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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu unterweisen, wie man murine Astrozyten- und Mikrogliazellen aus dem zentralen Nervensystem extrahiert, aufrechterhält und dissoziiert, gefolgt von einer Infektion mit Protozoenparasiten.

Zusammenfassung

Astrozyten und Mikroglia sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen. Sie sind verantwortlich für physiologische Unterstützung und Homöostase-Wartung im Zentralnervensystem (ZNS). Die zunehmenden Beweise für ihre Beteiligung an der Bekämpfung von Infektionskrankheiten rechtfertigen das sich abzeichnende Interesse an der Verbesserung der Methoden zur Isolierung primärer Astrozyten und Mikroglia, um ihre Reaktionen auf Infektionen, die das ZNS betreffen, zu bewerten. Unter Berücksichtigung der Auswirkungen der Trypanosoma cruzi (T. cruzi) und Toxoplasma gondii (T. gondii) Infektion im ZNS, hier bieten wir eine Methode, um zu extrahieren, zu pflegen, zu dissoziieren und murine Astrozyten und Mikrogliazellen mit ProtozoenParasiten zu infizieren. Extrahierte Zellen aus neugeborenen Kortiken werden 14 Tage lang in vitro mit periodischem Differentialmedienersatz gehalten. Astrozyten und Mikroglia werden aus dem gleichen Extraktionsprotokoll durch mechanische Dissoziation gewonnen. Nach der Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie werden Zellen mit Protozoenparasiten infiziert. Die Infektionsrate wird durch Fluoreszenzmikroskopie zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt, wodurch die Differenzfähigkeit von Gliazellen zur Kontrolle der protozoischen Invasion und Replikation bewertet wird. Diese Techniken stellen einfache, kostengünstige und effiziente Methoden dar, um die Reaktionen von Astrozyten und Mikroglia auf Infektionen zu untersuchen und das Feld für weitere neuroimmunologische Analysen zu öffnen.

Einleitung

Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen und Gliazellen1,2,3. Mikroglia und Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im ZNS. Microglia, das ansässige Makrophagen, ist die immunkompetente und phagozytische Gliazelle im ZNS3,4, während Astrozyten für die Aufrechterhaltung der Homöostase verantwortlich sind und unterstützende Funktionen ausüben5.

Obwohl Gliazellen klassisch bekannt sind, verantwortlich für die Unterstützung und den Schutz der Neuronen6,7, neu entstehende Funktionen dieser Zellen wurden in der jüngsten Literatur beschrieben, einschließlich ihrer Reaktionen auf Infektionen8,9,10,11. Daher gibt es einen Vorstoß, Methoden zu entwickeln, um diese Gliazellen zu isolieren, um ihre Funktionen individuell zu verstehen.

Es gibt einige alternative Modelle, um Gliazellen zu untersuchen, anstatt Primärkulturen, wie verewigte Zelllinien und In-vivo-Modelle. Verewigte Zellen unterliegen jedoch eher genetischen Driften und morphologischen Veränderungen, während In-vivo-Studien begrenzte Manipulationsbedingungen auferlegen. Umgekehrt sind Primärkulturen einfach zu handhaben, ähneln besser in vivo Zellen und ermöglichen es uns auch, experimentelle Faktoren zu kontrollieren12,13. Hier beschreiben wir Richtlinien, wie man murine Astrozyten und Mikroglia-Primärzellen im selben Protokoll extrahiert, pflegt und dissoziiert. Darüber hinaus bieten wir auch Beispiele, wie mit Protozoeninfektionen in diesen Kulturen zu arbeiten.

