تسليم مرنا معدلة في نموذج الماوس احتشاء مايدق

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومتماسكة لتشفير جين من الاهتمام بشكل عابر باستخدام modRNA بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران.

Abstract

احتشاء عضلة القلب (MI) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. في العقد الماضي، أصبح العلاج الجيني خيار علاج واعد لأمراض القلب، نظرا لكفاءته وآثاره العلاجية الاستثنائية. في محاولة لإصلاح الأنسجة التالفة بعد MI، استخدمت دراسات مختلفة العلاج الجيني القائم على الحمض النووي أو الفيروسية ولكن واجهت عقبات كبيرة بسبب التعبير الفقير وغير المنضبط للجينات المسلمة، وذمة، وعدم انتظام ضربات القلب، وضمور القلب. الاصطناعية تعديل مرنا (MODRNA) يقدم نهج العلاج الجيني رواية التي تقدم عالية, عابرة, آمنة, غير مناعة, والسيطرة على تسليم مرنا إلى أنسجة القلب دون أي خطر من التكامل الجينومي. بسبب هذه الخصائص الرائعة جنبا إلى جنب مع الدوائية على شكل جرس في القلب، أصبحت وزارة الدفاع الأميركية نهج جذاب لعلاج أمراض القلب. ومع ذلك، لزيادة فعاليتها في الجسم الحي، يجب اتباع طريقة تسليم متسقة وموثوقة. وبالتالي، لتحقيق أقصى قدر من كفاءة التسليم MODRNA والاتساق العائد في استخدام MODRNA في التطبيقات في مجال المعلومات الحية، يتم تقديم طريقة الأمثل لإعداد وتسليم حقن داخل القلب modRNA في نموذج MI ماوس. وهذا البروتوكول سيجعل من تسليم وزارة الدفاع الأمريكية أكثر سهولة للأبحاث الأساسية والترجمة.

Introduction

العلاج الجيني هو أداة قوية تنطوي على تقديم الأحماض النووية لعلاج, علاج, أو الوقاية من الأمراض البشرية. على الرغم من التقدم المحرز في الأساليب التشخيصية والعلاجية لأمراض القلب، كان هناك نجاح محدود في توصيل الجينات في احتشاء عضلة القلب (MI) وفشل القلب (HF). كما واضحة كما يبدو عملية العلاج الجيني، بل هو نهج معقد بشكل ملحوظ بالنظر إلى العديد من العوامل التي تحتاج إلى تحسين قبل استخدام وسيلة تسليم معينة. يجب أن يكون ناقل التسليم الصحيح غير مناعيًا وفعالًا ومستقرًا داخل جسم الإنسان. وقد أدت الجهود المبذولة في هذا المجال إلى توليد نوعين من نظم الإيصال: الفيروسية أو غير الفيروسية. وقد أظهرت النظم الفيروسية المستخدمة على نطاق واسع، بما في ذلك نقل الجينات عن طريق الفيروس الغدي، أو الفيروس الرجعي، أو فيروس العدس، أو الفيروس المرتبط بالغدد الهضمية، قدرة تحويلية استثنائية. ومع ذلك، يقتصر استخدامها في العيادات بسبب استجابة المناعة القوية الناجمة¹، خطر ورميجانيس²، أو وجود الأجسام المضادة تحييد³، وكلها لا تزال عقبة رئيسية أمام تطبيق واسع وفعال من ناقلات الفيروسية في العلاج الجيني البشري. من ناحية أخرى ، على الرغم من نمط التعبير المثير للإعجاب ، فإن تسليم الحمض النووي البلازمي العاري يعرض كفاءة منخفضة في نقل الحيوانات ، في حين أن نقل مرنا يقدم درجة عالية من المناعة وقابلية التدهور بواسطة RNase⁴.

