심근 경색 마우스 모델에서 수정된 mRNA의 납품

요약

이 프로토콜은 마우스에서 심근 경색 후 modRNA를 사용하여 관심 유전자를 일시적으로 조절하는 간단하고 일관된 방법을 제시합니다.

초록

심근 경색 (MI)은 서방 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 지난 10 년 동안, 유전자 치료는 심장 질환에 대 한 유망한 치료 옵션이 되었다, 그것의 효율성 및 뛰어난 치료 효과 때문에. 손상된 조직 포스트 MI를 복구하기 위한 노력의 일환으로, 각종 연구 결과는 DNA 기지를 둔 바이러스성 유전자 치료를 채택했습니다 그러나 전달된 유전자, 부종, 부정맥 및 심장 비대의 가난하고 통제되지 않는 발현 때문에 상당한 장애물에 직면했습니다. 합성 변형 된 mRNA (modRNA)는 게놈 통합의 위험없이 심장 조직에 높은, 일시적인, 안전, 비 면역 원성 및 제어 된 mRNA 전달을 제공하는 새로운 유전자 치료 접근법을 제시한다. 이러한 놀라운 특성으로 인해 심장에 종 모양의 약물 역학과 결합 된 modRNA는 심장 질환 치료를위한 매력적인 접근 방식이되었습니다. 그러나 생체 내에서 그 효과를 높이기 위해서는 일관되고 신뢰할 수 있는 전달 방법을 따라야 합니다. 따라서, 생체 내 용도에 대한 modRNA 사용의 modRNA 전달 효율 및 수율 일관성을 극대화하기 위해 마우스 MI 모델에서 modRNA 내심 내 주입을 제조하고 전달하는 최적화된 방법이 제시된다. 이 프로토콜은 modRNA 전달을 기본 및 번역 연구에 더 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

서문

유전자 치료는 인간 질환의 치료, 치료 또는 예방을 위한 핵산의 전달을 포함하는 강력한 도구입니다. 심장질환에 대한 진단 및 치료 접근법의 진행에도 불구하고 심근경색(MI) 및 심부전(HF)에서 유전자전달에 있어 성공이 제한적이다. 유전자 치료의 과정이 간단해 보이는 것처럼, 특정 전달 차량을 사용하기 전에 최적화해야 하는 많은 요인을 고려하면 현저하게 복잡한 접근법입니다. 올바른 전달 벡터는 인체 내부에서 비 면역원성, 효율적이고 안정적이어야 합니다. 이 분야의 노력은 바이러스 성 또는 비 바이러스성 이라는 두 가지 유형의 배달 시스템을 생성했습니다. 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노 관련 바이러스에 의한 유전자 전달을 포함한 널리 사용되는 바이러스 시스템은 뛰어난 전달 능력을 보여주었습니다. 그러나, 클리닉에서의 그들의 사용은 강한 면역 반응 유도^1,종양 발생^2의위험, 또는 중화 항체^3의존재로 인해 제한되며, 모두 인간 유전자 치료에서 바이러스 벡터의 광범위하고 효과적인 적용에 큰 장애물로 남아 있다. 한편, 이들의 인상적인 발현 패턴에도 불구하고, 벌거벗은 플라스미드 DNA의 전달은 낮은 형질 전달 효율을 표시하고, mRNA 전달은 RNase^4에의한 저하에 높은 면역원성과 감수성을 제시한다.

mRNA 의 분야에서 광범위한 연구와 함께, modRNA는 전통적인 벡터^5에비해 수많은 장점으로 인해 심장및 다양한 다른 장기에 유전자를 전달하는 매력적인 도구가되었다. 자연적으로 발생하는 의사 분비딘을 가진 uridine의 완전한 교체는 선천적인 면역 반응의 최소한의 유도와 게놈 통합^6의리스크로, 더 강력하고 일시적인 단백질 발현을 초래합니다. 최근에 확립된 프로토콜은 합성 mRNA^7의안정성과 전이를 증가시킴으로써 단백질 번역을 더욱 향상시키는 최적화된 양의 반대로 캡 아날로그(ARCA)를 사용한다.

