משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

Summary

פרוטוקול זה מציג דרך פשוטה וקוהרנטית לupregulate גן של עניין באמצעות modRNA לאחר אוטם שריר הלב בעכברים.

Abstract

אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם מוביל לתחלואה ותמותה בעולם המערבי. בעשור האחרון, טיפול גנטי הפך לאפשרות טיפול מבטיח עבור מחלות לב, בשל היעילות שלה השפעות טיפוליות יוצאת דופן. במאמץ לתקן את הרקמה הפגומה post-MI, מחקרים שונים המועסקים DNA מבוססי או נגיפי טיפול גנטי אבל יש התמודד מכשולים ניכרים בשל הביטוי המסכן ובלתי מבוקרת של הגנים הנמסרים, בצקת, הפרעת קצב, והיפרפרס לב. שונה סינתטי mRNA (modRNA) מציג גישה גנטית הרומן טיפול המציעה גבוהה, ארעי, בטוח, לא חיסוני, מסירה mRNA מבוקרת לרקמת הלב ללא כל סיכון של אינטגרציה גנומית. בשל המאפיינים המדהימים הללו בשילוב עם הפרמקוקינטיקה בצורת פעמון בלב, הפכה modRNA לגישה אטרקטיבית לטיפול במחלת לב. עם זאת, כדי להגביר את יעילותו ב vivo, שיטת מסירה עקבית ואמינה צריך להיות אחריו. מכאן, כדי למקסם את יעילות מסירה modRNA ועקביות תשואה בשימוש modRNA עבור יישומים vivo, שיטה ממוטבת של הכנה ומסירה של הזרקת modRNA בתוך מודל MI העכבר מוצג. פרוטוקול זה יהפוך את מסירת modRNA לנגישה יותר עבור מחקר בסיסי וטרנסלייתי.

Introduction

טיפול גנטי הוא כלי רב עוצמה מעורבים המסירה של חומצות גרעין לטיפול, ריפוי, או מניעה של מחלות אנושיות. למרות ההתקדמות בגישות אבחון וטיפולי למחלת לב, יש הצלחה מוגבלת בהעברת גנים אוטם שריר הלב (MI) ואי ספיקת לב (HF). פשוט כמו תהליך של ריפוי גנטי נראה, היא גישה מורכבת במידה ניכרת בהתחשב גורמים רבים שצריכים להיות ממוטבים לפני שימוש ברכב משלוח מסוים. וקטור משלוח נכון צריך להיות לא חיסוני, יעיל, ויציב בתוך גוף האדם. המאמצים בתחום זה יצרו שני סוגים של מערכות משלוח: נגיפי או לא ויראלי. בשימוש נרחב מערכות ויראליות, כולל העברה גנטית על ידי אדנווירוס, רטרווירוס, הנגיף, או וירוס הקשורים adeno, הראו קיבולת התמרה יוצאת דופן. עם זאת, השימוש שלהם במרפאות מוגבל בשל התגובה החיסונית חזקה הנגרמת¹, הסיכון של tumorigenesis², או הנוכחות של נוגדנים לנטרל³, כולם נשארים מכשול גדול ליישום רחב ואפקטיבי של וקטורים ויראליות בטיפול גנטי האדם. מצד שני, למרות דפוס הביטוי המרשים שלהם, המסירה של ה-DNA העירום מציג יעילות הזיהום הנמוך, בעוד mRNA העברה מציג חיסוני גבוה ורגישות השפלה על ידי RNase⁴.

עם מחקר נרחב בתחום של mRNA, modRNA הפך לכלי אטרקטיבי עבור העברת גנים ללב ואיברים אחרים שונים בשל יתרונותיה הרבים על פני וקטורים מסורתיים⁵. החלפת השלמה של uridine עם התוצאות הטבעיות המתרחשות באופן טבעי ביטוי חלבונים חזקים יותר וארעי, עם אינדוקציה מינימלית של התגובה החיסונית מולדת הסיכון של אינטגרציה גנומית⁶. פרוטוקולים שהוקמו לאחרונה להשתמש כמות ממוטבת של אנטי הפוכה כובע אנלוגי (מארקה) כי עוד מגביר את תרגום החלבון על ידי הגברת היציבות והיכולת הטרנססינתטית של mRNA הסינתטי⁷.

דיווחים קודמים הראו את הביטוי של כתבת שונים או גנים פונקציונליים שנמסרו על ידי modRNA ב שריר הלב מכרסם לאחר MI. עם יישומים modrna, אזורים משמעותיים של שריר הלב, כולל הקרדיוציטים וללא קרדיוציטים, היתה בהצלחה לאחר הפגיעה הפוסט-קרדיולוגית⁸ כדי לגרום לאנגיוגנזה^9,10, הישרדות תא הלב¹¹, ו התפשטות קרדיומוציט¹². מנהל יחיד של modRNA מקודד עבור האדם מוטציה follistatin כמו 1 גורם התפשטות של העכבר CMs למבוגרים ומגדילה באופן משמעותי את תפקוד הלב, מקטין את גודל הצלקת, ומגביר את צפיפות נימי 4 שבועות post-MI¹². מחקר שנערך לאחרונה דיווח על תפקוד לב משופר לאחר MI עם יישום של וודרנה modRNA במודל חזיר¹⁰.