مع البحث المكثف في مجال مررنا، أصبحت وزارة الدفاع الأمريكية أداة جذابة لتوصيل الجينات إلى القلب والأعضاء الأخرى المختلفة نظراً لمزاياها العديدة على ناقلات⁵التقليدية . الاستبدال الكامل للريدين مع نتائج الزائفة التي تحدث بشكل طبيعي في تعبير بروتين أكثر قوة وعابرة ، مع الحد الأدنى من الحث على الاستجابة المناعية الفطرية وخطر الاندماج الجينومي⁶. بروتوكولات المنشأة مؤخرا استخدام كمية الأمثل من مكافحة عكس الغطاء التناظرية (ARCA) أن يعزز أكثر من ترجمة البروتين عن طريق زيادة استقرار وtransability من الحمض النووي الاصطناعية^7.

وقد أظهرت التقارير السابقة التعبير عن مختلف المراسلين أو الجينات الوظيفية التي ألقاها MODRNA في عضلة القلب القوارض بعد MI. مع تطبيقات MODRNA, مناطق كبيرة من عضلة القلب, بما في ذلك كل من cardiomyocytes و noncardiomyocytes, وقد تم بنجاح نقل العدوى بعد إصابة القلب⁸ للحث على تولد الأوعية^9,10, بقاء الخلايا القلبية¹¹, وdydmyocyte تكاثر¹². A إدارة واحدة من MODRNA ترميز لحور البصيلاتاتين البشرية مثل 1 يدفع انتشار الماوس الكبار CMs ويزيد بشكل كبير وظيفة القلب، ويقلل من حجم ندبة، ويزيد من كثافة الشعيرات الدموية 4 أسابيع بعد MI¹². وأفادت دراسة أكثر حداثة تحسين وظيفة القلب بعد MI مع تطبيق VEGFA MODRNA في نموذج الخنازير¹⁰.

وهكذا، مع زيادة شعبية وزارة الدفاع في مجال القلب، فمن الضروري لتطوير وتحسين بروتوكول لتسليم MODRNA إلى القلب بعد MI. هنا هو بروتوكول يصف إعداد وتسليم modRNA المنقى والمحسن في صياغة السيترات المالحة القابلة للتكفو الحيوي التي توفر قوية، تعبير البروتين مستقرة دون تحفيز أي استجابة مناعية. الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول والفيديو يوضح الإجراء الجراحي القياسي للفأر MI عن طريق الربط الدائم للشريان الخلفي السفلي الأيسر (LAD) ، يليه ثلاثة حقن داخل القلب من مودرنا. والهدف من هذه الورقة هو تحديد واضح طريقة دقيقة للغاية وقابلة للاستنساخ من تسليم مودرنا إلى عضلة القلب مورين لجعل تطبيق MODRNA يمكن الوصول إليها على نطاق واسع للعلاج الجيني القلبي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المبينة هنا من قبل كلية إيكان للطب في لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية في جبل سيناء.

1. توليفة من وزارة الدفاع

ملاحظة: يمكن الاطلاع على تفاصيل توليف MODRNA في كوندرات وآخرون¹³.

1. طلب القوالب plasmid(جدول المواد)وتوليد منتج PCR نظيفة لاستخدامها كقالب مرنا.
2. إعداد modRNAs عن طريق النسخ في المختبر مع مزيج ribonucleoside مخصصة من التالي (جدول المواد):T7 النسخ عدة، 6 mM المضادة للتآكل تناظري (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G، 75 mM guanosine ثلاثي الفوسفات، 75 mM أدينوسين ثلاثي الفوسفات، 75 mM cytidine ثلاثي الفوسفات، 100 mM pseudouridine-5-ثلاثي الفوسفات، وانزيم T7 DNase.
3. تنقية modRNA المحرز في الخطوة 1.2 مع مجموعة تنظيف النسخ (جدول المواد) وعلاج مع phosphatase القطب الجنوبي. بعد ذلك ، إعادة تطهير MODRNA مع مجموعة تنظيف النسخ وتحديدها باستخدام مقياس الطيف.
4. عجلت MODRNA مع الإيثانول وخلات الأمونيوم و resuspend في 10 mM تريس-HCl و 1 mM EDTA.
5. تركز وزارة الدفاعRNA لفي تسليم الجسم الحي من قبل المرشحات الطرد المركزي وقياس الجودة باستخدام منصة الكهربائية الآلي(جدول المواد).

