Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توجيه كيفية استخراج وصيانة وفصل الخلايا المادرينية وخلايا الميكروجليا من الجهاز العصبي المركزي ، تليها العدوى بالطفيليات الأولية.

Abstract

الخلايا الفلكية وmicroglia هي الخلايا الدبقية الأكثر وفرة. وهي مسؤولة عن الدعم الفسيولوجي وصيانة التوازن في الجهاز العصبي المركزي (CNS). وتبرر الأدلة المتزايدة على مشاركتها في مكافحة الأمراض المعدية الاهتمام الناشئ بتحسين منهجيات عزل الخلايا الفلكية الأولية والميكروغليا من أجل تقييم استجاباتها للإصابات التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. بالنظر إلى تأثير تريبانوصوما كروزي (T. cruzi) وToxoplasma gondii (T. gondii)العدوى في الجهاز العصبي المركزي ، نقدم هنا طريقة لاستخراج وصيانة وانفصام وإصابة الخلايا الفلكية المادرين وخلايا microglia مع الطفيليات البروتوزوا. يتم الاحتفاظ بالخلايا المستخرجة من القشريات حديثي الولادة في المختبر لمدة 14 يومًا مع استبدال الوسائط التفاضلية الدورية. يتم الحصول على الخلايا الفلكية وmicroglia من نفس بروتوكول الاستخراج عن طريق التفكك الميكانيكي. بعد الفينومينب عن طريق قياس خلايا التدفق ، تصاب الخلايا بطفيليات بروتوزوا. يتم تحديد معدل العدوى عن طريق المجهر الفلوري في نقاط زمنية مختلفة ، مما يتيح تقييم القدرة التفاضلية للخلايا الدبقية على السيطرة على غزو البروتوزوان والنسخ المتماثل. تمثل هذه التقنيات طرقًا بسيطة ورخيصة وفعالة لدراسة استجابات الخلايا الفلكية والميكروجليا للعدوى ، مما يفتح المجال لمزيد من تحليل المناعة العصبية.

Introduction

ويتكون الجهاز العصبي المركزي أساسا من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية1,2,3. Microglia والخلايا الفلكية هي خلايا جليا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي. Microglia، الضامة المقيم، هو المناعة والخلية غليا البلعوم في CNS3،,4،في حين أن الخلايا الفلكية هي المسؤولة عن الحفاظ على التوازن وممارسة وظائف داعمة5.

على الرغم من الخلايا الدبقية التي تعرف تقليديا لتكون مسؤولة عن دعم وحماية الخلايا العصبية6,7, وقد وصفت الوظائف الناشئة من هذه الخلايا في الأدب الأخير, بما في ذلك استجاباتهم للعدوى8,9,,10,11. وبالتالي ، هناك دفع لتطوير أساليب لعزل هذه الخلايا الدبقية لفهم وظائفها بشكل فردي.

هناك بعض النماذج البديلة لدراسة الخلايا الدبقية بدلا من الثقافات الأولية، مثل الأنساب الخلايا الخالدة وفي نماذج الحي. ومع ذلك ، فإن الخلايا الخالدة أكثر عرضة للخضوع للانجراف الوراثي والتغيرات المورفولوجية ، في حين أن الدراسات في الجسم الحي تفرض شروط تلاعب محدودة. على العكس من ذلك، الثقافات الأولية هي سهلة للتعامل معها، أفضل تشبه في خلايا الجسم الحي وتسمح لنا أيضا للسيطرة على العوامل التجريبية12،,13. هنا، ونحن نصف المبادئ التوجيهية حول كيفية استخراج والحفاظ على وفصلها الخلايا الفلكية المورين والخلايا الأولية microglia في نفس البروتوكول. وعلاوة على ذلك، نقدم أيضا أمثلة على كيفية العمل مع عدوى البروتوزوا في هذه الثقافات.

