原生动物寄生虫感染原发性星细胞和微胶质的伴随分离

摘要

该协议的总体目标是指导如何从中枢神经系统中提取、维持和分离鼠星细胞和微胶质细胞，然后感染原生动物寄生虫。

摘要

星细胞和微胶质是最丰富的胶质细胞。他们负责中枢神经系统（CNS）的生理支持和平衡维护。越来越多的证据表明，它们参与控制传染病，这证明人们越来越有兴趣改进分离原发星体和微胶质的方法，以评估它们对影响国家神经系统的感染的反应。考虑到锥虫瘤cruzi（T.cruzi）和弓形虫贡迪（T.贡迪）感染在CNS的影响，在这里我们提供一种方法，提取，维持，分离和感染鼠星细胞和微胶质细胞与原生动物寄生虫。从新生儿皮质中提取的细胞在体外保存14天，并定期更换差分介质。通过机械分离从相同的提取协议中获得星细胞和微胶质。通过流动细胞测定进行渗透后，细胞感染了原生动物寄生虫。感染率由不同时间点的荧光显微镜决定，从而能够评估胶质细胞控制原生动物入侵和复制的差分能力。这些技术代表了研究星细胞和微胶质对感染的反应的简单、廉价和有效的方法，为进一步的神经免疫学分析开辟了领域。

引言

中枢神经系统主要由神经元和胶质细胞^{11、2、32,3}组成。微胶质和星形细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞。Microglia，即住院巨噬细胞，是CNS^33、44中的免疫能力和噬菌体细胞，而星形细胞负责维持平衡和发挥支持作用^5。

尽管胶质细胞通常被认为是负责神经元^6、77的支撑和保护，但最近的文献中⁶已经描述了这些细胞的新兴功能，包括它们对感染的反应^{88、9、10、11。9,10,11}因此，有一个推动开发方法，以隔离这些胶质细胞，以单独理解其功能。

有一些替代模型来研究胶质细胞，而不是原始培养，如不朽的细胞谱系和体内模型。然而，不朽的细胞更有可能经历遗传漂移和形态变化，而体内研究施加有限的操作条件。相反，原生培养物易于处理，最好类似于体内细胞，也允许我们控制实验因子^{12，13。12,}在这里，我们描述了如何在同一协议中提取、维持和分离鼠星细胞和微胶质原细胞的指南。此外，我们还提供了在这些文化中如何处理原生动物感染的示例。

从新生儿小鼠（最多3天）中提取的CNS细胞在差异培养的培养物上14天，允许星细胞和微胶质细胞优先生长。由于微胶质位于附着的星细胞之上，细胞群在轨道培养箱中机械地分离。接下来，我们收集了所有含有微胶质的上清液，并添加了胰蛋白酶来分离星体细胞。通过流细胞测定和根据期望的实验进行表层化评估的分离胶质细胞。

我们还提供了如何将这些孤立的微胶质和星细胞感染原生动物寄生虫的例子。T. Gondii是一种高度神经性原生动物，负责弓形虫病^14，而T.Cruzi负责恰加斯病，这可能导致神经紊乱的发展在CNS^{15，16。,16}此外，据报道，感染T.gondii^17，18,18或T.cruzi19，20，21是免疫功能低下患者可能死亡的原因。 T. cruzi^19,20,21因此，从CNS阐明胶质细胞在控制原生动物感染中的作用具有十分重要的意义。

研究方案

所有涉及小鼠的实验程序都根据巴西国家法律（11.794/2008）进行，并经圣保罗联邦大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 胶质细胞提取、维护和分离

注:用于胶质细胞提取的小鼠数量取决于执行所需实验所需的细胞数量。在该协议中，从6只新生儿C57BL/6小鼠中总共获得了2.7 x 10^7个星囊和4 x 10⁶微胶质。所有手术均在第二类生物安全柜无菌条件下进行。

