大鼠异位心脏和心肌细胞移植的免疫模型

摘要

我们描述了大鼠异位腹心移植的模型，这意味着对当前策略的修改，从而导致简化的手术方法。此外，我们还描述了一种新的排斥模型，通过注射重要的心肌细胞的耳朵内，允许进一步的移植免疫学分析在大鼠。

摘要

50多年来，大鼠异位心脏移植一直是各种免疫学研究的常用模型。自1964年第一次描述以来，已经报告了若干修改。在大鼠进行异位心脏移植30年后，我们开发了一种简化的手术方法，无需进一步手术训练或背景，即可轻松教授和进行。

在解剖上升主动脉和肺动脉和上等类腔和肺静脉结扎后，供体心脏被收获，然后注入冰冷盐水溶液补充肝素。在夹紧和切开受体腹血管后，捐赠者提升主动脉和肺动脉分别被麻醉到受体腹部主动脉和劣质的vena卡瓦，使用连续的导联。

根据不同的供体-受体组合，此模型允许分析异体移植的急性或慢性排斥。该模型的免疫意义进一步增强，通过一种新的注射重要心肌细胞的耳内注射方法，以及随后对排空颈淋巴组织的分析， 进一步增强了该模型的免疫意义。

引言

异位心脏移植是一种常用的实验模型，用于不同研究移植耐受性、急性和慢性异体移植排斥、缺血再灌注损伤、机器灌注或心脏重塑等。除其他优点外，移植功能可以通过触觉进行非侵入性监测，移植失败不会导致接受者与其他器官（如肾脏或肝脏）相比的重要损伤。

1964年，Abbott等人最初描述了大鼠¹的异位腹心移植。后来，在1966年，原子塔等人对阿纳斯托莫的端到端技术作了^描述。1969^年，奥诺和林赛报告了目前使用的模型的基础。在过去的几十年中，已经发表了一些修改，以创建不同类型的卸载，部分加载或加载左心室心脏移植，包括联合异位心肺移植^{44，5，6。5,6}对于免疫分析，最常见的是非体积加载心脏移植移植。在这种情况下，血流逆行进入供体上升主动脉，随后进入冠状动脉。静脉排水沿冠状窦进入右中庭和心室（图1A-B）。因此，除了来自Thebesian静脉的少量血液外，左心室被排除在血流之外。这也使它成为研究左心室辅助^{装置治疗7}期间的病理生理机制的有用模型。

异位心脏移植已在各种物种中进行，包括小鼠、兔子、猪，甚至被用作^,人类^{8、9、10、119}的单体或双心形辅助⁸装置。^10,11大鼠仍然是移植模型的流行实验动物，特别是因为不同大鼠菌株组合的移植存活时间在过去已经明确，大量的免疫试剂是可访问的^{12，13。12,}与老鼠不同，大鼠做手术和获得淋巴组织进行免疫分析更可行^12。此外，近年来在大鼠身上引入商业性克隆技术，很可能导致对实验鼠模型¹⁴的反复关注。

一般来说，异位心脏移植可以通过进行宫颈或腹部麻醉附着在受体血管上。然而，一些研究表明，由于更好的获得手动触觉或跨体波他心动图，因此可以更精确地检测移植失败^15，16，因此，股骨性麻醉有助于改善监测。^15,

结果表明，两种阿生^虫技术在操作时间、并发症率、结果和移植生存时间上没有差异。显然，必须提及有足够的排空淋巴结，作为宫颈麻醉的好处;但是，需要较长的培训期。相反，腹部麻醉对于免疫学研究来说不那么复杂，同样有价值，特别是当结合一种新疗法的异源性心肌细胞和随后的宫颈淋巴切除术的结果时。两种模型的组合提供了广泛的干预后免疫分析。