تم استزراع خلايا الجهاز العصبي المركزي المستخرجة من الفئران الوليدية (حتى 3 أيام) لمدة 14 يومًا على الوسائط التفاضلية التي تسمح بالنمو التفضيلي للخلايا الفلكية وخلايا الميكروجليا. وبما أن الميكروجليا ترتاح فوق الخلايا الفلكية المرفقة، فقد انفصلت مجموعات الخلايا ميكانيكيا ً في حاضنة مدارية. بعد ذلك ، جمعنا كل supernatant التي تحتوي على microglia وأضاف التربسين لفصل الخلايا الفلكية. تم تقييم الخلايا الدبقية المعزولة بشكل ظاهري عن طريق قياس خلايا التدفق ومطلية وفقًا للتجربة المطلوبة.

كما قدمنا أمثلة حول كيفية إصابة هذه الميكروجليا المعزولة والخلايا الفلكية بالطفيليات الأولية. T. gondii هو protozoan العصبية للغاية المسؤولة عن toxoplasmosis14, في حين T. كروزالأول هو المسؤول عن مرض شاغاس الذي يمكن أن يؤدي إلى تطوير الاضطرابات العصبية في الجهاز العصبي المركزي15,16. وعلاوة على ذلك, وقد أفيد أيضا أن العدوى مع T. gondii17,18 أو T. cruzi19,20,21 كانت السبب المفترض للوفاة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة. لذلك ، فإن توضيح الدور المناعي للخلايا الدبقية من الجهاز العصبي المركزي في السيطرة على التهابات البروتوزوا له أهمية كبيرة.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة بالفئران وفقا للقانون الوطني البرازيلي (11.794/2008) ووافقت عليها اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة ساو باولو الاتحادية.

1. استخراج الخلايا الدبقية والصيانة والتفكك

ملاحظة: يعتمد عدد الفئران المستخدمة لاستخراج الخلايا الدبقية على كمية الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب المطلوبة. في هذا البروتوكول، تم الحصول على ما مجموعه 2.7 × 107 الخلايا الفلكية و 4 × 106 ميكروجليا من ستة فئران C57BL/6 حديثي الولادة. تم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل حالة معقمة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.