1. 第1天
   1. 制备纯汉克的平衡盐溶液（HBSS）和HBSS = 10%的热灭活胎儿牛血清（FBS）（参见材料表）。
   2. 制备补充的Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）/F12（10%FBS = 0.08 mM青霉素+ 0.09 mM链霉素= 12.5 mM HEPES = 30 mM碳酸氢钠，pH 7.2），并过滤它与0.22μm过滤器（见材料表）。
      注:所有培养介质应储存在4°C，但在开始实验前，必须在37°C下预热20分钟。
   3. 在高压灭菌器中消毒所有手术器械（剪刀、铲子和钳子），并在手术过程中使用70%乙醇。
   4. 将新生儿（最多3天）的小鼠放入密封的腔室中，里面装有浸着西罗兰的棉花5分钟，进行深度麻醉。
   5. 用70%乙醇喷洒老鼠，用剪刀把动物斩首。
   6. 沿颅骨用剪刀进行下垂切割（前身）以打开它并露出大脑。用钳子将头骨与大脑分开。使用微刮刀取出大脑，以保持大脑的完整性。
   7. 将大脑放在干式培养皿中（直径为 6 厘米）。使用微刮刀取出嗅觉灯泡和小脑。将皮层移到另一个包含 HBSS = 10% FBS（2 mL/Petri 盘）的培养皿（直径为 6 厘米）。
   8. 用无菌剪刀将脑组织切成小块，并使用p1000微移液器将每个脑组织与HBSS + 10% FBS转移到不同的15 mL锥形管。确保最终体积为 2 mL/管。如果没有，则使用 HBSS = 10% FBS 完成。
      注: 协议可以在这里暂停。如果是这样，带有CNS组织的锥形管必须放置在冰上长达1小时。
   9. 用 3 mL 的 HBSS = 10% FBS（每管）和发量后清洗切切的脑组织。小心地取出上清液。重复此步骤 3 次。
      注:此步骤旨在清除碎片并恢复提取的组织。
   10. 用3 mL纯HBSS（每管）清洗切切的脑组织，在切碎后，小心地去除上清液。重复此步骤 3 次。
       注:此步骤旨在从以前的洗注中去除剩余的血清，因为细胞将在下一步中尝试。
   11. 每管加入3 mL的胰蛋白酶，在37°C的水浴中放置30分钟，每5分钟轻轻摇动管子。通过倒置或突然混合管子，避免气泡。
       注:此步骤旨在消化收集的组织。
   12. 要停用胰蛋白酶，请每管HBSS +10%FBS用3 mL清洗组织，并在组织切除后小心去除上清液。重复此步骤 3 次。
   13. 用每管纯HBSS3 mL清洗组织，并小心地去除上清液。重复此步骤 2 次。
   14. 每管纯HBSS加入7 mL，通过移液器的连续通道使组织均质化:首先使用10 mL血清移液器，然后是5 mL，最后使用p1000微移液器。
   15. 均质后，在 4°C 下以 450 x g的离心机管 5 分钟。
   16. 丢弃上清液，用4 mL的HBSS重新悬浮颗粒= 每管10%的FBS。
   17. 将细胞转移到预处理的T-75烧瓶中，以获得最佳的细胞培养附着力（参见材料表）。
       注:每瓶每只动物的加工组织。
   18. 将烧瓶放在培养箱中37°C和5%CO_2，30分钟进行粘附。
   19. 每瓶加入10 mL补充DMEM/F12，在37°C和_5%CO2孵育。
       注:最终体积为每瓶14 mL。
2. 第3天
   1. 从 T-75 烧瓶中取出 7 mL 培养介质，加入 7 mL 的新鲜补充 DMEM/F12。
      注:烧瓶将包含大量的细胞碎片和多云的外观。
3. 第5天
   1. 从 T-75 烧瓶中取出所有介质，加入 14 mL 新鲜补充的 DMEM/F12。
      注:从烧瓶中更换介质，以去除碎屑和非粘附细胞。
   2. 每48小时后，去除6 mL的上清液，并添加7 mL的新鲜补充DMEM/F12介质，直到第14天的培养。
4. 第14天
   1. 去除6 mL的上清液，加入7 mL的新鲜补充DMEM/F12介质后，紧紧关闭T-75烧瓶。
   2. 将它们以200 rpm和37°C在地面轨道振动器中过夜，以机械方式与星形细胞分离微胶质。
5. 第15天