이전 보고서는 MI 후 설치류 심근에서 modRNA에 의해 전달된 다양한 기자 또는 기능성 유전자의 발현을 보여주었다. modRNA 적용을 통해 심근세포와 비심근세포 모두를 포함한 심근증의 중요한 영역은 혈관신생^9,10,심장세포 생존 11, 및^,심근세포 증식(12)을¹²유도하기 위해 심장 후^{11손상(8)을} 성공적으로 전염시켰다. 돌연변이된 인간 폴리스테틴에 대한 인코딩된 modRNA의 단일 투여는 마우스 성인 CM의 증식을 유도하고 심장 기능을 크게 증가시키고 흉터 크기를 감소시키고 모세혈관 밀도를 증가시키고 MI¹²이후 4주 후에 도포밀도를 증가시킨다. 최근 연구는 돼지 모델^(10)에서VEGFA modRNA의 응용 프로그램과 MI 후 향상 된 심장 기능을보고했다.

따라서, 심장 분야에서 modRNA의 인기가 증가함에 따라, MI 이후 심장에 modRNA를 전달하기 위한 프로토콜을 개발하고 최적화하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜 및 비디오에 도시된 방법은 왼쪽 전방 내림차순 동맥(LAD)의 영구 결찰에 의해 마우스 MI의 표준 외과 적 절차를 시연하고, modRNA의 3개의 현장 내심 주사가 뒤따릅니다. 이 논문의 목적은 모RNA 적용이 심장 유전자 치료에 널리 접근할 수 있도록 뮤린 심오카르슘에 modRNA 전달의 매우 정확하고 재현 가능한 방법을 명확하게 정의하는 것입니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 동물 절차는 마운트 시나이 기관 관리 및 사용위원회에서 Icahn 의과 대학에 의해 승인되었습니다.

1. modRNA의 합성

참고 : modRNA 합성의 세부 사항은 콘드라트 외^13에서찾을 수 있습니다.

1. 플라스미드 템플릿(재료표)을주문하고 mRNA 템플릿으로 사용할 깨끗한 PCR 제품을 생성합니다.
2. 다음과 같은 맞춤형 리보뉴클레오시드블렌드(재료표):T7 전사 키트로 시험관내 전사에 의해 modRNAs를 준비, 6 mM 항역 캡 아날로그(ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75m 구아노신 삼호산염, 75m 아데노신 삼호산염, 75m 시티딘 삼호산염, 75m 시티딘 삼호산염, 100mMPseuin-5-thota
3. 전사 정화키트(재료 표)로1.2단계에서 만든 modRNA를 정화하고 남극 인산염으로 치료합니다. 다음으로, 전사 정리 키트로 modRNA를 재puriffy와 분광계를 사용하여 정량화한다.
4. 에탄올과 암모늄 아세테이트로 modRNA를 침전시키고 10m Tris-HCl 및 1mM EDTA에서 재중단한다.
5. 원심 필터에 의한 생체 내 전달을 위한 modRNA를 농축하고 자동 전기전도 플랫폼(재료표)을 사용하여 품질을측정한다.

2. 생체 내 전달을 위한 modRNA 주입 준비

1. modRNA 농도에 기초하여 루시파라이(Luc)/Cre modRNA 주입의 100 μg에 필요한 부피를 계산합니다.
2. 모드라의 계산된 부피를 뉴클레아제 자유수분(0.3g/mL) 및 0.1M 구산염 용액(pH =7)(각각 권장20μL)으로 제조된 자당 용액의 동일한 부분과 혼합한다.
3. 식염수 용액을 추가하여 주입의 최종 부피를 60 μL로 가져옵니다.