כך, עם הפופולריות הגוברת של modRNA בשדה הלב, זה חיוני לפתח ולייעל פרוטוקול למשלוח של modRNA ללב post-MI. בזאת הוא פרוטוקול המתאר את ההכנה והמסירה של מודנה מטוהרים ואופטימיזציה בניסוח ביולוגי מלוחים ציטראט המספק חזק, ביטוי חלבון יציב מבלי לעורר תגובה חיסונית. השיטה המוצגת בפרוטוקול זה וידאו מדגים את ההליך הכירורגי הרגיל של העכבר MI על ידי הארכה לצמיתות של העורק הקדמי שמאל בירידה (LAD), ואחריו שלושה זריקות האתר תאיים של modRNA. המטרה של הנייר הזה היא להגדיר בבירור שיטה מדויקת מאוד מדויק של משלוח modRNA כדי שריר הלב murine כדי להפוך יישום modRNA נגיש באופן נרחב לטיפול גנטי לב.

Protocol

כל הליכי החיות המתוארים כאן אושרו על ידי בית הספר לרפואה ע י Icahn בראש הועדה המוסדית של הר סיני.

1. סינתזה של modRNA

הערה: הפרטים של סינתזה של modRNA ניתן למצוא ב-Kondrat ואח '¹³.

1. הזמן את תבניות הפלביניים (טבלת חומרים) וצור מוצר PCR נקי שישמש כתבנית mrna.
2. להכין את modRNAs על ידי שעתוק בתוך מבחנה עם תערובת ribonucleoside מותאם אישית של הבאים (טבלת חומרים): T7 kit, 6 מ"מ אנטי הפוכה כובע אנלוגי (מארקה) 30-O-Me-m7G (50) ppp (50) G, 75 mm guanosine triphosphate, 75 mm אדנוזין triphosphate, 75 mm cytidine triphosphate, 100 הפסבדו מ"מ-5-triphosphate, ו האנזים T7 DNase.
3. לטהר את modRNA עשה בשלב 1.2 עם ערכת ניקוי שעתוק (לוח חומרים) ולטפל עם פוספספטאז האנטארקטי. בשלב הבא, הסלידה מmodrna עם ערכת ניקוי התעתיק ומכמת אותו באמצעות ספקטרוסקופיה.
4. מזרז את modRNA עם אתנול ו אמוניום אצטט ו להשעות מחדש ב-10 mM טריס-HCl ו 1 מ"מ EDTA.
5. לרכז את modRNA עבור במסירה vivo ידי מסננים צנטריפוגליים ולמדוד את האיכות באמצעות פלטפורמת אלקטרופורזה אוטומטית (טבלת חומרים).

2. הכנת הזרקת modRNA למסירה vivo

1. לחשב את הנפח הדרוש עבור 100 μg של לוציפראז (לוק)/הזרקה modRNA הזרקת מבוסס על הריכוז modRNA.
2. מערבבים את הנפח המחושב של modrna עם חלקים שווים של הפתרון סוכרוז הכין ב נוקלאז מים ללא תשלום (0.3 g/mL) ו 0.1 הפתרון של ציטראט (pH = 7) (20 μl כל מומלץ).
3. הביאו את הכרך הסופי של הזריקה ל-60 μL על-ידי הוספת תמיסת מלח.

