JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تهدف الطريقة المبينة أدناه إلى توفير بروتوكول شامل لإعداد جراحة الأعصاب غير البشرية (NHP) باستخدام مزيج جديد من طرق الطباعة ثلاثية الأبعاد (3D) واستخراج بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي.

Abstract

في هذه الورقة، نحدد طريقة للتحضير الجراحي الذي يسمح للتخطيط العملي لمجموعة متنوعة من جراحات الأعصاب في NHPs فقط باستخدام البيانات المستخرجة من التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). يسمح هذا البروتوكول لتوليد نماذج جسدية دقيقة تشريحية ثلاثية الأبعاد للدماغ والجمجمة ، بالإضافة إلى نموذج جل أجاروز للدماغ الذي ينمّر بعض الخصائص الميكانيكية للدماغ. ويمكن استخراج هذه النماذج من التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام برنامج استخراج الدماغ لنموذج الدماغ، ورمز مخصص لنموذج الجمجمة. ويستفيد بروتوكول الإعداد من أحدث تكنولوجيا الطباعة ثلاثية الأبعاد لصنع أدمغة مُتشابكة وجماجم وقوالب لنماذج مخ هلامية. يمكن استخدام نماذج الجمجمة والدماغ لتصور أنسجة الدماغ داخل الجمجمة مع إضافة استئصال القحف في التعليمات البرمجية المخصصة ، مما يسمح بإعداد أفضل للعمليات الجراحية التي تشمل الدماغ مباشرة. تم تصميم تطبيقات هذه الطرق للعمليات الجراحية التي تشارك في التحفيز العصبي والتسجيل وكذلك الحقن ، ولكن براعة النظام تسمح للتوسع في المستقبل للبروتوكول وتقنيات الاستخراج والنماذج لنطاق أوسع من العمليات الجراحية.

Introduction

وقد تم بحث الرئيسيات خطوة محورية في تطور البحوث الطبية من النماذج الحيوانية إلى التجارب البشرية1,2. هذا هو الحال خصوصا في دراسة علم الأعصاب والهندسة العصبية كما أن هناك تباينا كبيرا الفسيولوجية والتشريحية بين أدمغة القوارض وتلك من الرئيسيات غير البشرية (NHP)1,2,3. مع التكنولوجيات الوراثية الناشئة مثل علم الكيمياء، optogenetics، والتصوير الكالسيوم التي تتطلب التعديل الوراثي للخلايا العصبية، وقد اكتسبت بحوث الهندسة العصبية دراسة وظيفة العصبية في NHP اهتماما خاصا كنموذج قبل الظهر لفهم وظيفة الدماغ2،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،15،16. في معظم تجارب علم الأعصاب NHP ، هناك حاجة إلى تدابير جراحة الأعصاب لزرع أجهزة مختلفة مثل وظائف الرأس ، و غرف التحفيز والتسجيل ، صفائف القطب والنوافذ البصرية4،5،6،7،10،11،13،14،15،17،18.

تستخدم مختبرات NHP الحالية مجموعة متنوعة من الأساليب التي غالبًا ما تتضمن ممارسات غير فعالة بما في ذلك تخدير الحيوان لتتناسب مع ساقي وظيفة الرأس وتقريب انحناء الجمجمة حول موقع استئصال القحف. مختبرات أخرى تناسب رئيس آخر إلى الجمجمة في عملية جراحية أو استخدام أساليب أكثر تقدما للحصول على القياسات اللازمة لزرع مثل تحليل أطلس الدماغ NHP والرنين المغناطيسي (MR) بمسح في محاولة لتقدير انحناء الجمجمة2,10,11,16. جراحي الأعصاب في NHPs تنطوي أيضا على حقن السوائل، وغالبا ما لا يكون المختبرات وسيلة لتصور موقع الحقن المتوقع داخل الدماغ2،4،5،13،14 الاعتماد فقط على قياسات تكسينية والمقارنة مع المسح MR. هذه الطرق لديها درجة من عدم اليقين لا مفر منه من عدم القدرة على اختبار التوافق المادي لجميع المكونات المعقدة للزرع.