3. 심근 경색 수술

1. 동물의 마취 및 준비
   참고: 이 연구는 8-12 주 오래 된 남성과 여성 CFW 마우스를 사용 합니다.
   1. 유도 챔버를 사용하여 2 %의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 마취를 유지하기 위해 코와 입에 얼굴 마스크가있는 등쪽 위치에 동물을 배치합니다. 7-8mm 기도관과 필터가 장착된 호흡보호구를 사용하여 기계적 환기로 마취를 유지합니다.
   2. 수술 플랫폼에서 마우스를 고정하려면 수술 용 테이프로 팔다리를 고정하십시오. 목 부위와 흉곽의 왼쪽을 면도하고 70 % 에탄올과 포비도요오를 사용하여 소독하십시오. 소독 단계를 두 번 반복합니다. 반사 신경을 확인, 마취의 깊이를 평가하기 위해 꼬리와 뒷발을 꼬집는.
   3. 노르모더미아(37.5-38°C)에서 코어 체온을 지속적으로 모니터링하고 유지한다.
   4. 내외 삽관을 수행하여 개방된 기도를 유지합니다. 이렇게하려면 마우스를 복부 위치에 놓고 입이 실험자쪽으로 향하게 하고 혀를 부드럽게 꺼냅니다. 목의 각도를 조정하고 삽관 경로를 곧게 펴고 삽관 캐뉼라를 밀어 넣습니다.
   5. 동물이 숨을 쉴 수 없는 경우 기관 절제술을 수행할 수 있습니다. 현미경을 사용하여 기관을 설명하는 피부, 근육 및 조직을 격리하는 중간선을 따라 자궁 경부 절개를 수행하십시오. 기관체가 명확하게 볼 때, 작은 구멍을 만들고 미세 수술 집게를 사용하여 기관장의 두개골 부분을 잡고 혈전 아래 두 카트리지 반지 사이의 조직에 내트라큐어 튜브를 삽입합니다.
   6. 마우스의 흉부 움직임을 관찰하여 두 폐가 산소를 받고 있는지 확인합니다. 호흡속도(RR)는 분당 약 120회 호흡해야 하며, 17-18cm_H2O의피증 압력이 있어야 합니다.
2. 왼쪽 전방 내림차순 (LAD) 동맥 결찰
   1. LAD 결찰을 수행하려면 마우스를 조심스럽게 돌려 오른쪽에 누워 있습니다. 피부를 들어 올리고 3번째와 4번째 갈비뼈 사이에 왼쪽 흉부 절제술을 수행하고 조직과 근육을 조심스럽게 해부합니다. 출혈을 방지하기 위해 소작을 사용합니다.
   2. 흉부를 조심스럽게 열고 일단 열리면 날카로운 물체로 폐를 건드리지 않고 심장을 찾으십시오. 흉부 구멍을 열어 두고 심장의 명확한 전망을 가지고 절개에 re트랙터를 배치합니다. 이제 폐를 절개 가장자리로 이동하고 심장의 전방 표면에 액세스하기 위해 심장을 덮고있는 심근 낭의 일부를 제거합니다.
   3. 폐 동맥과 왼쪽 오리경 사이에 위치한 깊은 빛 빨간 혈관으로 볼 수있는 LAD를 신중하게 식별합니다. 7-0 실크 봉합사의 단일 봉합사로 LAD 근위를 리게이트합니다. 4번갈비뼈와 5번 갈비 사이에 가슴튜브(28G, 정맥 카테터)를 배치합니다.
   4. 층의 흉부 절개를 닫습니다. 6-0 실크 러닝 봉합사를 사용하여 갈비뼈를 조정하고 5-0 실크 러닝 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. 미래의 심초음파 측정을 위한 적절한 창을 남겨두십시오.
   5. 2mL 주사기를 사용하여 따뜻한 동위 원소용액(물 1L에 염화나트륨 9g)으로 흉소를 조심스럽게 배출합니다. 마우스를 뒷면에 놓습니다. 기관 절제술을 수행하는 경우, 내막 튜브를 꺼내 7-0 실크 봉합사를 사용하여 하나의 스티치로 기관 카트리지 링을 적응시다. 마우스에 얼굴 마스크를 놓고 5-0 실크 러닝 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.
   6. 회복 단계의 경우, 인공호흡기에서 삽관 캐뉼라를 분리하고 자발적인 호흡을 허용한다. 동물을 의식에 도달할 때까지 열램프 아래에 놓습니다. 완전히 깨어날 때까지 수술 후 동물을 방치하지 마십시오.
   7. 0.1 mg/kg 체중에서 buprenophine로 통증 치료를 관리, 12 시간 간격으로 다음 3 일 동안 피하 주입.

4. modRNA의 심장 전달

1. MI 다음에 인슐린 주사기(31G)를 이용하여 2.3단계에서 제조된 modRNA의 총 60μL을 전달한다.
   1. 개포 영역을 둘러싼 심장 근육의 세 가지 다른 부위에 modRNA의 20 μL을 주입하십시오 (결찰의 양쪽에 2 개, 정점에 하나). 가슴을 닫기 전에 LAD 직후 주사를 수행하십시오.
      참고: modRNA 주입 부위의 대표적인 이미지는 도 1에서볼 수 있다.