   1. 从摇床取瓶，用自己的介质大力清洗，以优化细胞分离，收获最大数量的微胶质。然后，收集上清液（含有微胶质），并转移到50mL锥形管。
   2. 接下来，在每个烧瓶中加入4 mL的胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟，以便分离星体细胞。
   3. 每瓶加5 mL补充DMEM/F12，使胰蛋白酶失效。用自己的介质清洗烧瓶，将内容物转移到50mL锥形管。
   4. 在4°C下，将所有含有分离微胶质和星形细胞的管在450 x g下离心5分钟。
   5. 丢弃上清剂。将微胶质颗粒重新悬浮在 1 mL 中，在补充 DMEM/F12 的 10 mL 中重新悬挂星形细胞。
   6. 继续在Neubauer室或自动细胞计数器中计数。在适当的扁平底细胞培养板中，以所需的密度将补充DMEM/F12的细胞镀板（为最佳细胞附件进行预处理;参见材料表）。在37°C和5%CO₂孵育细胞24小时，使其得以连接。
      注:保留每个细胞群的1.5 x 10^6，通过流动细胞测定确认其纯度。
   7. 执行流细胞测量分析，以验证细胞群的纯度。
      注:我们考虑微胶质CD11b⁺/CD45⁺/GFAP^-和天体囊状体 CD11b^-/CD45^-/GFAP⁺。Iba1和TMEM119染色可以考虑，以充分表征微胶质^22。
   8. 为每个细胞群（星细胞和微胶体）添加FMO（荧光减一^）23和未染色样本，作为流细胞测定的控制。
   9. 对于每个细胞群，为每个染色和未染色的样本保留 5 x 10^{5 个}细胞。对于FMO，保留另外两个含有2.5 x 10⁵细胞的微胶质管，并保留另一管5 x 10⁵星形细胞。
      注:由于微胶质数可能是一个限制因素，因此使用更少的细胞进行未染色和 FMO 控制。
   10. 在4°C下将所有微管在 450 x g 下离心 5 分钟。丢弃上清液，用500μL/微管的FACS缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）+0.5%牛血清白蛋白（BSA）=2 mM EDTA，pH 7.2重新悬浮颗粒。
   11. 在4°C下将所有微管在450 x g下离心5分钟。在FACS缓冲液中稀释100μL/microtubes，将超清液弃置，重新悬浮颗粒。在室温下孵育10分钟。
   12. 在4°C下以450 x g的速度将所有微管和离心机中加入500μL/微管，5分钟。丢弃上清液。重新悬浮星形细胞和微胶质染色管以及具有50 μL/微管表面标记混合的星细胞FMO管:抗CD45（PE，克隆30-F11）和反CD11b（eFluor 450，克隆M1/70）（在FACS缓冲液中1:100稀释）。
   13. 对于未染色的单元格，使用相同交易量的 FACS 缓冲重新挂起。对于微胶质FMO，用抗CD45或抗CD11b孵育每个微胶质管。在黑暗中以4°C孵育所有样品20分钟。
   14. 每微管加入500 μL的FACS缓冲液。在4°C下在450 x g下离心5分钟。在零热的室温下，丢弃上清液，用100μL/微管重新悬浮颗粒（参见材料表），在室温下20分钟。
   15. 加入500 μL/微管渗透缓冲液1倍（参见材料表），在黑暗中在4°C孵育5分钟。
   16. 在4°C下将所有微管在450 x g下离心5分钟。丢弃上清液。在1倍渗透缓冲液中，在1:100稀释液中，重新悬浮星斑细胞和微胶质染色管，以及具有50μL/微管细胞内抗体抗体GFAP（APC，克隆GA5）的微胶质FMO管。对于未染色的细胞和星形细胞 FMO，使用相同体积的 FACS 缓冲液重新悬浮细胞。在黑暗中以4°C孵育所有样品30分钟。
   17. 通过添加 500 μL/微管的 1x 渗透缓冲液来清洗所有管。将所有微管在450 x g下离心，在4°C下5分钟。在FACS缓冲液的200μL中重新悬浮每个微管。在流量细胞仪上获取 1 x 10⁵事件/样本。
   18. 为了进行分析，细胞必须首先在CD11b x CD45上封闭，然后用GFAP直方图进行封闭。
       注: 未染色和 FMO 控制可用于确定门。