لذلك، هناك حاجة إلى طريقة دقيقة غير فاشية للتخطيط للأعصاب في NHPs. هنا، نقدم بروتوكول ومنهجية لإعداد عمليات الزرع والحقن في هذه الحيوانات. تنبع العملية بأكملها من فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي ، حيث يتم استخراج الدماغ والجمجمة من البيانات لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) يمكن طباعتها 3D. يمكن الجمع بين نماذج الجمجمة والدماغ للتحضير لعمليات استئصال القحف وكذلك وظائف الرأس مع زيادة مستوى الدقة. ويمكن أيضا أن تستخدم نموذج الدماغ لخلق قالب لصب نموذج هلام دقيقة تشريحيا من الدماغ. يمكن استخدام مخ الجل وحده و بالاشتراك مع الجمجمة المستخرجة للتحضير لمجموعة متنوعة من عمليات الحقن الجراحية. أدناه سوف نصف كل من الخطوات المطلوبة للتصوير بالرنين المغناطيسي القائمة على الأدوات لإعداد جراحة الأعصاب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوان من قبل معهد جامعة واشنطن لرعاية الحيوانات واستخدامها. استخدم اثنان من المكاك الريسوس الذكور (القرد H: 14.9 كجم و 7 سنوات من العمر، القرد L: 14.8 كجم و 6 سنوات).

1. الحصول على صورة

  1. نقل القرد إلى ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي 3T ووضع الحيوان في إطار مستراتيكسيكي متوافق مع MR(جدول المواد).
  2. تسجيل T1 القياسية (زاوية الوجه = 8° ، وقت التكرار / صدى الوقت = 7.5/3.69 ث ، حجم المصفوفة = 432 × 432 × 80 ، مدة الاستحواذ = 103.7 s ، Multicoil(جدول المواد)، عدد المتوسطات = 1 ، سمك الشريحة = 1 مم) صور MR تشريحية.
    ملاحظة: لعزل الجمجمة الناجحة، استخدم المعلمات اقتناء التصوير بالرنين المغناطيسي المطبقة هنا لتحقيق أقصى قدر من الفصل بين الجمجمة والدماغ.

2. استخراج الدماغ

  1. في برنامج التصوير MR لاستخراج الدماغ حدد فتح | فتح الصورة. قم بتحميل المسح السريع للمغناطيس T1 المعدة (MPRAGE) المسح الضوئي المُكتسب في الخطوة 1.2 في برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي(جدول المواد).
  2. لاستخراج الدماغ، ضمن القائمة المنسدلة الإضافات حدد استخراج الدماغ (BET). استخراج عند عتبة كثافة حول 0.5- 0.7 وتعيين قيمة التدرج العتبة إلى 0. استخدام وظيفة استخراج مرارا وتكرارا في عتبات كثافة أقل على التوالي حتى المسح الضوئي يحتوي فقط على التشريح القشرية(الشكل 1B).
    ملاحظة: هذه هي عملية تكرارية لأن البرنامج لم يتم تصميم لأدمغة NHP والاستخراج ليست دقيقة
  3. ضمن منطقة الاهتمام (ROI) حدد عتبة إلى ROI وحدد الخيار لـ Shrink Wrap و 3D لإنشاء صورة نقطية للدماغ. سيؤدي هذا إلى تحويل وحدة التخزين إلى بتات ثنائية من التدرج، مما يبسط عمليات إنشاء الطراز المستقبلية. اختر عتبة (عادة حوالي 600) لعزل الدماغ عن الأنسجة المحيطة. يمكن العثور على هذه العتبة عن طريق تحوم فوق المادة الرمادية. حدد موافق لتكوين الصورة النقطية.
  4. لإنشاء سطح، حدد إنشاء سطح تحت قائمة الصور وإدخال العتبة المستخدمة لاستخراج الدماغ في الخطوة 2.3. ثم حدد موافق. يمكن استخدام السطح الناتج كمرجع لضبط قيمة العتبة لإنتاج تمثيل أعلى جودة للتشريح المستهدف (الشكل 1C).
  5. ضمن علامة التبويب ملف حدد حفظ أو حفظ باسم، وحفظ العائد على الاستثمار الدماغ المستخرج كملف .nii أو.nii.gz لاستخدامها في إنشاء نموذج للدماغ.