以下协议是指对外科医生进行手术，以减少缺血时间。但是，所有实验都可以由一个人执行。图2A-B显示了心脏外植和植入仪器和材料的设置。

研究方案

所有动物经验均按照下萨克森州（德国奥尔登堡州拉维斯）消费者保护和食品安全区域当局当地道德动物审查委员会的准则进行，并经批准，12/0768 和 17/2472。

1. 心脏外植和灌注

注:作为移植捐赠者，使用7-22周年龄的雌性或雄性大鼠。

1. 通过吸入的二氟拉纳对供体大鼠进行麻醉（感应5%，维持3%，O₂流量为1升/分钟）。注射5毫克Carprofen下皮每公斤体重的围手术性肛门，并检查脚趾捏退反射的缺失。
2. 使用眼部润滑剂，使用机械钳去除腹部和胸皮。
3. 将供体置于支撑位置，用弹性带固定手术台底部的四肢，用70%乙醇或其他足够的替代品对皮肤进行消毒。
4. 在纵向方向和应用局部麻醉剂后（例如，利多卡因0.2%）将皮肤切开使用剪刀进行中位腹腔切除术。
5. 插入缩回器，将肠子动员到供体左侧，用消毒棉签露出劣质的维纳卡瓦。
6. 对于抗凝，通过刺穿劣质的静脉注射，将500I.U.肝素溶解在1mL的冰冷同声镇盐溶液中。在针头回缩后，用棉签用光压缩停止穿刺部位的出血（图3A）。
7. 切开隔膜，对捐赠者的两侧进行侧胸膜切除术。
8. 将胸腔的动员通风墙固定到操作台上。
9. 使用两个微针支架，通过钝化制剂去除心外膜和血管神经。
10. 进行腹部血管的截面，以排泄供体和卸载心脏。
11. 将探头钝枝尖剪刀插入透射器围腹正射，用湿润的压缩将上升主动脉和肺动脉尽可能远地分开心脏的轻胸牵引下（图3B）。
12. 在上等和劣质的静脉和肺静脉周围放置一个5-0连字，并尽可能收紧背带（图3C）。
13. 将组织背对条塞与结扎切断并提取心脏（图3D）。
14. 通过上升的主动脉和肺动脉，用静脉导管的18 G导管填充被植入的心脏，并辅以1000 I.U.肝素，并将心脏置于15 mL管中，在冰上充满盐水溶液（图3E-F）。

2. 心脏植入

注:作为接受者，使用10-14周大的雌性或雄性大鼠。捐助者和受助人的体重大致相当。

1. 使用异氟拉涅吸入（感应时为5%，维持1.5-2%，O₂流量为1升/分钟），对受体大鼠进行麻醉。注射5毫克Carprofen下皮每公斤体重的围手术性肛门，并检查脚趾捏退反射的缺失。
2. 涂抹眼睛润滑剂，去除腹部毛皮，固定四肢，对皮肤进行与供体准备类似的消毒。为获得最佳术后效果，在加热垫上执行操作，以防止术中体温过低。
3. 皮肤纵向切口后，在腹部筋膜上涂抹局部麻醉剂，如利多卡因（0.2%）。通过中位腹腔切除术打开腹腔并插入缩回器。
4. 将肠子调动到受体的左上角，并将其置于温暖、湿润的压缩中。
5. 在调动十二指肠和近端的假象后，分别使用手术显微镜（或放大眼镜）与5-7倍放大倍率，暴露腹部主声和劣质的维纳卡瓦通过钝化准备与棉签。不要分离腹血管。
6. 使用两个微型针夹抬起腹血管，而不会伤害腰静脉，并定位库利血管夹（图4A）。
7. 用30-45°拱形27G管子刺穿腹部血管（图4B）。
8. 使用Potts剪刀扩大穿刺部位，形成一个纵向切口，与供体容器的流明大小相匹配（图4C-D），并用盐水溶液注入受体容器，以去除血栓，防止术后血栓。
9. 将移植物放入原位，并通过两个简单的中断缝合（8-0）固定供体提升主从到受体腹部主主塔在纵向切口的颅角和切口角处的单丝不可再索缝合（图4E）。
10. Anastomos 通过运行 8-0 使捐赠者的提升主主塔与接受者的腹部主塔单丝缝合分两步:第一，将移植物放在受体容器的右侧，并执行前半部分的麻醉（图4E）。随后，将移植物放在接收容器的左侧，并执行阿通莫他症的后半部分（图4F）。
11. 将供体肺动脉固定在与主动脉麻醉类似的劣质静脉腔（8-0）单丝非可再索性缝合）。从容器的铝内侧缝合静脉单声道的半部分（图4G-H）。
12. 在拧紧结之前，直接用盐水冲洗阿他托曼，以防止周围栓塞。
13. 在两个阿他托器周围放置止血纱布，并小心地释放冷血管夹，以便开始移植物的再灌注。用消毒棉签进行光压缩，沿阿曲剂处理出血。
    注:移植物应在60s左右开始跳动。
14. 像这种蜿蜒的方式替换肠子。确保甲流半径没有异常旋转，以防止肠道坏死或机械阻塞。
15. 使用连续 3-0 多丝跑步缝合线分别关闭腹部肌肉/筋膜和皮肤。