2. إعداد حقن MODRNA لفي تسليم الجسم الحي

1. حساب حجم اللازمة ل 100 ميكروغرام من لوسيفيراز (لوك)/كري مودرنا حقن استناداً إلى تركيز MODRNA.
2. اخلطي الحجم المحسوب من مودرنا مع أجزاء متساوية من محلول السكروز المعدة في الماء الخالي من النوى (0.3 جم/مل) و 0.1 M citrate حل (درجة حِوية = 7) (20 ميكرولتر لكل من الموصى بها).
3. جلب حجم النهائي من الحقن إلى 60 ميكرولتر بإضافة محلول ملحي.

3. جراحة احتشاء عضلة القلب

1. تخدير وإعداد الحيوان
   ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة ذكوراً وأنثى فئران CFW بعمر 8−12 أسبوعاً.
   1. تخدير الماوس مع isoflurane 2٪ باستخدام غرفة التعريفي ووضع الحيوان على ظهره في موقف الظهر مع قناع الوجه على الأنف والفم للحفاظ على التخدير. الحفاظ على التخدير عن طريق التهوية الميكانيكية باستخدام جهاز التنفس مجهزة أنبوب مجرى الهواء 7-8 مم ومرشح.
   2. لشل الماوس على منصة الجراحة، وتأمين أطرافه مع الشريط الجراحي. حلق منطقة الرقبة والجانب الأيسر من القفص الصدري وتطهير باستخدام 70٪ الإيثانول واليود povidone. كرر خطوة التطهير مرتين. تحقق من ردود الفعل ، معسر الذيل والقدمين الخلفيتين لتقييم عمق التخدير.
   3. مراقبة مستمر والحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية في normothermia (37.5-38 درجة مئوية).
   4. الحفاظ على مجرى الهواء المفتوح عن طريق إجراء النوبات داخل منطقة التنفّاض داخل منطقة التّرَك. للقيام بذلك، ضع الماوس في موقف البطن مع فمه التي تواجه نحو المجرب وسحب بلطف من اللسان. ضبط زاوية الرقبة وتصويب مسار الاحتضان ودفع في قنية الاحتضان.
   5. في حالة الحيوان غير قادر على التنفس من خلال ذلك، يمكن إجراء استئصال القصبة الهوائية. إجراء شق عنق الرحم على طول خط الوسط عزل الجلد, العضلات, والأنسجة الخطوط العريضة القصبة الهوائية باستخدام المجهر. عندما تكون القصبة الهوائية مرئية بوضوح، أدخل أنبوب البطاية في الأنسجة بين حلقتين خرطوشتين تحت الجلوتيس عن طريق إحداث ثقب صغير وعقد الجزء القحفي من القصبة الهوائية باستخدام ملقط مجهرية.
   6. مراقبة حركة الصدر من الماوس للتحقق من أن كلا الرئتين تلقي الأوكسجين. يجب أن يكون معدل التنفس (RR) حوالي 120 نفسًا في الدقيقة ، مع ضغط ملهم يبلغ 17-18 سم H₂O.
2. الربط الشريان تنازلي (LAD) اليسار
   1. لتنفيذ ربط LAD، بدوره الماوس بعناية حتى أنها ملقاة على جانبها الأيمن. ارفعي الجلد وقمي بإجراء استئصال الصدر من الجانب الأيسر بين الضلعين الثالث والرابع وتشريح الأنسجة والعضلات بعناية. استخدم الكيوتي لمنع النزيف.
   2. افتح الصدر بعناية وبمجرد فتحه ، ابحث عن القلب ، دون لمس الرئة بأي جسم حاد. ضع الداخرات في الشق للحفاظ على التجويف الصدري مفتوحًا وافتح رؤية واضحة للقلب. الآن نقل الرئتين إلى حافة شق وإزالة جزء من كيس البريكاردي الذي يغطي القلب للوصول إلى السطح الأمامي للقلب.
   3. حدد بعناية LAD، والتي يمكن أن ينظر إليها على أنها وعاء أحمر فاتح عميق يقع بين الشريان الرئوي والوعاء الأيسر. Ligate و LAD في نطاق صغير مع خياطة واحدة واحدة من خياطة الحرير 7-0. ضع أنبوب الصدر (28 G، قسطرة الوريدي)، بين الضلع الرابع والضلع الخامس.
   4. أغلق الشق الصدري في الطبقات. استخدام خياطة الحرير 6-0 تشغيل لتكييف الأضلاع واستخدام 5-0 الحرير تشغيل الغرز لإغلاق الجلد. تأكد من ترك نافذة مناسبة لقياس صدى القلب في المستقبل.
   5. استنزف الصدر بعناية بمحلول متساوي التوتر الدافئ (9 جرام من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء) باستخدام حقنة 2 مل. ضع الماوس على ظهره. إذا كان إجراء استئصال القصبة الهوائية، واتخاذ أنبوب endotracheal بها واستخدام 7-0 خياطة الحرير التكيف مع حلقات خرطوشة القصبة الهوائية مع غرزة واحدة. ضع قناع الوجه على الفأرة واغلق الجلد باستخدام خياطة 5-0 حريرية.
   6. بالنسبة لمرحلة التعافي، افصلي عن قنية النوبات من جهاز التنفس الصناعي واسمحي بالتنفس التلقائي. وضع الحيوان تحت مصباح الحرارة حتى يصل إلى وعيه. لا تترك الحيوان دون مراقبة بعد الجراحة حتى يكون مستيقظا تماما.
   7. إدارة علاج الألم مع buprenophine في 0.1 ملغ / كغ من وزن الجسم, حقن تحت الجلد للأيام 3 المقبلة في فترات 12 ساعة.