ZNS-Zellen, die aus neonatalen Mäusen (bis zu 3 Tage alt) extrahiert wurden, wurden 14 Tage lang auf differentialen Medien kultiviert, die das bevorzugte Wachstum von Astrozyten und Mikrogliazellen ermöglichen. Da Mikroglia über den angeschlossenen Astrozyten ruht, wurden Zellpopulationen in einem Orbital-Inkubator mechanisch dissoziiert. Als nächstes sammelten wir alle Überstande, die Mikroglia enthielten, und fügten Trypsin hinzu, um Astrozyten zu lösen. Isolierte Gliazellen wurden phänotypisch durch Durchflusszytometrie ausgewertet und nach dem gewünschten Experiment plattiert.

Wir lieferten auch Beispiele, wie man diese isolierten Mikroglia und Astrozyten mit Protozoenparasiten infiziert. T. gondii ist ein hochneurotroper Protozoen, der für Toxoplasmose14verantwortlich ist, während T. cruzi für die Chagas-Krankheit verantwortlich ist, die zur Entwicklung neurologischer Störungen im ZNS15,16führen kann. Darüber hinaus wurde auch berichtet, dass eine Infektion mit T. gondii17,18 oder T. cruzi19,20,21 die mutmaßliche Todesursache bei immungeschwächten Patienten waren. Daher ist die Aufklärung der immunologischen Rolle von Gliazellen aus dem ZNS bei der Kontrolle von Protozoeninfektionen von großer Bedeutung.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem brasilianischen Nationalgesetz (11.794/2008) durchgeführt und von den Institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschüssen (IACUC) der Föderalen Universität von Sao Paulo (UNIFESP) genehmigt.

1. Glial Cells Extraktion, Wartung und Dissoziation

HINWEIS: Die Anzahl der Mäuse, die für die Extraktion von Gliazellen verwendet werden, hängt von der Menge der Zellen ab, die für die Durchführung der gewünschten Experimente erforderlich sind. In diesem Protokoll wurden insgesamt 2,7 x 107 Astrozyten und 4 x 106 Mikroglia von sechs neonatalen C57BL/6-Mäusen gewonnen. Alle Eingriffe wurden unter sterilem Zustand in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt.