2. 感染率与评价

1. 胶质细胞感染T.贡迪
   1. 板 3 x 10⁴微胶质或星形细胞，在 37 °C 时补充 DMEM/F12，在预处理的 96 孔平板中为 24 小时提供 5% CO_2（参见材料表）。
   2. 感染每个细胞群与T的塔奇佐特。 贡迪RH 菌株表达黄色荧光蛋白 （YFP） 在多种感染 （MOI） 1:1 （寄生虫:细胞） 稀释在 200 μL/孔的补充 RPMI （3% FBS = 0.16 mM 青霉素 = 0.18 mM 链霉素 = 12.5 mM HEPES = 30 mM 碳酸钠， pH 7.2） （见表材料）.在37°C和5%CO₂孵育48小时。
   3. 然后，在4°C下加入100μL/1%的甲醛（PFA），在24小时内加入在PBS中稀释的100μL/井，从而丢弃上清液并固定细胞。
   4. 在 pH 7.2 处将 PFA 替换为 100 μL/well PBS。
   5. 在黑暗中室温下，通过移液在PBS pH 7.2（1:1，000）中稀释的50μL/0L（5mg/mL），小心地去除上清和染色细胞核， 1分钟。
   6. 用 100 μL/cwell PBS （pH 7.2） 替换 DAPI 染色溶液，并通过荧光显微镜进行分析。
2. 胶质细胞感染T.cruzi
   1. 板 3 x 10⁴微胶质或星形细胞，在 37 °C 时补充 DMEM/F12，在预处理的 96 孔平板中为 24 小时提供 5% CO_2（参见材料表）。
      注:对于每个感染点，使用不同的板。
   2. 感染胶质细胞与从T.cruzi Y菌株的锥体细胞在MOI5:1（寄生虫:细胞）稀释在200μL/孔的补充RPMI和孵育在37 °C和5%CO₂ 2小时。
      注:此步骤对于寄生虫的细胞入侵非常重要。
   3. 通过添加200μL/well补充的RPMI来去除所有超清剂并洗井，以去除所有细胞外寄生虫。去除上清液，加入200 μL/well新鲜补充的RPMI。
      注:此步骤旨在清除所有未侵入粘附细胞的寄生虫。
   4. 孵育受感染细胞为2小时、48小时和96小时，以评估胶质细胞¹¹中的T.cruzi复制。
   5. 每次点后，取出上清液，用100μL/well的甲醇在室温下固定15分钟，然后用100μL/00PBS（pH 7.2）的液位代替甲醇。
   6. 固定后，准备细胞进行免疫荧光测定，如下所示。
      1. 为避免自荧光，将100 μL/well的50 mM NH₄Cl稀释在PBS（pH 8.0）中的细胞进行15分钟处理。
      2. 接下来，通过在PBS中加入100 μL/well 0.5% 的Triton稀释15分钟来渗透细胞。 洗涤细胞，加入100μL/well的PBS并立即去除它（重复此步骤3次）。
      3. 然后，在室温下用100μL/孔的阻断溶液（5%非脂牛奶+2%BSA稀释在PBS[pH 7.2]）孵育细胞培养液。通过加入 100 μL/well PBS 来清洗细胞并立即将其移除（重复此步骤 3 次）。
      4. 为了染色乳腺，在室温下用30μL/well的非商业单克隆抗体（mAb）2C2抗Ssp-4蛋白（1:200）在阻滞溶液中稀释1小时孵育。
      5. 通过加入 100 μL/well PBS 来清洗细胞并立即将其移除（重复此步骤 3 次）。在室温下，用在PBS中稀释的30μL/well二级抗鼠抗体（1:500）孵育板1小时。
         注:非商业性mAb 2C2抗Ssp-4蛋白是圣保罗联邦大学微生物学、免疫学和寄生虫学系的雷纳托·莫尔塔拉教授赠送的一份礼物。
      6. 在黑暗中室温下，在PBS pH 7.2（1:1，000）中加入50μL/well DAPI（5mg/mL），小心地去除上清和染色核1分钟。
      7. 将 DAPI 染色溶液替换为 100 μL/well 的 PBS pH 7.2，并通过荧光显微镜进行分析。

结果

在14^日当天，胶质细胞培养（图1A）接受了机械分离。根据CD11b、CD45和GFAP标记，通过流细胞测定对分离细胞群进行了分析。我们可以观察到占星细胞种群的纯度为89.5%，微胶质种群的纯度为96.6%（图1B）。分离后，细胞被镀在96孔平板中，24小时后，根据各自的感染协议，它们准备被T.cruzi或T.gondii感染。在这?...