3. 术后护理

1. 对于术后性肛门，在术后第一天（POD）为接受者提供每公斤体重每公斤5毫克卡普罗芬的额外皮下注射。此外，在第三次 POD 之前，将 1 克 Metamizol 添加到 500 mL 饮用水中。
2. 开始监测心脏移植功能，通过每天的腹部触觉在第三个POD。
   注:在第三个POD之前移植失败的情况下，应考虑手术而不是免疫衰竭。然而，这当然取决于所选择的菌株组合和相应的免疫学模型（例如，先前免疫后超急性排斥）。
3. 移植排斥后，提取组织，如排泄的逆转录入淋巴结颅骨的麻醉剂，脾脏，血液，胸腺和移植物，通过流动细胞学或免疫组织化学进一步免疫分析。

4. 心脏酶消化和耳皮下心脏细胞注射

1. 进行心脏外植和灌注类似于异位心脏移植（参见步骤1）。
2. 使用无菌手术刀或无菌剪刀将心脏粉碎 3 mm x 3 mm 块，并在含有 0.5 mg/mL 胶原蛋白酶的培养介质中 37°C 孵育 30 分钟心脏。
   注:使用含有青霉素、链霉素和谷氨酰胺的培养基而不携带胎儿小牛血清（FCS）很重要，特别是因为FCS抑制胶原蛋白酶消化。
3. 将消化的组织添加到大孔筛中，同时彻底去除培养基和薄荷，使重要的心肌细胞（大部分为死单心脏细胞和剩余血细胞）暂停。用无菌同质盐水溶液洗涤细胞悬浮液两次。
   注:离心设置:10 分钟、200 x g、20°C
4. 使用 40 μm 细胞滤网过滤悬浮液，并通过用 5-10 mL 等同子盐水溶液冲洗细胞滤网来收集重要的细胞通结。
5. 离心后，在盐水溶液中重新悬浮心脏肌肉细胞溶解，浓度为5x10⁵细胞/mL，并将细胞溶液拉入1 mL注射器中。
6. 进行麻醉，类似于为异位心脏移植为受体麻醉描述的协议（参见步骤 2）。
7. 将接收者置于横向位置，并使用双面胶带用手指固定耳朵（图 5Figure 5A）。
8. 通过靠近视觉毛细血管的27 G导管s.c.将20μL的心脏肌肉细胞溶液（包含1 x 10⁴细胞）注射到接受者的耳朵（图5B）。
9. 在定义的观察期（取决于所选的应变组合和抑制强度）后，提取排空的颈椎淋巴结，并执行进一步分析，如流细胞学或共培养（图5CC）。
   注:此外，可以执行针图组织分析以确定细胞渗透。

结果

过去，不同的免疫问题都根据该模型得到解决，在工作小组中，500多例移植进行了验证，存活率超过95%，13、18、19、20、21、22、23、24。^{23,2413,18,19,20,21,22,}总手术时间（包?...

讨论

先前描述的大鼠异位心脏移植方法主要基于1969年对小野和林赛^的描述。自那时以来，对各种物种进行了若干修改，导致该模型的广泛多样性。结合其中几个修改，并介绍我们自己的经验，在实验室进行了超过30年的异位心脏移植，我们创造了一个可行的手术方法，不需要长时间的训练或手术背景。在下面，我们将讨论此模型的一般限制，并强调协议的关键步骤。此外，我们将强?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R