3. الدماغ النمذجة

  1. حدد | تحميل البيانات اختر الملفات لإضافة وتحميل الدماغ المستخرج المحفوظة في .nii أو .nii.gz نوع الملف في برامج معالجة الصور الطبية(جدول المواد).
  2. مرّر فوق الترحيب بقائمة دروب مقسمة الشرائح في شريط أدوات الوحدات النمطية وانتقل إلى جميع الوحدات النمطية. من تلك القائمة حدد وظيفة المحرر. انقر فوق موافق على تحذير المنبثقة.
  3. من قائمة وحدة المحرر، حدد تأثير العتبة ثم قم بضبط منزلقات نطاق العتبة بحيث يتم تمييز جزء الصورة النقطية التي تحتوي على الدماغ في الشرائح الثلاث. عند تحميل صورة نقطية، فإن ضبط كل من أشرطة التمرير إلى قيمة 1 يحدد الدماغ بأكمله. حدد تطبيق.
  4. فتح الوحدة النمطية maker طراز وفي القائمة المنسدلة وحدات التخزين الإدخال حدد ملف الصورة النقطية التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.3. ضمن النماذج، حدد إنشاء تدرج هرمي طراز جديد. بعد تعيين اسم النموذج إلى التسلسل الهرمي، حدد تطبيق لإنشاء وحدة التخزين.
  5. حفظ الملف بتنسيق .stl.
  6. لمزيد من تعديل نموذج الدماغ، تحميل ملف .stl كجسد الرسومات في برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (جدول المواد)
    ملاحظة: قد يستغرق هذا بعض الوقت، حيث أن أسطح الدماغ الشبكية المستوردة غالباً ما تكون معقدة للغاية.
  7. بمجرد استيراد الملف، في شجرة الميزات على الجانب الأيسر من الشاشة انقر على الأطفال من الجسم الرسم وقمع ميزات الرسومات غير الضرورية حتى يتم فقط الميزات التي تحتوي على الدماغ المتبقية في الملف. حفظ الملف المتبقي كـ .prt لمزيد من المعالجة و .stl للطباعة ثلاثية الأبعاد. حفظ الملف المتبقي كـ .prt لمزيد من المعالجة و .stl للطباعة ثلاثية الأبعاد.