  1. اليوم الأول
    1. قم بإعداد محلول الملح المتوازن من هانك النقي (HBSS) وHBSS + 10٪ من مصل الأبقار الجنيني المعطل للحرارة (FBS) (انظر جدول المواد).
    2. إعداد مكملة جلف تعديل جلكو المتوسط (DMEM)/F12 (10٪ FBS + 0.08 mM Penicillin + 0.09 mM Streptomycin + 12.5 mM HEPES + 30 mm الصوديوم بيكربونات، درجة الحموضة 7.2) وتصفيته مع مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يجب تخزين كافة الوسائط الثقافية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية، ولكن من الضروري التسخين المسبق لها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل بدء التجربة.
    3. تعقيم جميع الأدوات الجراحية (مقص، ملعقة وملاقط) في الأوتوكلاف واستخدام الإيثانول 70٪ أثناء العملية.
    4. وضع الأطفال حديثي الولادة (حتى 3 أيام) الفئران في غرفة مختومة تحتوي على القطن غارقة مع إيزوفران لمدة 5 دقيقة للتخدير العميق.
    5. رش الجرو الماوس مع الإيثانول 70٪ وقطع رأس الحيوان مع مقص.
    6. جعل قطع sagittal (الخلفي إلى الأمامي) مع مقص على طول الجمجمة لفتحه وفضح الدماغ. فصل الجمجمة عن الدماغ باستخدام ملاقط. إزالة الدماغ باستخدام ملعقة صغيرة للحفاظ على سلامة الدماغ.
    7. ضع الدماغ في طبق بتري جاف (قطره 6 سم). إزالة لمبة الشم والمخيخ باستخدام ملعقة صغيرة. نقل القشرة إلى طبق آخر بيتري (قطر 6 سم) التي تحتوي على HBSS + 10٪ FBS (2 مل / طبق بيتري).
    8. قطع أنسجة الدماغ إلى قطع صغيرة مع مقص معقم واستخدام p1000 micropipette نقل كل أنسجة الدماغ مع HBSS + 10% FBS إلى أنابيب مخروطية مختلفة 15 مل. تأكد من أن حجم النهائي هو 2 مل / أنبوب. إذا لم يكن كذلك ، كاملة مع HBSS + 10 ٪ FBS.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. إذا كان الأمر كذلك ، يجب وضع أنابيب مخروطية مع أنسجة CNS على الجليد حتى ساعة واحدة.
    9. غسل أنسجة الدماغ قطع مع 3 مل من HBSS + 10٪ FBS (لكل أنبوب) وبعد التفكيك. إزالة بعناية supernatant. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
      ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إزالة الحطام واستعادة الأنسجة المستخرجة.
    10. غسل أنسجة الدماغ قطع مع 3 مل من HBSS نقية (لكل أنبوب) وبعد decantation، وإزالة بعناية supernatant. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
      ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إزالة المصل المتبقي من السهوات السابقة، حيث سيتم trypsinized الخلايا في الخطوة التالية.
    11. إضافة 3 مل من التربسين لكل أنبوب ومكان في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، يهز بلطف أنابيب كل 5 دقيقة. تجنب فقاعات عن طريق عكس أو خلط فجأة الأنابيب.
      ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى هضم الأنسجة التي تم جمعها.
    12. لتعطيل التربسين، اغسل الأنسجة بـ 3 مل لكل أنبوب من HBSS + 10% FBS، وبعد إزالة الأنسجة، قم بإزالة الفوق. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
    13. غسل الأنسجة مع 3 مل لكل أنبوب من HBSS نقية وإزالة بعناية supernatant. كرر هذه الخطوة مرتين.
    14. إضافة 7 مل لكل أنبوب من HBSS نقية وتجانس الأنسجة من خلال ممرات متتالية في الماصة: أولا مع ماصة المصلية 10 مل، تليها 5 مل وأخيرا مع micropipette p1000.