3. ניתוח אוטם שריר הלב

1. הרדמה והכנת החיה
   הערה: מחקר זה משתמש בעכבר CFW זכר ונקבה 8 עד 12 שבועות.
   1. שבור את העכבר עם 2% isofלוריאן באמצעות חדר אינדוקציה ומניחים את החיה על גבו בתנוחה גב עם מסכה על האף והפה כדי לשמור על ההרדמה. שמרו על ההרדמה באמצעות אוורור מכני תוך שימוש במכונת ההנשמה המצוידת בצינור אווירי 7-8 מ"מ ומסנן.
   2. , לשתק את העכבר בפלטפורמת הניתוח. לאבטח את איבריו בנייר כירורגי גלח את אזור הצוואר ואת הצד השמאלי של הצלעות ולחטא באמצעות 70% אתנול ו povidone יוד. חזור על שלב החיטוי פעמיים. בדוק את הרפלקסים שלה, צובט את הזנב ואת הרגליים האחוריות כדי להעריך את עומק ההרדמה.
   3. ברציפות לפקח ולתחזק את טמפרטורת הגוף הליבה בנוראממיה (37.5-38 ° c).
   4. לשמור על דרכי הנשימה פתוח על ידי ביצוע צנרור intratracheal. כדי לעשות זאת, מניחים את העכבר בתנוחה מגיית עם הפה מול הניסויים ומושכים את הלשון בעדינות. התאימו את זווית הצוואר וישרו את נתיב הצנרור ודחפו את צינורית הצנרור.
   5. במידה והחיה אינה מסוגלת לנשום דרכו, ניתן לבצע שעומת קנה. בצע חתך צוואר הרחם לאורך קו האמצע בידוד העור, שריר, רקמה לחלוקה לרמות את קנה הנשימה באמצעות מיקרוסקופ. כאשר קנה הנשימה נראה בבירור, להכניס את צינור האנדוקנה לתוך הרקמה בין שתי טבעות מחסנית מתחת glottis על ידי עשיית חור קטן מחזיק את החלק הגולגולתית של קנה הנשימה באמצעות מלקחיים יקרוכירורגית.
   6. שימו לב לתנועת החזה של העכבר כדי לוודא ששתי הריאות מקבלות חמצן. שיעור הנשימה (RR) צריך להיות כ-120 נשימות לדקה, עם לחץ inspiratory של 17 עד 18 ס"מ H₂O.
2. הארכה שמאלית קדמית (LAD)
   1. כדי לבצע את הפנייה לחור, סובב את העכבר בזהירות, כך שהוא שוכב על צידו הימני. הרם את העור ובצע את הניקור השמאלי בין הצלע השלישית לצלעות הארבע ונתח את הרקמה ואת השריר בזהירות. . השתמש בבית-גידול כדי למנוע דימום
   2. פתח את החזה בזהירות וברגע שהוא פתוח, מצא את הלב, בלי לגעת בריאה עם כל חפץ חד. מניחים את הטרקטורים לתוך החתך כדי לשמור על חלל החזה פתוח יש לראות ברור של הלב. עכשיו להעביר את הריאות לקצה החתך ולהסיר את החלק של שק קרום הלב המכסה את הלב כדי לגשת אל פני השטח הקדמי של הלב.
   3. בזהירות לזהות את LAD, אשר ניתן לראות ככלי אדום אור עמוק הממוקם בין עורק הריאות לבין האוריקל השמאלי. ליגייט הצעיר עם תפר אחד של תפר משי 7-0 מניחים צינורית חזה (28 גרם, קטטר וונאל), בין הצלע הרביעית לבין ה-5.
   4. לסגור את החתך בחזה בשכבות. השתמש משי 6-0 פועל תפרים להתאים את הצלעות ולהשתמש 5-0 משי פועל תפרים לסגור את העור. הקפידו להשאיר חלון מתאים למדידת מדידת האקו-קרדיוגרפית העתידית.
   5. בזהירות לנקז את בית החזה עם פתרון איזוטוניק חם (9 גרם של נתרן כלוריד 1 L של מים) באמצעות מזרק 2 mL. הניחו את העכבר על גבו. אם ביצוע מימוש בקנה הנשימה, השתמש בצינור האנדוקנה ובעזרת הכלי להתאמת מחסנית הקנה עם תפר של 7-0 באחת. מניחים את מסיכת הפנים על העכבר ולסגור את העור באמצעות 5-0 משי פועל תפרים.
   6. לשלב ההתאוששות, לנתק את צינורית הצנרור ממכונת ההנשמה ולאפשר נשימה ספונטנית. מניחים את החיה תחת מנורת חום עד שהיא משיגה את התודעה. אל תשאירו את בעל החיים ללא השגחה לאחר הניתוח עד שהוא ער לחלוטין.
   7. ניהול טיפול בכאב עם buprenophine ב 0.1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף, מוזרק תת-עורי עבור 3 הימים הבאים במרווחי זמן של 12 h.

4. משלוח לב של modRNA

1. לספק סכום כולל של 60 μL של modRNA מוכן בשלב 2.3 הפנימי (IM) באמצעות מזרק אינסולין (31 G) בעקבות MI.
   1. הכנס 20 μL של modRNA בשלושה אתרים שונים של שריר הלב המקיפים את אזור סיכונים (שניים בכל צד של הארכה ואחד בקודקוד). בצע את הזריקות מיד לאחר LAD, לפני סגירת החזה.
      הערה: תמונות מייצגות של אתרי הזרקת modRNA ניתן לראות באיור 1.