  1. Tag 1
    1. Bereiten Sie reines Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) und HBSS + 10% des wärmeinaktivierten fetalen Rinderserums (FBS) vor (siehe Materialtabelle).
    2. Ergänzendes Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicillin + 0,09 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM Natriumbicarbonat, pH 7,2) vorbereiten und mit einem 0,22 m Filter filtern (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Alle Kulturmedien sollten bei 4 °C gespeichert werden, aber es ist notwendig, sie bei 37 °C für 20 min vorzuwärmen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
    3. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente (Schere, Spachtel und Pinzette) in einem Autoklaven und verwenden Sie 70% Ethanol während des Eingriffs.
    4. Neugeborene (bis zu 3 Tage alt) Mäuse in eine versiegelte Kammer mit mit Isofluran getränkter Baumwolle für 5 min für eine tiefe Anästhesie.
    5. Den Mauswelpen mit 70% Ethanol besprühen und das Tier mit einer Schere enthaupten.
    6. Machen Sie sagittalen Schnitt (posterior bis vorder) mit einer Schere entlang des Schädels, um es zu öffnen und das Gehirn auszusetzen. Trennen Sie den Schädel vom Gehirn mit einer Pinzette. Entfernen Sie das Gehirn mit einem Mikrospachtel, um die Integrität des Gehirns zu erhalten.
    7. Legen Sie das Gehirn in eine trockene Petrischale (6 cm Durchmesser). Entfernen Sie die Olfaktor-Lampe und Kleinhirn mit einem Mikro-Spachtel. Bewegen Sie den Kortex auf eine andere Petrischale (6 cm Durchmesser), die HBSS + 10% FBS (2 ml/Petrischale) enthält.
    8. Schneiden Sie das Hirngewebe mit einer sterilen Schere in kleine Stücke und übertragen Sie mit einer p1000-Mikropipette jedes Hirngewebe mit HBSS + 10% FBS in verschiedene 15 ml konische Röhren. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen 2 ml/Rohr beträgt. Wenn nicht, komplett mit HBSS + 10% FBS.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wenn ja, müssen konische Röhren mit ZNS-Gewebe bis zu 1 h auf Eis gelegt werden.
    9. Waschen Sie das geschnittene Hirngewebe mit 3 ml HBSS + 10% FBS (pro Tube) und nach der Dekantierung. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
      HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, die Trümmer zu entfernen und das extrahierte Gewebe zu bergen.
    10. Waschen Sie das geschnittene Hirngewebe mit 3 ml reinem HBSS (pro Tube) und entfernen Sie nach der Dekantierung vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
      HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, das verbleibende Serum aus den vorherigen Wärjahren zu entfernen, da Zellen im nächsten Schritt versucht werden.
    11. Fügen Sie 3 ml Trypsin pro Rohr hinzu und legen Sie es 30 min lang in ein Wasserbad bei 37 °C, indem Sie die Rohre alle 5 min sanft schütteln. Vermeiden Sie Blasen, indem Sie die Rohre invertieren oder abrupt mischen.
      HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, das gesammelte Gewebe zu verdauen.
    12. Um das Trypsin zu inaktivieren, waschen Sie das Gewebe mit 3 ml pro Tube HBSS + 10% FBS und entfernen Sie nach der Dekantierung des Gewebes vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
