نموذج مناعي لزرع خلايا القلب الهيترولوجي وخلايا عضلة القلب في الفئران

Summary

نحن نصف نموذجًا لزراعة قلب البطن غير المعوثي في الفئران ، مما يعني تعديلات على الاستراتيجيات الحالية ، مما يؤدي إلى نهج جراحي مبسط. بالإضافة إلى ذلك، نحن نصف نموذج الرفض الجديد عن طريق الحقن داخل الأذن لخلايا عضلة القلب الحيوية، مما يسمح بإجراء المزيد من التحليلات المناعية لعملية زرع في الفئران.

Abstract

كانت زراعة القلب الهيتروبية في الفئران نموذجًا شائعالاستخدام للدراسات المناعية المتنوعة لأكثر من 50 عامًا. وقد أُبلغ عن عدة تعديلات منذ الوصف الأول في عام 1964. بعد 30 عامًا من إجراء زراعة القلب الغيرية في الفئران ، طورنا نهجًا جراحيًا مبسطًا ، والذي يمكن تعليمه وإجراؤه بسهولة دون مزيد من التدريب الجراحي أو الخلفية.

After dissection of the ascending aorta and the pulmonary artery and ligation of superior and inferior caval and pulmonary veins, the donor heart is harvested and subsequently perfused with ice-cold saline solution supplemented with heparin. بعد لقط وتقنين الأوعية البطن المتلقية، المتبرع يصعد الشريان الأورطا والشريان الرئوي هي anastomosed إلى الشريان الأورطا البطن المتلقي والوريد الوريد افينا السفلي، على التوالي، وذلك باستخدام غرز الجري المستمر.

اعتمادا على مجموعات مختلفة بين المانحين والمتلقي، يسمح هذا النموذج بتحليل الرفض الحاد أو المزمن للالوجرافات. ومما يعزز الأهمية المناعية لهذا النموذج من خلال نهج جديد من حقن داخل الأذن من خلايا عضلة القلب الحيوية والتحليل اللاحق لاستنزاف الأنسجة اللمفاوية عنق الرحم.

Introduction

زرع القلب الهيتروتوبي هو نموذج تجريبي يستخدم بشكل متكرر للتحقيقات المختلفة المتعلقة بتحمل زراعة الأعضاء ، ورفض allograft الحاد والمزمن ، وإصابة نقص التروية وإعادة التروية ، وتضخم الآلة أو إعادة عرض القلب. من بين مزايا أخرى ، يمكن مراقبة وظيفة الكسب غير المشروع بشكل غير جراحي عن طريق الجس والفشل في الكسب غير المشروع لا يؤدي إلى ضعف حيوي للمتلقي على النقيض من الأعضاء الأخرى ، مثل الكلى أو الكبد.

في عام 1964، وصف أبوت وآخرون في البداية زرع قلب البطن التغايري في الفئران¹. في وقت لاحق، في عام 1966، وصفت تقنية من طرف إلى طرف لanastomoses من قبل توميتا وآخرون^2. تم الإبلاغ عن الأساس للنموذج المستخدم حاليا من قبل اونو وليندسي في عام 1969³. خلال العقود الماضية، تم نشر العديد من التعديلات لإنشاء أنواع مختلفة من الطعوم القلب البطيني تفريغ، محملة جزئيا أو محملة بما في ذلك الجمع بين غير النوبة زرع القلب والرئة^4،5،6. بالنسبة للتحليلات المناعية، يتم إجراء زراعة ترقيع القلب غير المحملة بالحجم الأكثر شيوعًا. في هذه الحالة، تدفق الدم يدخل إلى الوراء الشريان الأورطا الصاعد المانحة وبالتالي الشرايين التاجية. يحدث الصرف الوريدي على طول الجيوب الأنفية التاجية في الأذين الأيمن والبطين(الشكل 1A-B). لذلك ، يتم استبعاد البطين الأيسر من تدفق الدم ، بصرف النظر عن الكميات الهامشية من الدم من الأوردة البسية. وهذا أيضا يجعل من نموذج مفيد لدراسة الآليات الفيزيولوجية المرضية خلال البطين الأيسر مساعدة الجهاز العلاج⁷.

وقد أجريت زراعة القلب الهيتروبية في أنواع مختلفة بما في ذلك الفئران والأرانب والخنازير وحتى تم استخدامها كجهاز مساعدة أحادي أو ثنائي في البشر^8,9,10,11. لا يزال الجرذ يمثل الحيوان التجريبي الشعبي لنماذج زراعة الأعضاء ، خاصة وأن أوقات البقاء على قيد الحياة للكسب غير المشروع لتركيبات سلالات الفئران المختلفة كانت محددة بشكل جيد في الماضي وعدد كبير من الكواشف المناعية يمكن الوصول إليها^12،13. على عكس الفئران ، الفئران هي أكبر مما يجعل الجراحة والوصول إلى الأنسجة اللمفاوية للتحليلات المناعية أكثر جدوى^12. وعلاوة على ذلك، فإن إدخال تكنولوجيات الاستنساخ التجاري في الفئران في السنوات الأخيرة سيؤدي على الأرجح إلى الاهتمام المتكرر بنماذج الفئران التجريبية^14.

بشكل عام ، يمكن توصيل طعوم القلب الغيرية بالأوعية المتلقية إما عن طريق إجراء انستوموز عنق الرحم أو البطن. ومع ذلك، تشير بعض الدراسات إلى أن الأناستوموسيس الفخذي يسهل تحسين الرصد بسبب الوصول الأفضل للملامسة اليدوية أو تخطيط صدى القلب وإعادة النظر في الصدى، وبالتالي يسمح بالكشف بشكل أكثر دقة عن فشل الكسب غير المشروع^15،16.

وقد ثبت أنه لا يوجد فرق فيما يتعلق بوقت العملية ومعدل المضاعفات والنتيجة ووقت البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع بين كل من تقنيات anastomosis^17. ومن الواضح أن توافر عدد كاف من الغدد الليمفاوية المستنزفة يجب أن يذكر كفائدة من الانسطوموسات العنقية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى فترات تدريب أطول. في المقابل ، فإن أنسح البطن أقل تعقيدًا وقيمة بنفس القدر للتحقيقات المناعية ، خاصة عندما يقترن بنتائج طريقة جديدة لحقن خلايا عضلة القلب المتعددة الألياف واستئصال الغدد الليمفاوية اللاحقة في عنق الرحم. مزيج من كلا النموذجين يقدم مجموعة واسعة من التحليلات المناعية بعد التدخل.

البروتوكول التالي يشير إلى التشغيل في أزواج من الجراحين من أجل تقليل وقت نقص التروية. ومع ذلك، يمكن إجراء جميع التجارب من قبل شخص واحد. يتم عرض إعداد الأدوات والمواد لزراعة القلب وزرع في الشكل 2A-B.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس المحلي لاستعراض الحيوانات الأخلاقية التابع للسلطات الإقليمية لحماية المستهلك وسلامة الأغذية في ساكسونيا السفلى (LAVES، أولدنبورغ، ألمانيا) بالموافقة على الـ IDs 12/0768 و 17/2472.

1. القلب explantation والتسريب

ملاحظة: كما المتبرعين الكسب غير المشروع، تم استخدام الفئران الإناث أو الذكور في سن 7-22 أسابيع.

1. قم بإضفاء التّزّرعلى الجرذ انثّيب التّرّجّر باستنشاق الإيزوفران (الحث بنسبة 5% والصيانة بنسبة 3% مع تدفق O₂ من 1 لتر/دقيقة). حقن 5 ملغ من Carprofen تحت الجلد لكل كيلوغرام من وزن الجسم للمسكن اتى الجراحة والتحقق من عدم وجود إصبع القدم قرصة سحب منعكس.
2. تطبيق زيوت التشحيم العين وإزالة الفراء البطن والصدر باستخدام مقص الميكانيكية.
3. ضع المتبرع في وضع ية، وأصلح الأطراف في قاعدة طاولة العملية بأربطة مرنة وتعقيم الجلد بالإيثانول بنسبة 70% أو بديل كاف ٍ آخر.
4. تُقسّس الجلد في اتجاه طولي وبعد تطبيق مخدر موضعي (على سبيل المثال، الليدوكائين 0.2%) إجراء عملية التنظير الوسيط باستخدام مقص.
5. إدراج المنقات، وتعبئة الأمعاء إلى يسار المتبرع، وفضح الوريد الوريد السفلي مع مسحات القطن المعقم.
6. لتخثر, حقن 500 وحدة دولية من الهيبارين حل في 1 مل من الجليد الباردة حل الخط اللاي متساوي التوتر عن طريق الوريد عن طريق ثقب الوريد الوريد الوريد السفلي فينا. وقف النزيف في موقع ثقب عن طريق ضغط الضوء مع مسحة القطن بعد التراجع عن الإبرة(الشكل 3A).
7. يُقنع الحجاب الحاجز ويُجري استئصال الصدر الجانبي على جانبي المتبرع.
8. دبوس الجدار البطني المعبأة من الصدر على طاولة العملية.
9. إزالة التاموروكارديوم والعصب المبهم عن طريق إعداد صريح باستخدام اثنين من أصحاب إبرة صغيرة.
10. إجراء استئصال الأوعية البطنية من أجل exsanguinate المتبرع وتفريغ القلب.
11. إدراج فرع صريح من مقص مدببة التحقيق في الجيوب الأنفية عبر الأقراص ويفصل الشريان الأورطا التصاعدي والشريان الرئوي كما distal ممكن تحت الجر السمرة الخفيفة للقلب مع ضغط الرطب(الشكل 3B).
12. Place a single 5-0 ligature around the superior and inferior vena cava and the pulmonary veins and tighten it as dorsal as possible (Figure 3C).
13. قطع الأنسجة الظهرية إلى الرباط واستخراج القلب(الشكل 3D).
14. perfuse القلب مبشور مع قنية 18 G من القسطرة الوريدية من خلال الشريان الأورطي التصاعدي والشريان الرئوي مع 30 مل من الجليد الباردة، حل محلول محلول الأيزون اتلاني تكملها 1000 وحدة دولية من الهيبارين ووضع القلب في أنبوب 15 مل مليئة محلول المالحة على الجليد(الشكل 3E-F).

2. زرع القلب

ملاحظة: كمستلمين، تم استخدام الفئران الأنثوية أو الذكور القديمة من 10-14 أسبوعًا. وكان وزن المانحين والمتلقين تقريبا.

1. إجراء التخدير من الفئران المتلقي باستخدام استنشاق الايفلوران أيضا (التعريفي في 5٪ والصيانة في 1.5-2٪ مع تدفق O₂ من 1 لتر / دقيقة). حقن 5 ملغ من Carprofen تحت الجلد لكل كيلوغرام من وزن الجسم للمسكن اتى الجراحة والتحقق من عدم وجود إصبع القدم قرصة سحب منعكس.
2. تطبيق زيوت التشحيم العين، وإزالة الفراء في البطن، وإصلاح الأطراف وتعقيم الجلد على نحو مماثل لإعداد المانحة. للحصول على النتيجة المثلى بعد الجراحة، قم بإجراء العملية على حصيرة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم داخل العملية.
3. بعد الشق الطولي للجلد، ضعي مخدرًا موضعيًا، مثل الليدوكائين (0.2%)، على اللفافة البطنية. فتح تجويف البطن عن طريق عملية اللاباتورات الوسطى وإدراج المنقات.
4. تعبئة الأمعاء إلى الجانب الأيسر العلوي من المتلقي ووضعها في ضغط دافئ ومبلل.
5. بعد تعبئة الاثني عشر وjejunum القريبة ، على التوالي ، وذلك باستخدام المجهر الجراحي (أو النظارات المكبرة) مع التكبير 5-7x ، وفضح الأبهر البطني والوريد السفلي عن طريق إعداد صريح مع مسحات القطن. لا تفصل الأوعية البطنية.
6. رفع الأوعية البطن باستخدام اثنين من أصحاب إبرة صغيرة دون إصابة الأوردة القطنية ووضع المشبك كولى الأوعية الدموية(الشكل 4A).
7. ثقب الأوعية البطنية مع 30-45 درجة مقوسة 27 غ قنية(الشكل 4B).
8. تكبير موقع ثقب باستخدام مقص بوتس لإنشاء شق طولي يطابق حجم تجويف الأوعية المانحة(الشكل 4C-D)وperfuse الأوعية المتلقية مع محلول المالحة من أجل إزالة الجلطات ومنع تجلط الدم بعد العملية الجراحية.
9. وضع الكسب غير المشروع في الجلوس ومثبت المانح يصعد أورتا إلى أورتا البطن المتلقي من قبل اثنين من غرز بسيطة توقف (8-0 monofilament غير resorbable خياطة) في الزاوية القحفية وcaudal من شق طولي(الشكل 4E).
10. Anastomose أورتا الصاعد للمتبرع مع أبهر البطن من المتلقي عن طريق تشغيل 8-0 خيوط monofilament في خطوتين: أولا، وضع الكسب غير المشروع على يمين الأوعية المتلقية وأداء النصف الأول من anastomosis(الشكل 4E). في وقت لاحق ، ضع الكسب غير المشروع على يسار الأوعية المتلقية وقم بالنصف الثاني من الانستوموس(الشكل 4F).
11. تثبيت الشريان الرئوي المتبرع إلى الوريد الوريد البطني السفلي على نحو مماثل لanastomosis الشريان الأبهري (8-0 monofilament غير resorbable خياطة). خياطة النصف الأول من الانستوموموسيس ووينوس من الجانب intraluminal من السفينة(الشكل 4G-H).
12. تدفق anastomoses مع المالحة مباشرة قبل تشديد عقدة لمنع الانسداد المحيطي.
13. وضع شاش hemostatic حول كل من anastomoses والإفراج بعناية المشبك كولى الأوعية الدموية بحيث يمكن أن تبدأ reperfusion من الكسب غير المشروع. التعامل مع نزيف على طول anastomoses عن طريق ضغط الضوء مع مسحات القطن المعقم.
    ملاحظة: يجب أن يبدأ الكسب غير المشروع في الضرب بعد حوالي 60 s.
14. استبدال الأمعاء في meander مثل الموضة. تأكد من عدم وجود سوء دوران للأشعة الميستيرية لمنع نخر الأمعاء أو الانسداد الميكانيكي.
15. أغلق عضلات البطن/اللفافة والجلد بشكل منفصل باستخدام خيوط الجري المستمرة 3-0.

3. الرعاية بعد الجراحة

1. للمسكن بعد الجراحة، قم بتزويد المتلقين بحقنة إضافية تحت الجلد من 5 ملغ من كاربروفين لكل كيلوغرام من وزن الجسم في أول يوم بعد الجراحة (POD). بالإضافة إلى ذلك، إضافة 1 غرام من Metamizol إلى 500 مل من مياه الشرب حتى POD الثالث.
2. ابدأ في مراقبة وظيفة ترقيع القلب عن طريق ملامسة البطن اليومية على POD الثالث.
   ملاحظة: في حالة فشل الكسب غير المشروع قبل POD الثالث، يجب النظر في فشل جراحي بدلاً من فشل مناعي. ومع ذلك ، فإن هذا بالطبع يعتمد على مجموعة السلالة المختارة والنموذج المناعي لكل منهما (على سبيل المثال ، الرفض الحاد بعد التمنيع السابق).
3. بعد رفض الكسب غير المشروع ، واستخراج الأنسجة مثل استنزاف العقد الليمفاوية الرجعية الجمجمة من anastomoses ، الطحال ، الدم ، الغدة الصعترية والكسب غير المشروع لمزيد من التحليلات المناعية عن طريق قياس خلايا التدفق أو الكيمياء المناعية.

4. الهضم الأنزيمي للقلب والحقن تحت الجلد لخلايا القلب في الأذن

1. إجراء زراعة القلب والتسريب على نحو مماثل لزراعة القلب الغيرتوب (انظر الخطوة 1).
2. أجاد القلب في كتل 3 مم × 3 مم باستخدام مشرط معقم أو مقص معقم واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في وسط الثقافة الذي يحتوي على 0.5 ملغم/مل كولاجانز.
   ملاحظة: من المهم استخدام الثقافة المتوسطة التي تحتوي على البنسلين والعقدتوميسين والغلوتامين دون مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) خاصة وأن FCS يمنع هضم الكولاجين.
3. إضافة الأنسجة المهضومة إلى منخل كبير pored، في حين إزالة المتوسطة الثقافة والمفروم تماما للحصول على تعليق خلايا عضلة القلب الحيوية، ومعظمهم من خلايا القلب الواحدة الميتة وخلايا الدم المتبقية. اغسل تعليق الخلية مرتين بمحلول محلول ملاهوي معقم.
   ملاحظة: إعدادات الطرد المركزي: 10 دقيقة، 200 × ز، 20 درجة مئوية
4. تصفية التعليق باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وجمع التكوينات الخلية الحيوية عن طريق مسح مصفاة الخلية مع 5-10 مل من محلول محلول محلول ملاهوتوني.
5. After centrifugation, resuspend the cardiac muscle cells in saline solution dissolved at a concentration of 5x10⁵ cells/mL and draw the cell solution up into a 1 mL syringe.
6. إجراء التخدير على نحو مماثل للبروتوكول الموصوف للنارخة المتلقي (انظر الخطوة 2) لزراعة القلب غير المتجانسة.
7. ضع المستلم في وضع جانبي وأصلح الأذن بإصبع باستخدام شريط مزدوج الجانب(الشكل 5A).
8. حقن 20 ميكرولتر من محلول خلايا عضلة القلب (الذي يحتوي على 1 × 10⁴ خلايا) عبر 27 G قنية s.c. بالقرب من الأوعية الشعرية البصرية في أذن المتلقي(الشكل 5B).
9. بعد فترة مراقبة محددة (اعتمادًا على تركيبة السلالة المختارة وقوة الرفض) ، استخرج الغدد الليمفاوية العنقية المنستنزفة وإجراء المزيد من التحليلات مثل قياس التدفق الخلوي أو الثقافات المشتركة(الشكل 5C).
   ملاحظة: وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تحليل النسيجي للpinna لتحديد تسلل الخلايا.

النتائج

في الماضي ، تم معالجة القضايا المناعية المختلفة على أساس النموذج ، الذي تم التحقق من صحته في مجموعة العمل بأكثر من 500 عملية زرع بنسبة بقاء تزيد عن 95٪^13،18،^{19,،20،21،22}

Discussion

تعتمد الطريقة الموصوفة سابقًا لزراعة القلب الغيرتوب في الفئران بشكل رئيسي على وصف Ono و Lindsey في عام 1969^3. ومنذ ذلك الحين، أدخلت عدة تعديلات على أنواع مختلفة مما أدى إلى تنوع واسع في هذا النموذج. الجمع بين العديد من هذه التعديلات وإدخال تجربتنا الخاصة الناتجة عن أكثر من 30 عاما من إ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R