    15. بعد التجانس، أنابيب الطرد المركزي في 450 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    16. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 4 مل من HBSS + 10٪ FBS لكل أنبوب.
    17. نقل الخلايا إلى قارورة T-75 المعالجة مسبقًا للحصول على التصاق مثالي بثقافة الخلية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: معالجة الأنسجة من كل الحيوان لكل قارورة.
    18. ضع القارورة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربونلمدة 30 دقيقة للتقيد.
    19. أضف 10 مل من DMEM/F12 المكمللكل قارورة وحضن عند 37 درجة مئوية و5% CO2.
      ملاحظة: وحدة التخزين النهائية هو 14 مل لكل قارورة.
  2. اليوم الثالث
    1. إزالة 7 مل من الثقافة المتوسطة من قارورة T-75 وإضافة 7 مل من DMEM/F12 التكميلية الطازجة.
      ملاحظة: سوف تحتوي القوارير على الكثير من الحطام الخلوي ومظهر غائم.
  3. اليوم الخامس
    1. إزالة جميع المتوسطة من قارورة T-75 وإضافة 14 مل من DMEM/F12 التكميلية الطازجة.
      ملاحظة: يتم استبدال المتوسطة من القوارير لإزالة الحطام والخلايا غير الملتصقة.
    2. بعد كل 48 ساعة، وإزالة 6 مل من supernatant وإضافة 7 مل من جديد تكمل DMEM/F12 المتوسطة حتى اليوم 14 من الثقافة.
  4. اليوم الرابع عشر
    1. بعد إزالة 6 مل من supernatant وإضافة 7 مل من جديد تكملة DMEM/F12 المتوسطة، وإغلاق قوارير T-75 بإحكام.
    2. وضعها في الكلمة شاكر المداري في 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لفصل ميكانيكيا microglia من الخلايا الفلكية.
  5. اليوم الخامس عشر
    1. تأخذ القوارير من شاكر وغسلها بقوة مع المتوسطة الخاصة بهم من أجل تحسين الخلايا وحصاد أكبر عدد ممكن من microglia. ثم، وجمع supernatant (التي تحتوي على microglia) ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. بعد ذلك، إضافة 4 مل من التربسين في كل قارورة واحتضان لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية من أجل فصل الخلايا الفلكية.
    3. إضافة 5 مل لكل قارورة من DMEM/F12 التكميلية لتعطيل التربسين. اغسل القوارير بوسيطها الخاص ونقل محتوياتها إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    4. الطرد المركزي جميع الأنابيب التي تحتوي على microglia منفصلة والخلايا الفلكية في 450 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    5. تجاهل supernatant. إعادة تعليق بيليه microglia في 1 مل والخلايا الفلكية في 10 مل من DMEM/F12 التكميلية.
    6. انتقل إلى عد الخلايا في غرفة نيوباور أو عداد الخلية التلقائي. لوحة الخلايا مع مكملة DMEM/F12 في الكثافة المطلوبة في لوحة ثقافة الخلية السفلية المسطحة المناسبة (المعالجة المسبقة لمرفق الخلية الأمثل؛ انظر جدول المواد). الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة للسماح لهم بإرفاق.
      ملاحظة: حجز 1.5 × 106 من كل مجموعة من خلايا لتأكيد نقاوتها عن طريق قياس الخلايا التدفق.
    7. إجراء تحليل قياس خلايا التدفق للتحقق من نقاء مجموعات الخلايا.
      ملاحظة: نحن نعتبر microglia CD11b+/ CD45+/ GFAP- والخلايا الفلكية CD11b-/ CD45-/GFAP+. ويمكن النظر في iba1 وTMEM119 تلطيخ من أجل توصيف تماما microglia22.
    8. إضافة FMO (فلورسينس ناقص واحد)23 وعينة غير ملطخة لكل مجموعة من الخلايا (الخلايا الفلكية وmicroglia) كضوابط قياس الخلايا التدفق.