    13. Waschen Sie das Gewebe mit 3 ml pro Tube reinen HBSS und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal.
    14. Fügen Sie 7 ml pro Tube reinen HBSS hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe durch aufeinanderfolgende Passagen in Pipetten: zuerst mit der 10 ml serologischen Pipette, gefolgt von der 5 ml und schließlich mit der mikropipette p1000.
    15. Nach der Homogenisierung Zentrifugenrohre bei 450 x g für 5 min bei 4 °C.
    16. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 4 ml HBSS + 10% FBS pro Rohr wieder auf.
    17. Übertragen Sie Zellen in einen vorbehandelten T-75-Kolben für eine optimale Zellkulturhaftung (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Verarbeiten Sie Gewebe von jedem Tier pro Kolben.
    18. Legen Sie den Kolben bei 37 °C und 5%CO2 für 30 min zur Haftung in den Inkubator.
    19. 10 ml zusätzliches DMEM/F12 pro Kolben hinzufügen und bei 37 °C und 5%CO2brüten.
      HINWEIS: Das endige Volumen beträgt 14 ml pro Kolben.
  2. Tag 3
    1. Entfernen Sie 7 ml Kulturmedium aus dem T-75 Kolben und fügen Sie 7 ml frisch ergänztDM/F12 hinzu.
      HINWEIS: Die Kolben enthalten eine Menge zellulärer Trümmer und ein trübes Aussehen.
  3. Tag 5
    1. Entfernen Sie das gesamte Medium aus dem T-75-Kolben und fügen Sie 14 ml frisch ergänztdmEM/F12 hinzu.
      HINWEIS: Medium wird aus den Kolben ersetzt, um Schmutz und nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
    2. Nach je 48 h 6 ml des Überstandes entfernen und 7 ml frisch ergänztes DMEM/F12 Medium bis zum 14. Tag der Kultur hinzufügen.
  4. Tag 14
    1. Nach dem Entfernen von 6 ml des Überstandes und Zugabe von 7 ml frisch ergänztem DMEM/F12 Medium, schließen Sie die T-75-Flaschen fest.
    2. Legen Sie sie in den Boden Orbital-Shaker bei 200 Umdrehungen pm und 37 °C über Nacht, um Mikroglia mechanisch von Astrozyten zu trennen.
  5. Tag 15
    1. Nehmen Sie die Kolben aus dem Shaker und waschen Sie sie kräftig mit ihrem eigenen Medium, um die Zelldissoziation zu optimieren und die maximale Anzahl von Mikroglia zu ernten. Dann sammeln Sie den Überstand (enthält Mikroglia) und übertragen Sie in ein 50 ml konisches Rohr.
    2. Als nächstes 4 ml Trypsin in jeden Kolben geben und 5 min bei 37 °C inkubieren, um die Astrozyten zu lösen.
    3. Fügen Sie 5 ml pro Kolben von ergänztem DMEM/F12 hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Waschen Sie die Kolben mit ihrem eigenen Medium und übertragen Sie den Inhalt in ein 50 ml konisches Rohr.
    4. Zentrifugieren Sie alle Röhren, die dissoziierte Mikroglia und Astrozyten bei 450 x g für 5 min bei 4 °C enthalten.
    5. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Mikrogliapellet in 1 ml und die Astrozyten in 10 ml ergänztem DMEM/F12 wieder aus.
    6. Fahren Sie mit der Zellzählung in einer Neubauer-Kammer oder einem automatischen Zellzähler fort. Die Zellen mit ergänztem DMEM/F12 mit der gewünschten Dichte in einer geeigneten flachen Bodenzellkulturplatte (vorbehandelt für optimale Zellanhaftung; siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h, damit sie sich anbringen können.
      HINWEIS: Reservieren Sie 1,5 x 106 jeder Zellpopulation, um ihre Reinheit durch Durchflusszytometrie zu bestätigen.
    7. Führen Sie eine zytometrische Flussanalyse durch, um die Reinheit der Zellpopulationen zu überprüfen.
