Ternary-Paket für R43,44anzeigen. Ternäre Plots sind nützlich, um das Clustering ähnlicher Farben im 3D-RGB-Raum zu visualisieren.
  4. Berechnen Sie den Farbstreukoeffizient, um die Differenz zwischen den Zellenfarben zu quantifizieren.
    1. Berechnen Sie den euklidischen Abstand zwischen den beiden Farben im 3D-RGB-Raum mit der folgenden Gleichung:
      figure-protocol-18288
      wobei R, G und B die relativen RGB-Kanalgewichtungen sind, die in 7.2 berechnet werden.
    2. Um das Verständnis zu erleichtern, normalisieren Sie den Farbabstand, indem Sie den maximal möglichen Abstand zwischen den Farben durch den maximal möglichen Abstand zwischen den Farben dividieren, um einen Farbstreukoeffizienten zwischen 0 und 1 zu erhalten, wobei 0 genau die gleiche Farbe und 1 völlig unterschiedliche Farben anzeigt (z. B. rein rot und reinblau).

Ergebnisse

In diesem Abschnitt werden Beispiele für Ergebnisse veranschaulicht, die mit dem hier beschriebenen mehrfarbigen Zeitraffer-Bildgebungsansatz in vivo erzielt werden können. Wir zeigen, dass Brainbow farbcodierte Klone von Zellen in der proliferativen ventrikulären Zone des sich entwickelnden Zebrafisch-Hinterhirns14 (Abbildung 1).

Wenn Brainbow-markierte Zellen entlang einer bestimmten radialen Faser angeordnet waren, teilten sie in der ...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung von Klonen von Vorläuferzellen und Neuronen im sich entwickelnden Zebrafisch-Hindbrain und folgt ihnen in vivo mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalmikroskopie11. Der große Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu In-vitro- oder Ex-vivo-Studien ist die Fähigkeit, die proliferative Zone des Wirbeltierhirns in seinem natürlichen Milieu im Laufe der Zeit direkt zu beobachten. Diese Technik baut auf früheren Studien auf, die einen einzel...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Y. A. Pan, J. Livet und Z. Tobias für ihre technischen und intellektuellen Beiträge. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (Preis 1553764) und dem M.J. Murdock Charitable Trust unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL transfer pipette (fine tip)Globe Scientific, Inc.134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Alfa AesarL06690Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubesCorning352070For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing lineSecureLineNMT250For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipetGlobe Scientific, Inc.135010
CaCl2SigmaC3881For E3
Cotton swabsPuritan867-WC NO GLUEFor making embryo manipulators
Cre recombinaseNew England BiolabsM0298M
Digital dry bathGenemate490016-616Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubesWorld Precision InstrumentsTW100F-4
IncubatorForma Scientific3158To maintain embryos at 28 °C
Injection plate moldsAdaptive Science ToolsTU-1
Isotemp water bathFisher Scientific2320For heat shocking embryos
KClAMRESCO0395For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscopeZeissLSM710
LE agaroseGenemateE3120To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA)AMRESCOJ234
Mating tanksAquaneering, Inc.ZHCT100
Methylene blueSigmaM9140For E3
MgSO4Sigma9397For E3
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
MS-222 Tricaine-SWestern Chemical, Inc.Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaClJ.T. Baker4058-01For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm)Genesee Scientific32-107GTo house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol redSigmaP0290
Soft stitch ring markersClover Needlecraft, Inc.354For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control)Loctite1363589For making embryo manipulators
Syringe needlesBeckton DickinsonBD329412For dechorionating embryos

Referenzen

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