5. אימות ביטוי החלבון בתוך הלב לכתוב MI

1. ביטוי לוציפראאז מודרנה באמצעות מערכת דימות ביולומינסנציה
   הערה: סך של 100 μg של לוק mRNA הכין ב 60 μL של המאגר הציטראט של סוכות מוזרק ישירות ללב של עכברים CFW לאחר MI.
   1. ב 24 h לאחר הזרקת MI ו modrna, מורדם העכברים עם 2% isofלוריאן באמצעות חדר אינדוקציה ו intraperitoneally הזריק לוספרין (150 מ"ג/g משקל גוף) כדי לאמת את האות לוק ב vivo.
   2. התמונה עכברים באמצעות מערכת הדמיה biלומינסנציה כל 2 דקות עד האות לוק מגיע לרוויה.
   3. לכמת את נתוני ההדמיה שנאספו עם תוכנת ניתוח הדמיה. השתמש עכברים מוזרק עם מלוחים רק כקריאה בסיסית עבור לוק ביטוי להפחית את אות הרקע שנאסף מתוך עכברים מוזרק מלוחים.
      הערה: האות לוק מתבטא ב-p/s/cm²/sr x 10⁶.
2. כתמים לאימות מעגל היצור
   1. כדי לאמת את הקשר עם היצור, להקריב את החיות 24 שלאחר ההזרקה באמצעות הזרקת הצפק של 100 mg/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג xylazine ואחריו פריקה צוואר הרחם. לפני ביצוע חתך, לחטא את החזה ואת הבטן באמצעות 70% מספוגית אלכוהול.
   2. פתח את חלל בית החזה על ידי ביצוע חתך רוחבי ~ 1 ס מ נמוך יותר עצם החזה ולהעביר את המספריים לכיוון הראש, חיתוך דרך כלוב הצלעות.
   3. פתח את החזה ולהזריק 1 מ ל של ה-PBS סטרילי בחדר הימני הנכון כדי להסיר דם עודף. בלו את הלב מיד והניחו אותו בערוץ ה-PBS הסטרילי כדי לשטוף את הדם שנותר.
   4. לתקן את הלב ב 4% פאראפורמלדהיד (בארה ב) עבור 24 שעות, ואחריו דגירה לילה ב 30% הפתרון סוכרוז ב 4 ° c. ביום למחרת להטביע את ליבם של טמפרטורה החיתוך האופטימלי בינונית ולחלק אותם בעובי של 10 יקרומטר באמצעות קריוסטט.
   5. כתם את הסעיפים עם הנוגדן העיקרי נגד המוני האני (cTNI) ולתייג אותם עם נוגדן משני פלורסנט. כדי לזהות את הגרעין, כתם עם 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) עבור 5 דקות. תמונה השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט.

6. אנליזה סטטיסטית

1. מתווה גרף עמודות המבוסס על הביטוי לוק בתוך מלוחים ועכברים מוזרק לוק ומדווח על הערכים כממוצע ± SEM. השוואת שתי הקבוצות באמצעות מבחן t שאינו משויך (* * * * p < 0.0001).

תוצאות

שמונה עד עשרה עכברים בני שבוע. הורדם עם איזולבנה וצינורות לאחר שהחיה הייתה תחת הרדמה, אזור החזה השמאלי היה מגולח ומעוקר באתנול, והלב נחשף לקשר בחור. עורק העורקים השמאלי הושאר בחוזקה על ידי שיסוף התפר מתחת לעורק הראשי (ייצוג התרשים באיור 1A). לאחר אוטם מוצלח (המצוין על-ידי paling ?...

Discussion

טיפול גנטי הראה פוטנציאל עצום כדי לקדם באופן משמעותי את הטיפול במחלת לב. עם זאת, כלים מסורתיים המועסקים ניסויים קליניים הראשונית לטיפול ב-HF הראו הצלחה מוגבלת משויכים תופעות לוואי חמורות. RNA שונה מציג משלוח גנטי לא נגיפי כי הוא צובר פופולריות ברציפות ככלי העברת גנים בלב. ModRNA לא דורש לוקליזצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G	TriLink Biotechnologies	N-7003
Bioluminescense imaging system	Perkin Elmer	124262	IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors	FST	18200-09
Cardiac tropnin I	Abcam	47003
Cytidine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System	Harvard Apparatus	75-2001
Forceps- Adson	FST	91106-12
Forceps- Dumont #7	FST	91197-00
Guanosine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
In vitro transcription kit	Invitrogen	AMB13345	5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula	Harvard Apparatus
Megaclear kit	Life Technologies
Mouse ventilator	Harvard Apparatus	73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate	TriLink Biotechnologies	N-1081
NanoDrop Spectrometer	Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors	FST	12002-12
Plasmid templates	GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	FST	14200-12
Stereomicroscope	Zeiss
Sutures	Ethicon	Y433H	5.00
Sutures	Ethicon	Y432H	6.00
Sutures	Ethicon	7733G	7.00
T7 DNase enzyme	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Tape station	Aligent	4200
Transcription clean up kit	Invitrogen	AM1908	Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k	Amicon	UFC801096