      HINWEIS: Wir betrachten microglia CD11b+/CD45+/GFAP- und Astrozyten CD11b-/CD45-/GFAP+. Iba1 und TMEM119 Färbung könnte in Betracht gezogen werden, um Microglia22vollständig zu charakterisieren.
    8. Fügen Sie einen FMO (Fluoreszenz Minus One)23 und eine unbefleckte Probe für jede Zellpopulation (Astrozyten und Mikroglia) als Steuerung des Durchflusszytometrie-Assays hinzu.
    9. Reservieren Sie für jede Zellpopulation 5 x 105 Zellen für jede gefärbte und ungefärbte Probe. Reservieren Sie für FMO zwei weitere Mikroglia-Röhren mit jeweils 2,5 x 105 Zellen und eine weitere Röhre mit 5 x 105 Astrozyten.
      HINWEIS: Da Mikroglia-Zahlen ein begrenzender Faktor sein können, ist es möglich, weniger Zellen für ungefärbte und FMO-Kontrollen zu verwenden.
    10. Zentrifugieren Sie alle Mikroröhrchen bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 500 l/Mikrorohr FACS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochchen (PBS) + 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7,2) wieder auf.
    11. Zentrifugieren Sie alle Mikroröhrchen bei 450 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 100 l/Mikrorohr Anti-CD16/CD32 (Klon 93) (1:50) im FACS-Puffer verdünnt auf. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    12. Fügen Sie allen Mikroröhrchen und Zentrifugen bei 450 x g bei 4 °C für 5 min 5 l/Mikrorohr FACS-Puffer hinzu. Resuspend Astrozyten und Mikroglia-Färberohre und auch Astrozyten-FMO-Röhrchen mit 50 L/Mikroröhre von Oberflächenmarkern mischen: Anti-CD45 (PE, Klon 30-F11) und Anti-CD11b (eFluor 450, Klon M1/70) (beide bei 1: 100 im FACS-Puffer verdünnt).
    13. Setzen Sie bei nicht befleckten Zellen mit dem gleichen Volumen des FACS-Puffers erneut ab. Für Microglia FMO, inkubieren Sie jedes Mikroglia-Rohr mit Anti-CD45 oder Anti-CD11b. Inkubieren Sie alle Proben bei 4 °C für 20 min im Dunkeln.
    14. Fügen Sie 500 L FACS-Puffer pro Mikrorohr hinzu. Zentrifuge bei 450 x g bei 4 °C für 5 min. Den Überstand entsorgen und das Pellet mit 100 l/Mikrorohr Fixationspuffer (siehe Materialtabelle)20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln wieder aufhängen.
    15. Fügen Sie 500 l/Mikroröhre Permeabilisationspuffer 1x (siehe Materialtabelle) und inkubieren bei 4 °C für 5 min im Dunkeln.
    16. Zentrifugieren Sie alle Mikroröhrchen bei 450 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspend Astrozyten und Mikroglia-Färberohre sowie Mikroglia-FMO-Röhren mit 50 L/Mikrorohr intrazellulärer Antikörper-GFAP (APC, Klon GA5) in einem 1:100-Verdünnungspuffer. Für ungefärbte Zellen und Astrozyten-FMO, resuspendieren Sie die Zellen mit dem gleichen Volumen des FACS-Puffers. Alle Proben bei 4 °C für 30 min im Dunkeln inkubieren.
    17. Waschen Sie alle Rohre, indem Sie 500 l/Mikrorohr des 1x Permeabilisationspuffers hinzufügen. Zentrifugieren Sie alle Mikroröhrchen bei 450 x g, für 5 min bei 4 °C. Setzen Sie jedes Mikrorohr in 200 L FACS-Puffer aus. Erfassen Sie 1 x 105 Ereignisse/Probe auf dem Durchflusszytometer.
    18. Zur Analyse müssen Zellen zuerst auf CD11b x CD45 und dann auf GFAP-Histogramm abgegrenzt werden.
      HINWEIS: Unstained und FMO-Steuerelemente sind nützlich, um Tore zu bestimmen.