4. تسليم القلب من وزارة الدفاع

1. تسليم ما مجموعه 60 ميكرولتر من وزارة الدفاع الأمريكية أعدت في الخطوة 2.3 العضلي (IM) باستخدام حقنة الأنسولين (31 G) بعد MI.
   1. حقن 20 ميكرولتر من وزارة الدفاع في ثلاثة مواقع مختلفة من عضلة القلب المحيطة منطقة نقش (اثنان على جانبي الربط وواحد في القمة). إجراء الحقن مباشرة بعد LAD, قبل إغلاق الصدر.
      ملاحظة: يمكن رؤية صور تمثيلية لمواقع حقن MODRNA في الشكل 1.

5. التحقق من صحة التعبير البروتين في القلب بعد MI

1. Luciferase التعبير MODRNA باستخدام نظام التصوير التخمين الحيوي
   ملاحظة: يتم حقن ما مجموعه 100 ميكروغرام من Luc mRNA المعدة في 60 ميكرولتر من العازلة سيترات السكروز مباشرة في قلب الفئران CFW بعد MI.
   1. في 24 ح آخر MI و modRNA حقن, تخدير الفئران مع 2% isoflurane باستخدام غرفة التعريفي وداخلاتونيا حقن لوسيفرين (150 ملغ / ز وزن الجسم) للتحقق من صحة إشارة لوك في الجسم الحي.
   2. صورة الفئران باستخدام نظام التصوير الشعاعي الحيوي كل 2 دقيقة حتى إشارة لوك تصل إلى التشبع.
   3. كمّيّة بيانات التصوير المجمّعة مع برنامج تحليل التصوير. استخدم الفئران التي تم حقنها بالملوحة المالحة فقط كقراءة أساسية للتعبير Luc واطرح إشارة الخلفية التي تم جمعها من الفئران المحقونة بالملوحة.
      ملاحظة: يتم التعبير عن إشارة لوك في p/s/cm²/sr x 10^6.
2. المناعة للتحقق من صحة نقل Cre
   1. للتحقق من صحة تروس مع Cre، تضحية الحيوانات 24 ح بعد الحقن باستخدام حقن داخل الصفتون من 100 ملغ/ كغ الكيتامين و 10 ملغ/كغ xylazine تليها خلع عنق الرحم. قبل إجراء شق، تطهير الصدر والبطن باستخدام مسحة الكحول 70٪.
   2. فتح تجويف الصدر عن طريق جعل شق عرضية ~ 1 سم أقل من القص وتحريك المقص نحو الرأس، وقطع من خلال القفص الصدري.
   3. افتح الصدر واحقن 1 مل من برنامج تلفزيوني معقمة في غرفة البطين الأيمن لإزالة الدم الزائد. اُخراج القلب فوراً ووضعها في برنامج تلفزيوني معقمة لتغسل الدم المتبقي.
   4. إصلاح القلب في 4٪ شبهformaldehyde (PFA) لمدة 24 ساعة، تليها حضانة بين عشية وضحاها في محلول السكروز 30٪ في 4 درجة مئوية. في اليوم التالي تضمين قلوب في المتوسط درجة الحرارة القطع الأمثل وقسم لهم بسمك 10 ميكرومتر باستخدام التبريد.
   5. وصمة عار المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية ضد التروبونين القلبي الأول (cTNI) وتسمية لهم مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية. لتحديد النواة، وصمة عار مع 4'، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) لمدة 5 دقائق. صورة الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت.