5. 심장 포스트 MI에서 단백질 발현 유효성 검사

1. 생체 발광 이미징 시스템을 사용하여 Luciferase modRNA 발현
   참고: 자당 구연산 버퍼의 60 μL에서 제조된 Luc mRNA의 총 100 μg는 MI 후 CFW 마우스의 심장에 직접 주입된다.
   1. 에서 24 시간 포스트 MI 및 modRNA 주입, 인유도 챔버를 사용하여 2 % 이소플루란으로 마우스를 마취하고 인과 회류 루시페린 (150 mg/g 체중)를 주입하여 생체 내에서 Luc 신호를 검증합니다.
   2. Luc 신호가 포화상태에 도달할 때까지 매 2분마다 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 마우스를 이미지합니다.
   3. 이미징 분석 소프트웨어로 수집된 이미징 데이터를 정량화합니다. 식염수로 주입된 마우스를 Luc 발현의 기준선 판독값으로만 사용하고 식염수 주입 마우스로부터 수집된 배경 신호를 뺍니다.
      참고 : Luc 신호는 p / s / cm²/ sr x 10^6으로표현됩니다.
2. Cre 형질 검사용 면역 염색
   1. Cre로 의 전염을 검증하기 위해, 100 mg/kg 케타민과 10 mg/kg 자일라진의 관복 주사를 사용하여 동물을 24 시간 후사 후 희생하고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다. 절개를하기 전에 70 %의 알코올 면봉을 사용하여 가슴과 복부를 소독하십시오.
   2. 흉골보다 1cm 낮은 횡절개를 하여 흉부 구멍을 열고 가위를 머리쪽으로 이동시켜 흉곽을 통과합니다.
   3. 가슴을 열고 과도한 혈액을 제거하기 위해 오른쪽 심실 챔버에 멸균 PBS 1 mL을 주입하십시오. 즉시 심장을 절제하고 남은 혈액을 씻어 멸균 PBS에 배치합니다.
   4. 심장을 24시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 수정한 다음, 4°C에서 30% 자당 용액으로 하룻밤 배양을 한다. 다음 날 심장을 최적의 절삭 온도 매체에 포함시키고 극저온을 사용하여 10 μm 두께로 하트를 다실시합니다.
   5. 심장 트로포닌 I (cTNI)에 대한 기본 항체와 섹션을 얼룩과 형광 이차 항체로 라벨. 핵을 식별하기 위해, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 5 분 동안 얼룩. 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지.

6. 통계 분석

1. 식염수 및 Luc 주입 마우스에서 Luc 발현을 기반으로 막대 그래프를 플롯하고 값을 평균 ± SEM으로 보고합니다.

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결과

8주에서 10주 된 마우스는 이소플루란으로 마취되고 삽관하였다. 동물이 마취 하에 있던 후에, 좌흉 부소 지역은 에탄올로 면도하고 살균하고, 심혼은 LAD 결찰을 위해 드러나게 했습니다. 왼쪽 관상 동맥은 동맥 아래 봉합사를 단단히 매듭시킴으로써 가려졌다(다이어그램 표현 도 1A). 성공적인 경색 후 (좌심실 자유 벽의 마비에 의해 표시), 자당 구연산 완충액에 용해 된 루?...

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토론

유전자 치료는 심장 질환의 치료를 크게 발전시킬 수 있는 엄청난 잠재력을 보여주었습니다. 그러나, HF의 치료를 위한 초기 임상 시험에 채택 된 전통적인 도구는 제한된 성공을 보이고 심각한 부작용과 관련되어 있다. 변형된 RNA는 심장에서 유전자 전달 도구로 지속적으로 인기를 얻고 있는 비바이러스 유전자 전달을 제시한다. ModRNA는 번역을 위한 유전자의 핵 현지화를 요구하지 않으며, 따라?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G	TriLink Biotechnologies	N-7003
Bioluminescense imaging system	Perkin Elmer	124262	IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors	FST	18200-09
Cardiac tropnin I	Abcam	47003
Cytidine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System	Harvard Apparatus	75-2001
Forceps- Adson	FST	91106-12
Forceps- Dumont #7	FST	91197-00
Guanosine triphosphate	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
In vitro transcription kit	Invitrogen	AMB13345	5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula	Harvard Apparatus
Megaclear kit	Life Technologies
Mouse ventilator	Harvard Apparatus	73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate	TriLink Biotechnologies	N-1081
NanoDrop Spectrometer	Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors	FST	12002-12
Plasmid templates	GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	FST	14200-12
Stereomicroscope	Zeiss
Sutures	Ethicon	Y433H	5.00
Sutures	Ethicon	Y432H	6.00
Sutures	Ethicon	7733G	7.00
T7 DNase enzyme	Invitrogen	AMB13345	Included in Megascript kit
Tape station	Aligent	4200
Transcription clean up kit	Invitrogen	AM1908	Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k	Amicon	UFC801096