    9. لكل مجموعة من الخلايا، حجز 5 × 105 خلايا لكل عينات ملطخة وغير ملطخة. لFMO، حجز اثنين من أنابيب أخرى من microglia تحتوي على 2.5 × 105 خلايا لكل منهما وحجز أيضا أنبوب آخر من 5 × 105 الخلايا الفلكية.
      ملاحظة: بما أن أرقام الميكروجليا يمكن أن تكون عاملاً مقيداً، فمن الممكن استخدام عدد أقل من الخلايا لعناصر التحكم غير الملطخة وFMO.
    10. طرد مركزي جميع الأنابيب الدقيقة في 450 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 500 ميكرولتر / ميكروتيوب من المخزن المؤقت FACS (الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS) + 0.5٪ ألبوم مصل البقري (BSA) + 2 mM EDTA، درجة الحموضة 7.2).
    11. الطرد المركزي جميع الأنابيب الدقيقة في 450 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 100 ميكرولتر / ميكروtube من مكافحة CD16/CD32 (استنساخ 93) (1:50) المخفف في المخزن المؤقت FACS. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    12. أضف 500 ميكرولتر/ميكروأنبوب من عازل FACS إلى جميع الأنابيب الدقيقة والطرد المركزي عند 450 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقيقة. تخلص من الsupernatant. إعادة تعليق الخلايا الفلكية وأنابيب تلطيخ microglia وأيضا أنبوب FMO astrocyte مع 50 ميكرولتر / ميكروأنبوب من علامات السطح مزيج: مكافحة CD45 (PE, استنساخ 30-F11) ومكافحة CD11b (eFluor 450, استنساخ M1/70) (كلاهما المخفف في 1: 100 في المخزن المؤقت FACS).
    13. بالنسبة للخلايا غير الملطخة، قم بإعادة التعليق بنفس حجم المخزن المؤقت FACS. لmicroglia FMO، احتضان كل أنبوب microglia مع مكافحة CD45 أو مكافحة CD11b. احتضان جميع العينات في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
    14. إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل ميكروتيو. الطرد المركزي في 450 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 100 ميكرولتر / microtube من تثبيت المخزن المؤقت (انظر جدول المواد)لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    15. أضف 500 ميكرولتر/ميكروتيوب من حاجز التبيرية 1x (انظر جدول المواد)واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقيقة في الظلام.
    16. طرد مركزي جميع الأنابيب الدقيقة في 450 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. إعادة تعليق الخلايا الفلكية وأنابيب تلطيخ microglia وأيضا أنابيب FMO microglia مع 50 ميكرولتر / ميكروأنبوب من الأجسام المضادة داخل الخلايا المضادة لGFAP (APC، استنساخ GA5) في تخفيف 1:100 في 1x العازلة التحمل. بالنسبة للخلايا غير الملطخة وFMO الفلكية، قم بإعادة تعليق الخلايا بنفس حجم المخزن المؤقت FACS. احتضان جميع العينات في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    17. اغسل جميع الأنابيب بإضافة 500 ميكرولتر/ميكروتيوب من حاجز التعامّل 1x. طرد مركزي جميع الأنابيب الدقيقة في 450 × ز، لمدة 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. إعادة تعليق كل أنبوب صغير في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. الحصول على 1 × 105 أحداث / عينة على مقياس التدفق الخلوي.
    18. للتحليل، يجب أن تكون الخلايا مسورة أولاً على CD11b x CD45 ثم GFAP الرسم البياني.
      ملاحظة: عناصر التحكم غير الملطخة وFMO مفيدة لتحديد البوابات.