6 - التحليل الإحصائي

1. رسم رسم بياني شريطي استناداً إلى تعبير لوك في الماوس المالحة و الماوس التي تم حقنها لوك و قم بالإبلاغ عن القيم مثل متوسط ± SEM. قارن بين المجموعتين باستخدام اختبار t غير مُزحم (****p < 0.0001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم تخدير الفئران التي يبلغ عمرها ثمانية إلى عشرة أسابيع باستخدام الأيزوفلوران والمخاتنة. بعد أن كان الحيوان تحت التخدير، تم حلق المنطقة الصدرية اليسرى وتعقيمها بالإيثانول، وتعرض القلب لأربطة LAD. تم انسداد الشريان التاجي الأيسر من قبل عقدة بحزم خياطة تحت الشريان (الرسم البياني

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد أظهرت العلاج الجيني إمكانات هائلة لدفع كبير في علاج أمراض القلب. ومع ذلك, الأدوات التقليدية المستخدمة في التجارب السريرية الأولية لعلاج HF أظهرت نجاحا محدودا وترتبط بآثار جانبية شديدة. الحمض النووي الريبي المعدل يقدم تسليم الجينات غير الفيروسية التي تكتسب شعبية باستمرار كأداة نقل الج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G	TriLink Biotechnologies	N-7003
Bioluminescense imaging system	Perkin Elmer	124262	IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors	FST	18200-09
Cardiac tropnin I	Abcam	47003
Cytidine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System	Harvard Apparatus	75-2001
Forceps- Adson	FST	91106-12
Forceps- Dumont #7	FST	91197-00
Guanosine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
In vitro transcription kit	Invitrogen	AMB13345	5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula	Harvard Apparatus
Megaclear kit	Life Technologies
Mouse ventilator	Harvard Apparatus	73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate	TriLink Biotechnologies	N-1081
NanoDrop Spectrometer	Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors	FST	12002-12
Plasmid templates	GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	FST	14200-12
Stereomicroscope	Zeiss
Sutures	Ethicon	Y433H	5.00
Sutures	Ethicon	Y432H	6.00
Sutures	Ethicon	7733G	7.00
T7 DNase enzyme	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Tape station	Aligent	4200
Transcription clean up kit	Invitrogen	AM1908	Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k	Amicon	UFC801096