2. Infektion und Bewertung der Infektionsraten

  1. Infektion von Gliazellen mit T. gondii
    1. Platte 3 x 104 Mikroglia oder Astrozyten mit ergänztem DMEM/F12 bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h in einer vorbehandelten 96-Well-Flachplatte (siehe Materialtabelle).
    2. Infizieren Sie jede Zellpopulation mit Tachyzoiten aus T. gondii RH-Stamm, der gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 1:1 (Parasit:Zelle) in 200 l/Well des ergänzten RPMI (3% FBS + 0,16 mM Penicillin + 0,18 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM Natriumbicarbonat) verdünnt pH 7.2) (siehe Materialtabelle). Bei 37 °C und 5%CO2 für 48 h inkubieren.
    3. Entsorgen Sie dann den Überstand und fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von 1% Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen, das in PBS bei 4 °C für 24 h verdünnt wird.
    4. Ersetzen Sie PFA mit 100 L/Well von PBS bei pH 7,2.
    5. Entfernen Sie vorsichtig die Kerne der Überstände und Fleckenzellen, indem Sie 50 l/Well von DAPI (5 mg/ml) in PBS pH 7.2 (1:1,000) für 1 min bei Raumtemperatur im Dunkeln verdünnt pipetieren.
    6. Ersetzen Sie die DAPI-Färbelösung durch 100 L/Well von PBS (pH 7.2) und analysieren Sie sie durch Fluoreszenzmikroskopie.
  2. Infektion von Gliazellen mit T. cruzi
    1. Platte 3 x 104 Mikroglia oder Astrozyten mit ergänztem DMEM/F12 bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h in einer vorbehandelten 96-Well-Flachplatte (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Verwenden Sie für jeden Zeitpunkt der Infektion eine andere Platte.
    2. Infizieren Sie die Gliazellen mit Trypomastigoten aus DemT. cruzi Y-Stamm bei einem MOI von 5:1 (Parasiten:Zelle) in 200 L/Well des ergänzten RPMI verdünnt und bei 37 °C und 5%CO2 für 2 h inkubieren.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig für die Zellinvasion durch den Parasiten.
    3. Entfernen Sie alle Überstand und waschen Sie die Brunnen durch Hinzufügen von 200 L / Well von ergänzten RPMI, um alle extrazellulären Parasiten zu entfernen. Entfernen Sie Dener und fügen Sie 200 L / Well von frisch ergänzten RPMI.
      HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, alle Parasiten zu entfernen, die nicht in die anhaftenden Zellen eindringten.
    4. Inkubieren Sie infizierte Zellen für 2 h, 48 h und 96 h, um die T. cruzi-Replikation in Gliazellen11zu bewerten.
    5. Nach jedem Zeitpunkt den Überstand entfernen und die Zellen mit 100 l/Well Methanol für 15 min bei Raumtemperatur fixieren und dann Methanol durch 100 l/Well von PBS (pH 7,2) ersetzen.
    6. Nach der Fixierung bereiten Sie die Zellen wie folgt auf den Immunfluoreszenztest vor.
      1. Um eine Autofluoreszenz zu vermeiden, behandeln Sie die Zellen mit 100 l/Well von 50 mM NH4Cl in PBS (pH 8.0) für 15 min. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von PBS hinzufügen und sofort entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal).
      2. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von 0,5% Triton in PBS für 15 min verdünnt hinzufügen. Waschen Sie Zellen, indem Sie 100 L/Well von PBS hinzufügen und sofort entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal).
      3. Dann inkubieren Sie die Zellkultur mit 100 l/Well der Blockierlösung (5% fettfreie Milch + 2% BSA in PBS [pH 7.2]) für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von PBS hinzufügen und sofort entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal).
      4. Um Amastigoten zu färben, inkubieren Sie mit 30 l/well von nicht-kommerziellen monoklonalen Antikörpern (mAb) 2C2 Anti-Ssp-4 Protein (1:200) in Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt.
      5. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von PBS hinzufügen und sofort entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal). Inkubieren Sie die Platte mit 30 l/well des sekundären Anti-Maus-Antikörpers (1:500), der in PBS für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt wird.
        HINWEIS: Das nicht-kommerzielle mAb 2C2 Anti-Ssp-4-Protein war ein freundliches Geschenk von Prof. Dr. Renato A. Mortara vom Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie der Föderalen Universität von Sao Paulo.
      6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und die Fleckenkerne, indem Sie 50 l/Well von DAPI (5 mg/ml) in PBS pH 7.2 (1:1,000) für 1 min bei Raumtemperatur im Dunkeln verdünnt hinzufügen.
      7. Ersetzen Sie die DAPI-Färbelösung durch 100 L/Well von PBS pH 7.2 und analysieren Sie sie durch Fluoreszenzmikroskopie.