2- العدوى وتقييم معدلات العدوى

  1. عدوى الخلايا الدبقية مع T. جوندي
    1. لوحة 3 × 104 microglia أو الخلايا الفلكية مع مكملة DMEM/F12 في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة في لوحة مسطحة 96-جيدا معالجة (انظر جدول المواد).
    2. تصيب كل مجموعة من خلايا مع التاكيزويت من سلالة T. gondii RH التعبير عن البروتين الفلوري الأصفر (YFP) في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 1:1 (طفيلي: خلية) المخفف في 200 μL/well من RPMI التكميلية (3٪ FBS + 0.16 mM البنسلين + 0.18 mM Streptomycin + 12.5 mM HEPES + 30 mm درجة الحموضة 7.2) (انظر جدول المواد). احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
    3. ثم، تجاهل supernatant وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من 1٪ بارافورمالديهايد (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    4. استبدال PFA مع 100 ميكرولتر / بئر من PBS في درجة الحموضة 7.2.
    5. إزالة بعناية نواة الخلايا الفائقة ووصمة عار عن طريق الأنابيب 50 μL/well من DAPI (5 ملغ / مل) المخفف في درجة الحموضة PBS 7.2 (1:1000) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    6. استبدال محلول تلطيخ DAPI مع 100 ميكرولتر / بئر من PBS (درجة الحموضة 7.2) وتحليلها عن طريق المجهر الفلوري.
  2. عدوى الخلايا الدبقية مع T. cruzi
    1. لوحة 3 × 104 microglia أو الخلايا الفلكية مع مكملة DMEM/F12 في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة في لوحة مسطحة 96-جيدا معالجة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: لكل نقطة زمنية للعدوى، استخدم لوحة مختلفة.
    2. تصيب الخلايا الدبقية مع التربوماستيغوتات من سلالة T. cruzi Y في وزارة الداخلية من 5:1 (الطفيليات: الخلية) المخففة في 200 ميكرولتر / بئر من RPMI التكميلية واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لغزو الخلية من قبل الطفيلي.
    3. إزالة جميع supernatant وغسل الآبار عن طريق إضافة 200 ميكرولتر / جيدا من RPMI التكميلية لإزالة جميع الطفيليات خارج الخلية. إزالة supernatant وإضافة 200 μL/ well من RPMI التكميلية الطازجة.
      ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إزالة جميع الطفيليات التي لم تغزو الخلايا الملتصقة.
    4. الخلايا المصابة بكوباني لمدة 2 ساعة و 48 ساعة و 96 ساعة لتقييم تكرار T. cruzi في الخلايا الدبقية11.
    5. بعد كل نقطة زمنية، قم بإزالة الخلايا الفائقة وإصلاح الخلايا بـ 100 ميكرولتر/بئر من الميثانول لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم استبدل الميثانول بـ 100 ميكرولتر/بئر من PBS (درجة الحموضة 7.2).
    6. بعد التثبيت ، قم بإعداد الخلايا للحصول على المنافية على النحو التالي.
      1. لتجنب الفلورالذاتي، علاج الخلايا مع 100 ميكرولتر/ بئر من 50 mM NH4Cl المخفف في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 8.0) لمدة 15 دقيقة. غسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني وإزالته على الفور (كرر هذه الخطوة 3 مرات).
      2. بعد ذلك ، permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من 0.5 ٪ تريتون المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة غسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني وإزالته على الفور (كرر هذه الخطوة 3 مرات).
      3. ثم، احتضان ثقافة الخلية مع 100 ميكرولتر / بئر من محلول منع (5٪ الحليب غير الدهون + 2٪ BSA المخفف في برنامج تلفزيوني [درجة الحموضة 7.2]) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني وإزالته على الفور (كرر هذه الخطوة 3 مرات).
      4. من أجل وصمة عار amastigotes، واحتضان مع 30 μL/well من الأجسام المضادة أحادية النسيلة غير التجارية (mAb) 2C2 المضادة للسبس-4 البروتين (1:200) المخفف في محلول منع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      5. غسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني وإزالته على الفور (كرر هذه الخطوة 3 مرات). احتضان لوحة مع 30 ميكرولتر / بئر من الأجسام المضادة للفأرة الثانوية (1:500) المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: كان بروتين mAb 2C2 المضاد لـ Ssp-4 غير التجاري هدية لطيفة من البروفيسور الدكتور ريناتو أ. هارونا من قسم علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة والطفيليات في جامعة ساو باولو الاتحادية.
      6. إزالة بعناية نواة supernatant ووصمة عار عن طريق إضافة 50 ميكرولتر / بئر من DAPI (5 ملغ / مل) المخفف في درجة الحموضة PBS 7.2 (1:1000) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      7. استبدال محلول تلطيخ DAPI مع 100 ميكرولتر / بئر من درجة الحموضة PBS 7.2 وتحليلها عن طريق المجهر الفلوري.

النتائج

فياليوم الرابع عشر، خضعت ثقافة الخلايا الدبقية(الشكل 1أ)للتفكك الميكانيكي. تم تحليل مجموعات الخلايا المعزولة عن طريق قياس الخلايا المتدفقة وفقًا لعلامات CD11b و CD45 و GFAP. يمكننا أن نلاحظ نقاء 89.5٪ للسكان الخلايا الفلكية و 96.6٪ للسكان microglia(الشكل 1<...