讨论

研究分离的胶质细胞在不同生物背景下的作用的重要性在过去二十年中一直在扩大。了解神经元以外的中枢神经系统仍然是细胞生物学中一个不断增长的领域，特别是在感染或炎症条件下^{88，9，24。9,24}胶质细胞不仅对神经元的体力支持至关重要（如以前所知），而且在许多其他生理情况下，如神经元能量供应、神经代谢、免疫...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Dinâmica Química Contemporânea	Cat: 2231	Sterilize
75 cm2 Flask	Corning	Cat: 430720U	Plastic material
96 well cell culture plate	Greiner Cellstar	Cat: 655090	Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Dinâmica Química Contemporânea	Cat: C10337.01.AH	Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody	Abcam	Cat.: ab49874	Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 mm CA	Corning	Cat: 430513	Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	Cat: A7906	FACS Buffer preparation
CD11b (FITC)	BD Pharmigen	Cat.: 553310	Flow cytometry antibody
CD45 (PE)	Invitrogen	Cat.: 12-0451-83	Flow cytometry antibody
Centrifuge	Eppendorf	Cat: 5810R	Centrifugation
Centrifuge	Eppendorf	5415R	Centrifugation
Class II biosafety cabinet	Pachane	Cat: 200	Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator	ThermoScientific	Model: 3110	Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL	Corning	Cat: 430766	Plastic material
Conical tubes 50 mL	Corning	Cat: 352070	Plastic material
Countess automated cell counter	Invitrogen	Cat: C10281	Cell counter
DAPI	Invitrogen	Cat.: D1306	Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera	Nikon	Cat: DS-RI1	Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	Cat: 12800-058	Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	Cat: E9884	FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture	Gibco	Cat: 21700-026	Cell culture medium
FACS Canto II	BD Biosciences	Unavaiable	Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS)	LGC Biotechnology	Cat: 10-bio500-1	Cell culture medium supplement
Flow Jo (software)	Flow Jo	Version: Flow Jo_9.9.4	Data analysis
Fluorescence intenselight	Nikon	Cat: C-HGFI	Fluorescence source
GFAP (APC)	Invitrogen	Cat.: 50-9892-82	Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC)	Kirkeegood&Perry Lab (KPL)	Cat.: 172-1806	Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	Cat: 14175079	Cell culture medium
HEPES	Sigma Aldrich	Cat: H4034	Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer	Invitrogen	Cat: 00-8222-49	Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope	Nikon	Model: ECLIPSE TS100	Microscope
Isoflurane	Cristália	Cat: 21.2665	Inhaled anesthetic
Methanol	Synth	Cat: 01A1085.01.BJ	Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula	ABC stainless	Unavaiable	Surgical material
Microtube 1.5 mL	Axygen	Cat: MCT-150-C	Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4	Non commercial	Non commercial	Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200)	Corning	Cat: 751630124	Pipette reagents
NIS Elements Software	Nikon	Version 4.0	Acquire and analyse images
Non-fat milk	Nestlé	Cat: 9442405	Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator	ThermoScientific	Model: 481 Cat: 11	Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	Cat: P6148	Fixation for Immunofluorescence
PBS	Non commercial	Non commercial	Neutral Buffer
Penicillin G	Sigma Aldrich	Cat: P-7794	Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10X)	Invitrogen	Cat: 00-8333-56	Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60x15 mm (Disposable, sterile)	Prolab	Cat: 0303-8	Plastic material
pH meter	Kasvi	K39-1014B	Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium	Gibco	Cat: 31800-014	Cell culture medium
Scissors	ABC stainless	Cat: LO9-W4	Surgical material
Serological pipette 10 mL	Corning	Cat: 4101	Plastic material
Serological pipette 5 mL	Corning	Cat: 4051	Plastic material
Single Channel Pipette (p1000)	Gilson Pipetman	Cat: F123602	Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200)	Gilson Pipetman	Cat: F123601	Pipette reagents
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	Cat: S6297	Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt	Sigma Aldrich	Cat: S9137	Cell culture medium supplement
Triton X-100	Sigma Aldrich	Cat: T9284	Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin	Gibco	Cat: 27250-018	Digestive enzyme
Tweezers	ABC stainless	Cat: L28-P4-172	Surgical material
Water Bath	Novatecnica	Model: 09020095	Digeste tissue at 37 ºC with trypsin