Ergebnisse

Am14. Tag wurde die Glialzellenkultur (Abbildung 1A) einer mechanischen Dissoziation unterzogen. Isolierte Zellpopulationen wurden durch Durchflusszytometrie nach CD11b-, CD45- und GFAP-Markern analysiert. Wir konnten eine Reinheit von 89,5% für die Astrozytenpopulation und 96,6% für die Mikrogliapopulation beobachten (Abbildung 1B). Nach der Isolierung wurden die Zellen in eine 96-Well-Flachplatte plattiert und nac...

Diskussion

Die Bedeutung der Untersuchung isolierter Gliazellen in unterschiedlichen biologischen Kontexten hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten ausgeweitet. Das Verständnis des ZNS über Neuronen hinaus ist immer noch ein wachsendes Feld in der Zellbiologie, vor allem bei Infektionen oder entzündlichen Erkrankungen8,9,24. Gliazellen sind nicht nur für die körperliche Unterstützung der Neuronen (wie es früher bekannt war), sonder...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Professor Dr. Renato A. Mortara von der Föderalen Universität von Sao Paulo (UNIFESP) für mAb 2C2 anti-Ssp-4. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Fundao de Amparo , Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, Stipendium 2017/25942-0 an K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientéfico e Tecnolégico (CNPq, 402100/2016-6 an K.R.B.), das Instituto Nacional de Ciéncia e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) und Coordenaéo de Aperfeiéoamento de Pessoal de Nével Superior (CAPES, Finanzkodex 001). M.P.A. erhält ein Stipendium von CNPq, A.L.O.P. erhält ein Stipendium von CAPES und I.S.F und L.Z.M.F.B. ein Stipendium von FAPESP.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
70% EthanolDinâmica Química ContemporâneaCat: 2231Sterilize
75 cm2 FlaskCorningCat: 430720UPlastic material
96 well cell culture plateGreiner CellstarCat: 655090Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl)Dinâmica Química ContemporâneaCat: C10337.01.AHRemove autofluorescence
Anti-GFAP antibodyAbcamCat.: ab49874Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 mm CACorningCat: 430513Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichCat: A7906FACS Buffer preparation
CD11b (FITC)BD PharmigenCat.: 553310Flow cytometry antibody
CD45 (PE)InvitrogenCat.: 12-0451-83Flow cytometry antibody
CentrifugeEppendorfCat: 5810RCentrifugation
CentrifugeEppendorf5415RCentrifugation
Class II biosafety cabinetPachaneCat: 200Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 IncubatorThermoScientificModel: 3110Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mLCorningCat: 430766Plastic material
Conical tubes 50 mLCorningCat: 352070Plastic material
Countess automated cell counterInvitrogenCat: C10281Cell counter
DAPIInvitrogenCat.: D1306Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope CameraNikonCat: DS-RI1Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoCat: 12800-058Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma AldrichCat: E9884FACS Buffer preparation
F12 Nutrient MixtureGibcoCat: 21700-026Cell culture medium
FACS Canto IIBD BiosciencesUnavaiableFlow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS)LGC BiotechnologyCat: 10-bio500-1Cell culture medium supplement
Flow Jo (software)Flow JoVersion: Flow Jo_9.9.4Data analysis
Fluorescence intenselightNikonCat: C-HGFIFluorescence source
GFAP (APC)InvitrogenCat.: 50-9892-82Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC)Kirkeegood&Perry Lab (KPL)Cat.: 172-1806Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt SolutionGibcoCat: 14175079Cell culture medium
HEPESSigma AldrichCat: H4034Cell culture medium supplement
IC Fixation BufferInvitrogenCat: 00-8222-49Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscopeNikonModel: ECLIPSE TS100Microscope
IsofluraneCristáliaCat: 21.2665Inhaled anesthetic
MethanolSynthCat: 01A1085.01.BJFixation for Immunofluorescence
Micro spatulaABC stainlessUnavaiableSurgical material
Microtube 1.5 mLAxygenCat: MCT-150-CPlastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4Non commercialNon commercialImmunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200)CorningCat: 751630124Pipette reagents
NIS Elements SoftwareNikonVersion 4.0Acquire and analyse images
Non-fat milkNestléCat: 9442405Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker IncubatorThermoScientificModel: 481 Cat: 11Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichCat: P6148Fixation for Immunofluorescence
PBSNon commercialNon commercialNeutral Buffer
Penicillin GSigma AldrichCat: P-7794Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10X)InvitrogenCat: 00-8333-56Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60x15 mm (Disposable, sterile)ProlabCat: 0303-8Plastic material
pH meterKasviK39-1014BCalibrate pH solution
RPMI 1640 MediumGibcoCat: 31800-014Cell culture medium
ScissorsABC stainlessCat: LO9-W4Surgical material
Serological pipette 10 mLCorningCat: 4101Plastic material
Serological pipette 5 mLCorningCat: 4051Plastic material
Single Channel Pipette (p1000)Gilson PipetmanCat: F123602Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200)Gilson PipetmanCat: F123601Pipette reagents
Sodium bicarbonateSigma AldrichCat: S6297Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate saltSigma AldrichCat: S9137Cell culture medium supplement
Triton X-100Sigma AldrichCat: T9284Permeabilization for immunofluorescence
TrypsinGibcoCat: 27250-018Digestive enzyme
TweezersABC stainlessCat: L28-P4-172Surgical material
Water BathNovatecnicaModel: 09020095Digeste tissue at 37 ºC with trypsin

Referenzen

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
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