Discussion

وقد اتسعت أهمية دراسة وظائف الخلايا الدبقية المعزولة في سياقات بيولوجية متميزة في العقدين الماضيين. فهم الجهاز العصبي المركزي وراء الخلايا العصبية لا يزال حقل متزايد في بيولوجيا الخلايا, خاصة في ظل العدوى أو الظروف الالتهابية8,9,24. الخلا?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر البروفيسور الدكتور ريناتو أ. هارومنتا من جامعة ساو باولو الاتحادية على برنامج MAb 2C2 المناهض لـ Ssp-4. وقد دعم هذا العمل بمنح مقدمة من مؤسسة امباساو دي أمبارو إي بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP, منحة 2017/25942-0 إلى K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, منحة 402100/2016-6 إلى K.R.B.)، المعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا والعلوم (INCTV/CNPq) وCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). تتلقى M.P.A. زمالة من CNPq، ويتلقى A.L.O.P. زمالة من CAPES، ويتلقى I.S.F.F.B. زمالة من FAPESP.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
70% EthanolDinâmica Química ContemporâneaCat: 2231Sterilize
75 cm2 FlaskCorningCat: 430720UPlastic material
96 well cell culture plateGreiner CellstarCat: 655090Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl)Dinâmica Química ContemporâneaCat: C10337.01.AHRemove autofluorescence
Anti-GFAP antibodyAbcamCat.: ab49874Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 mm CACorningCat: 430513Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichCat: A7906FACS Buffer preparation
CD11b (FITC)BD PharmigenCat.: 553310Flow cytometry antibody
CD45 (PE)InvitrogenCat.: 12-0451-83Flow cytometry antibody
CentrifugeEppendorfCat: 5810RCentrifugation
CentrifugeEppendorf5415RCentrifugation
Class II biosafety cabinetPachaneCat: 200Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 IncubatorThermoScientificModel: 3110Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mLCorningCat: 430766Plastic material
Conical tubes 50 mLCorningCat: 352070Plastic material
Countess automated cell counterInvitrogenCat: C10281Cell counter
DAPIInvitrogenCat.: D1306Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope CameraNikonCat: DS-RI1Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoCat: 12800-058Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma AldrichCat: E9884FACS Buffer preparation
F12 Nutrient MixtureGibcoCat: 21700-026Cell culture medium
FACS Canto IIBD BiosciencesUnavaiableFlow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS)LGC BiotechnologyCat: 10-bio500-1Cell culture medium supplement
Flow Jo (software)Flow JoVersion: Flow Jo_9.9.4Data analysis
Fluorescence intenselightNikonCat: C-HGFIFluorescence source
GFAP (APC)InvitrogenCat.: 50-9892-82Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC)Kirkeegood&Perry Lab (KPL)Cat.: 172-1806Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt SolutionGibcoCat: 14175079Cell culture medium
HEPESSigma AldrichCat: H4034Cell culture medium supplement
IC Fixation BufferInvitrogenCat: 00-8222-49Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscopeNikonModel: ECLIPSE TS100Microscope
IsofluraneCristáliaCat: 21.2665Inhaled anesthetic
MethanolSynthCat: 01A1085.01.BJFixation for Immunofluorescence
Micro spatulaABC stainlessUnavaiableSurgical material
Microtube 1.5 mLAxygenCat: MCT-150-CPlastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4Non commercialNon commercialImmunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200)CorningCat: 751630124Pipette reagents
NIS Elements SoftwareNikonVersion 4.0Acquire and analyse images
Non-fat milkNestléCat: 9442405Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker IncubatorThermoScientificModel: 481 Cat: 11Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichCat: P6148Fixation for Immunofluorescence
PBSNon commercialNon commercialNeutral Buffer
Penicillin GSigma AldrichCat: P-7794Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10X)InvitrogenCat: 00-8333-56Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60x15 mm (Disposable, sterile)ProlabCat: 0303-8Plastic material
pH meterKasviK39-1014BCalibrate pH solution
RPMI 1640 MediumGibcoCat: 31800-014Cell culture medium
ScissorsABC stainlessCat: LO9-W4Surgical material
Serological pipette 10 mLCorningCat: 4101Plastic material
Serological pipette 5 mLCorningCat: 4051Plastic material
Single Channel Pipette (p1000)Gilson PipetmanCat: F123602Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200)Gilson PipetmanCat: F123601Pipette reagents
Sodium bicarbonateSigma AldrichCat: S6297Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate saltSigma AldrichCat: S9137Cell culture medium supplement
Triton X-100Sigma AldrichCat: T9284Permeabilization for immunofluorescence
TrypsinGibcoCat: 27250-018Digestive enzyme
TweezersABC stainlessCat: L28-P4-172Surgical material
Water BathNovatecnicaModel: 09020095Digeste tissue at 37 ºC with trypsin

References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 microglia T cruzi T gondii

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved