מודל אימונוולוגי עבור הלב הטרוולפית ושריר הלב השתלת תא בחולדות

Summary

אנו מתארים מודל של הטרוהנושא השתלת לב הבטן בחולדות, רומז שינויים של אסטרטגיות נוכחיות, אשר להוביל גישה כירורגית פשוטה. בנוסף, אנו מתארים מודל דחייה הרומן על-ידי הזרקה באוזן של תאים חיוניים שרירי הלב, המאפשר ניתוח נוסף השתלת אימונולוגיים בחולדות.

Abstract

הטרוטופית לב השתלת חולדות כבר מודל נפוץ למחקרים אימונולוגיים שונים עבור יותר מ 50 שנים. מספר שינויים דווחו מאז התיאור הראשון ב 1964. לאחר 30 שנים של ביצוע הטרולפית לב השתלת חולדות, פיתחנו גישה כירורגית פשוטה, אשר ניתן ללמד בקלות ולבצע ללא הכשרה כירורגית נוספת או רקע.

לאחר הניתוח של העורקים העולה ואת עורק הריאות והארכה של זה מעולה ונחותים ורידים ריאתי, הלב התורם הוא נקצרו ולאחר מכן מושם עם תמיסת מלח קר מלוחים בתוספת הפארין. לאחר הלקריש ולצמצם את כלי הבטן של המטופל, התורם עולה העורקים הריאתי ואת עורק הריאות הם מאוהים לאבי העורקים הבטן המטופל והבנה לבנה הנחותה, בהתאמה, באמצעות תפרים ריצה רציפה.

בהתאם שילובים שונים של הנמען התורם, מודל זה מאפשר ניתוח של דחייה חריפה או כרונית של allografts. המשמעות החיסונית של מודל זה משופרת עוד על ידי גישה הרומן של הזרקה באוזן של תאים חיוניים שריר הלב וניתוח הבאים של ניקוז רקמת הלימפה צוואר הרחם.

Introduction

הטרוטופית לב השתלת הוא מודל ניסיוני נפוץ לחקירות שונות לגבי סובלנות השתלת, דחייה כרונית השתלת, reperfusion פציעה, מחשב זלוף או לב שיפוץ. בין היתר, ניתן לנטר את תפקוד השתל באופן בלתי פולשני על ידי מישוש וכישלון השתל אינו מוביל לפגיעה חיונית של המטופל בניגוד לאיברים אחרים, כגון כליות או כבדים.

ב 1964, אבוט ואח ' תיאר בתחילה הטרוסקסואלים השתלת לב הבטן בחולדות¹. מאוחר יותר, ב-1966, הטכניקה הסופית של האנסטוסים תוארה על ידי Tomita et al^.2. היסודות עבור הדגם המשמש כיום דווחו על ידי אונו ולינדזי ב 1969³. במהלך העשורים האחרונים, מספר שינויים פורסמו כדי ליצור סוגים שונים של פרוק, טעון באופן חלקי או טעון שמאלי חדרית הלב המוח⁴כולל הטרוסקסואלים^{משולב לב הטרולפית 4,5,6}. עבור מנתח אימונולוגיים השתלת שתל הלב שאינו טעון באמצעי האחסון מבוצע בדרך כלל. במקרה זה, זרימת הדם נכנסת למצב של התורם בעלייה העורקים ולאחר מכן את העורקים הכליליים. ניקוז הורידים מתרחש לאורך הסינוס הכלילי לתוך האטריום הימני והחדר (איור 1A-B). לפיכך, החדר השמאלי אינו נכלל בזרימת הדם, מלבד כמויות שוליים של דם מתוך ורידים של טסיאן. זה גם עושה את זה מודל שימושי עבור לימוד מנגנונים pathפיזילוגיים במהלך שמאל חדרית לסייע לטיפול במכשיר⁷.

השתלת לב הטרולפית בוצעה במינים שונים, כולל עכברים, ארנבים, חזירים והוא אפילו שימש מכשיר סיוע חד או בדיוני בבני אדם^8,9,10,11. החולדה עדיין מייצגת בעל חיים ניסיוני פופולרי עבור דגמי השתלה, במיוחד מאז זמני ההישרדות של השתל עבור שילובים שונים של מאמץ חולדה הוגדרו היטב בעבר ומספר רב של ריאגנטים אימונולוגיים נגישים^12,13. בניגוד לעכברים, חולדות גדולות יותר לעשות ניתוח וגישה לרקמת הלימפה לניתוח אימונולוגיים יותר¹². יתר על כן, המבוא של טכנולוגיות שיבוט מסחרי בחולדות בשנים האחרונות יהיה כנראה להוביל לעניין חוזר במודלים חולדה ניסיוני¹⁴.

באופן כללי, הטרולנושא שתלי לב יכול להיות מחובר כלי המטופל או על ידי ביצוע ההשקה צוואר הרחם או הבטן. עם זאת, מספר מחקרים מראים כי השקה הירך מקלה על ניטור משופר עקב גישה טובה יותר עבור מישוש ידני או העברה הירך ובכך מאפשר זיהוי מדויק יותר של כשל השתל^15,16.

הוכח כי אין הבדל לגבי זמן פעולה, שיעור סיבוך, התוצאה ואת זמן הישרדות השתל בין שתי טכניקות ההשקה¹⁷. ברור, הזמינות של מספר מספיק של בלוטות הלימפה ניקוז חייב להיות מוזכר כיתרון של ההשקה הצווארי; עם זאת, יש צורך בתקופות אימונים ארוכות יותר. לעומת זאת, החיבור הבטן הוא פחות מסובך וחשוב באותה מידה עבור חקירות אימונולוגיים, במיוחד כאשר בשילוב עם תוצאות מתוך שיטה הרומן של הזרקה באוזן של תאי שריר הלב allogenic וlymphadenectomy צוואר הרחם העוקבים. שילוב של שני הדגמים מציע ספקטרום רחב של ניתוחים אימונולוגיים שלאחר התערבותית.

הפרוטוקול הבא מתייחס לפעול בזוגות של מנתחים כדי להפחית את הזמן של איסכמיה. עם זאת, ניתן לבצע את כל הניסויים על ידי אדם אחד. הכיוונון של כלים וחומרים להסבר לב והשרשה מוצג באיור 2A-B.

Protocol

כל החוויות בעלי החיים בוצעו על פי ההנחיות של הוועדה המקומית לסקירת בעלי חיים של הרשויות האזוריות להגנת הצרכן ובטיחות המזון של סקסוניה התחתונה (LAVES, אולנבורג, גרמניה) עם מזהי אישור 12/0768 ו 17/2472.

1. הסבר לב ופרזיה

הערה: כאשר השתל תורמים, נשים או חולדות גברים בגיל של 7-22 שבועות שימשו.

1. השתיל את עכברוש התורמים על ידי אינהלציה של השאיפה (האינדוקציה ב-5% ואחזקה ב -3% עם זרימה או₂ של 1 ל'/דקה). להזריק 5 מ"ג של Carprofen תת-עורי לכל ק ג של משקל הגוף עבור כאבים הפריביות ולבדוק את העדר של הבוהן קמצוץ נסיגה רפלקס.
2. החלת סיכה העין ולהסיר את הבטן ואת הפרווה החזה באמצעות קוצץ מכני.
3. מניחים את התורם בתנוחה פרקדן, לתקן את האיברים בבסיס של הטבלה פעולה עם להקות אלסטיים ולעקר את העור עם 70% אתנול או אחרת מספיק חלופה.
4. מעבר העור בכיוון האורך ולאחר יישום של הרדמה מקומית (למשל, לידוקאין 0.2%) בצע כריתת אונה חציון באמצעות מספריים.
5. הכנס מחדש, להניע את המעי משמאל לתורם, ולחשוף את המוטה הנחותים עם מטליות כותנה מעוקר.
6. לצורך אנטיקרישה, הכנס 500 I.U. של הפארין מומס 1 מ ל של הקרח קר איזוטוניק תמיסת מלוחים באופן פנימי על ידי שתיל את הווריד הנחותים. הפסיקו את הדימום באתר הניקוב באמצעות דחיסת אור בעזרת ספוגית כותנה לאחר הנסיגה של המחט (איור 3א).
7. מעבר לסרעפת ומבצע כריתת. אונה צדדית לשני צידי התורם
8. הצמד את הקיר הגלוח של החזה אל שולחן המבצעים.
9. הסירו את קרום הלב ואת העצב התועה על ידי הכנה קהה באמצעות שני מחזיקי מיקרו-מחט.
10. בצעו חתך של כלי הבטן כדי לדימום את התורם ולפרוק את הלב.
11. הכנס את הענף הקהה של מספריים בדיקה הצביע לתוך הסינוס של הדלקת קרום הלב והפרד את העורקים העולה ואת עורק הריאתי ככל האפשר תחת המתיחה הקלה caudal של הלב עם לדחוס (איור 3ב).
12. מניחים ליגטורה יחידה 5-0 סביב המטה העליון והמטה-קאווה הנחותים והורידים הריאתי והדקו אותו באותה הדרך ככל האפשר (איור 3ג).
13. לנתק את הרקמה מהראש לקשירה ולחלץ את הלב (איור 3ד).
14. מבשם לב ההסבר בצינורית של 18 גר' מקטטר ורידי דרך העורקים העולה ועורק הריאות עם 30 מ ל של קרח קר, תמיסת מלוחים איזוטון בתוספת 1000 I.U. של הפארין ומניחים את הלב בצינור 15 מ"ל מלא בתמיסת מלח על הקרח (איור 3E-F).

2. השתלת לב

הערה: כנמענים, שימשו בשנת 10-14 שבועות עכברושים של נשים או גברים. תורמים ומטופלים היו בעלי משקל כלשהו.

1. לבצע הרדמה של עכברוש המטופל על ידי שימוש גם באינהלציה isofלאנה (אינדוקציה 5% ותחזוקה ב 1.5-2% עם זרימה O₂ של 1 L/min). להזריק 5 מ"ג של Carprofen תת-עורי לכל ק ג של משקל הגוף עבור כאבים הפריביות ולבדוק את העדר של הבוהן צביטה לנסיגה רפלקס.
2. החלת סיכה העין, להסיר את פרוות הבטן, לתקן את הגפיים ולעקר את העור באופן שולי לקראת הכנת התורם. לתוצאת הניתוח האופטימלי, בצע את הפעולה על מחצלת חימום כדי למנוע היפותרמיה בין-מבצעיות.
3. לאחר חתך האורך של העור, להחיל הרדמה מקומית, כגון לידוקאין (0.2%), על fascia הבטן. פתח את חלל הבטן על ידי להפרוטומיה החציוני והכנס מחדש.
4. הגבר את המעי לצדו השמאלי העליון של המטופל והניחו אותו בדחיסה חמה ומועלת.
5. לאחר הגיוס התריסריון והאבוג'נום הבית, בהתאמה, באמצעות מיקרוסקופ כירורגי (או משקפיים מגדלת) עם הגדלה של 5-7x, לחשוף את העורקים הבטני ואת האובלה הנחותים על ידי הכנה קהה עם מטליות כותנה. אין להפריד את כלי הבטן.
6. העלה את כלי הבטן באמצעות שני מחזיקי מחט מיקרו מבלי לפגוע בורידים המותני ולמקם את המלחציים קולי וסקולרית (איור 4א).
7. נקב בכלי הבטן בעזרת צינורית מקומרת ב30-45 מעלות 27 גר' (איור 4ב').
8. להגדיל את האתר ניקוב באמצעות מספריים פוטס כדי ליצור חתך האורך המתאים לגודל של לומן כלי התורם (איור 4C-D) ומבשם כלי הנמען עם פתרון מלוחים כדי להסיר קרישי דם ולמנוע פקקת פוסט-אופרטיבית.
9. הניחו את השתל בתוך הסיטוס והפכו את התורם לעולה לאבי העורקים הבטני של המטופל על ידי שני תפרים מופרשים פשוטים (8-0 תפר מונופינט שאינו נספג בתפרים) בפינת הגולגולת והקודל של חתך האורך (איור 4E).
10. Anastomose העולה על אבי העורקים של התורם עם העורקים הבטני של המטופל על ידי ריצה 8-0 תפר מונופינט בשני צעדים: ראשית, הצב את השתל מימין לכלי הקיבול ובצע את המחצית הראשונה של ההשקה (איור 4E). לאחר מכן, הצב את השתל משמאל לכלי הקיבול ובצע את המחצית השניה של ההשקה (איור 4F).
11. העתק את עורק הריאות של התורם לaortal הורד הנחותים לחיבור החיבור (8-0 תפר מונופינט לא נספג. תפר את המחצית הראשונה של החיבור הורידים מהצד intraluminal של הכלי (איור 4G-H).
12. ריקון האנסטוסים עם תמיסת מלח ישירות לפני הידוק הקשרים כדי למנוע תסחיף היקפי.
13. מניחים גזה הומוסטטי סביב שני anaoses ולשחרר בזהירות את המלחציים קולי כלי הדם כך reperfusion של השתל יכול להתחיל. טיפול בדימום לאורך האנסטוסים על ידי דחיסת אור עם מטליות כותנה מעוקר.
    הערה: השתל צריך להתחיל לפעום אחרי סביב 60 s.
14. להחליף את המעי בצורה כמו אופנה. יש לוודא כי אין סיבובים של בסיס מצע כדי למנוע נמק מעיים או חסימה מכנית.
15. לסגור את שרירי הבטן/fascia ואת העור בנפרד באמצעות רציף 3-0 פוליפילמנט פועל התפר.

3. טיפול פוסט-פעיל

1. עבור כאבים בניתוח, לספק את הנמענים עם הזרקה תת עורית נוספת של 5 מ ג של Carprofen לכל ק ג של משקל גוף ביום postאופרטי1 (POD). בנוסף, להוסיף 1 גרם של Metamizol כדי 500 mL של מי שתייה עד התרמיל השלישי.
2. התחל לעקוב אחר תפקוד שתל הלב על ידי מישוש הבטן היומית על התרמיל השלישי.
   הערה: במקרה של כשל השתל לפני ה-POD השלישי, יש לשקול ניתוח במקום כישלון חיסולוגי. עם זאת, זה כמובן תלוי בשילוב הזנים שנבחרו ואת המודל האימונוולוגי בהתאמה (למשל, דחייה יתר על כן לאחר חיסון קודם).
3. בעקבות דחיית השתל, לחלץ את הרקמות כמו בלוטות לימפה הניקוז מרוקן את הגולגולת של anastomoses, את הטחול, את הדם, את התימוס ואת השתל לניתוחים אימונולוגיים נוספים באמצעות הזרמת cy, או אימונוהיסטוכימיה.

4. העיכול האנזימטי של הלב וההזרקה התת-עורית של תאי הלב באוזן

1. בצעו הסבר לב והפרזיה להשתלה הטרוטופית לב (ראה שלב 1).
2. לגרוס את הלב בשלושה מ"מ x 3 מ מ בלוקים באמצעות מספריים אזמל סטרילי או סטרילי ו דגירה אותו 30 דקות ב 37 ° צ' בינונית התרבות המכילה 0.5 mg/mL הקולגן.
   הערה: חשוב להשתמש במדיום התרבותי המכיל פניצילין, סטרפטומיצין ו גלוטמין ללא סרום עגל עוברי (FCS) במיוחד כמו FCS מעכב את העיכול קולגן.
3. להוסיף את הרקמה מתעכל על מסננת גדול, תוך הסרת בינוני התרבות והמאייד ביסודיות כדי לקבל השעיה של תאים חיוניים לשריר הלב, בעיקר מתים בודדים לב התאים ותאי הדם הנותרים. תשטוף את ההשעיה הסלולרית פעמיים. עם תמיסת מלח איזוטוניק סטרילית
   הערה: הגדרות צנטריפוגה: 10 דקות, 200 x g, 20 ° צ'
4. לסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר ולאסוף את התא החיוני congeries ידי שטיפה מסננת התא עם 5-10 mL של תמיסת מלוחים איזוטוניקה.
5. לאחר צנטריפוגה, השהה מחדש את תאי שריר הלב בתמיסה מלוחים הומס בריכוז של 5x10⁵ תאים/mL ולצייר את הפתרון התא עד מזרק 1 mL.
6. בצע הרדמה באופן מבוקר לפרוטוקול המתואר עבור הרדמה המטופל (ראה שלב 2) עבור השתלת לב הטרולפית.
7. מניחים את המטופל בתנוחה צדדית ומסדרים את האוזן עם אצבע באמצעות קלטת כפולה (איור 5א).
8. הכנס 20 μL של הפתרון של תא שרירי הלב (המכיל 1 x 10⁴ תאים) באמצעות הצינורית של 27 גר' ספורטינג ראגה קרוב לכלי הקפילר החזותיים לתוך אוזנו של המטופל (איור 5ב).
9. לאחר תקופת התבוננות מוגדרת (בהתאם לשילוב הזנים הנבחר וכוח של דחייה), לחלץ את בלוטות ניקוז הלימפה בצוואר הרחם ולבצע ניתוחים נוספים כגון הזרמת cy, או שיתוף תרבויות (איור 5ג).
   הערה: בנוסף, ניתוח היסטולוגית של הפינה ניתן לבצע כדי לקבוע חדירת תאים.

תוצאות

בעבר, בעיות אימונולוגיים שונות טופלו על בסיס המודל, אשר אומת בקבוצת העבודה על ידי יותר מ 500 השתלות עם שיעור הישרדות של יותר מ 95%^{13,18,19,20,21,22,23,}

Discussion

השיטה שתוארה קודם לכן השתלת לב הטרופית בחולדות מבוססת בעיקר על התיאור של אונו ולינדזי ב 1969³. מאז, הוכנסו מספר שינויים במינים שונים המובילים למגוון רחב של מודל זה. שילוב של כמה שינויים אלה ומציג את הניסיון שלנו כתוצאה מעל 30 שנים של ביצוע של השתלות לב הטרולפית במעבדה, יצרנו גישה כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R