4. الدماغ صب

  1. قم بتحميل نموذج الدماغ المستخرج من القسم 3 إلى برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر عن طريق فتح ملف .prt. أسفل قسم الميزات في قائمة الإدراج، حدد تحويل إلى نص شبكة. حدد الجسم الرسم من الدماغوتحويله.
  2. خلق قالب اليمين واليسار من الدماغ الكامل
    1. انقر فوق الزر رسم وحدد المستوى العلوي كما في مستوى الرسم. رسم مستطيل يحتوي إما على كامل نصف الكرة الأيمن أو الأيسر من الدماغ. حدد رئيس البثق / ميزة قاعدة بينما في رسم وقذف مستطيل مكعب لاحتواء الجزء العلوي من الدماغ.
      ملاحظة: قد يكون المكعب أن يكون مقذوف في اتجاهين من أجل احتواء نصف الكرة بأكمله. وذلك لأن نقطة الصفر، حيث يقع مستوى البثق، قد تقع داخل نموذج الدماغ. البثق في كلا الاتجاهين يضمن أن القالب سوف تشمل حجم كامل من الفائدة.
    2. ضمن قسم الميزات في قائمة "الإدراج"، حدد تحويل إلى نص شبكة. حدد المكعب مقذوف في المجلد الأجسام الصلبة وتحويله. لإنشاء المساحة السلبية، طرح نموذج الدماغ من مكعب مقذوف حديثا باستخدام ميزة الجمع وتحديد خيار طرح.
    3. كرر الخطوات 4.2.1 و 4.2.2 ل نصف الكرة الأخرى من الدماغ (اليمين أو اليسار) وحفظ الملفات الناتجة كـ .stl للطباعة ثلاثية الأبعاد و .prt لمزيد من التلاعب.
  3. خلق قالب اليمين واليسار من النصف العلوي من الدماغ.
    1. إنشاء رسم في الطائرة العلوية ورسم مستطيل يحتوي إما على كامل نصف الكرة الأيمن أو الأيسر من الدماغ. حدد ميزة رئيس /قاعدة البثق أثناء وجوده في الرسم وبثق مع ميزة إزاحة من الطائرة المحددة. تعويض البثق حتى مسافة حيث لا توجد ملامح معلقة في تشريح الدماغ، والتقاط فقط التشريح العلوي. ضمن قسم الميزات في قائمة "الإدراج"، حدد تحويل إلى نص شبكة. حدد المكعب مقذوف في المجلد الأجسام الصلبة وتحويله.
    2. لإنشاء المساحة السلبية، طرح نموذج الدماغ من مكعب مقذوف حديثا باستخدام ميزة الجمع وتحديد خيار طرح.
    3. إنشاء مستوى رسم على الجانب الظهري من القالب وحدد تحويل الكيانات ثم حدد رسم من الخطوة 4.3.1.
    4. حدد رئيس البثق / ميزة قاعدة بينما في رسم و, مع خيار البثق الأعمى المختار, قذف الجسم الصلبة ما يقرب من 5 مم لإحاطة تماما تشريح الدماغ طرح في القالب.
    5. كرر الخطوات 4.3.1−4.3.4 للكرة الأخرى من الدماغ (يسار أو يمين) وحفظ الملفات الناتجة كـ .stl للطباعة ثلاثية الأبعاد و.prt لمزيد من التلاعب.
  4. عن طريق تغيير أبعاد وموقع المكعب واتباع نفس البروتوكول (الخطوتين 4.1 و 4.2) ، وخلق قوالب تحتوي على أجزاء مختلفة من الدماغ.
  5. للطباعة ثلاثية الأبعاد، استخدم 70% من كثافة الحفر، وتزيد من سماكة الغلاف الخارجي للطباعة من أجل تقليل تسرب مواد القوالب. إذا كانت هناك ثغرات أو عيوب في الطباعة، قم بملئها باستخدام طلاء الأظافر أو أي عامل ملزم آخر.

5. النمذجة الجمجمة

  1. استيراد MRI MPRAGE سريعة من الخطوة 1.2 في برنامج معالجة المصفوفة كملف DICOM. قد يكون الملف DICOM في إطارات 2D منفصلة. إذا كانت هذه هي الحالة، ضم كافة الإطارات في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. تأكد من أن كل إطار 2D من المصفوفة هو عرض شريحة الإكليل.
  2. إنشاء قناع ثنائي بواسطة thresholding المصفوفة 3D باستخدام عامل تشغيل أكبر من قيم البكسل الفردية. ضبط عتبة بحيث يتم القبض على تشريح الجمجمة من قبل قناع (انظر ملف التشفير التكميلي CalibrateMask).
    ملاحظة: سوف يحتوي القناع على أربع طبقات مميزة. من الخارج في, وسوف يشار إليها باسم "خارج", "العضلات", "الجمجمة", و "الدماغ". في هذه المرحلة ، "خارج" و "الجمجمة" هي 0 في القناع ، و "العضلات" و "الدماغ" هي 1.
  3. لإزالة طبقة "العضلات"، قم بمعالجة كل إطار من القناع ثلاثي الأبعاد بشكل منفصل عن طريق الاستيلاء المتكرر على شريحة ثنائية الأبعاد من القناع (أي 3D_Mask(::،:،1)).
    1. لكل إطار، حدد 0 بكسل من زوايا الإطار في الطبقة "الخارجية" كـ "البذور". ثم ابحث عن 0 المجاورة حتى تواجه 1 بكسل. استمر في البحث حتى لا يمكن العثور على المزيد من 0. تحويل كل 0 المتصلة إلى 1. ويتم ذلك باستخدام وظيفة Matlab "imfill" ، مع المدخلات والمخرجات يجري [MASK2] = imfill (MASK1 ، LOCATIONS ، الاتصالية) ، حيث MASK1 هو قناع الأصلي الخاص بك ، وS MASK2 هو تعبئة قناع (انظر ملف التشفير التكميلي FillExterior).
  4. ستفقد بعض معلومات الجمجمة أثناء عملية الإزالة. للتخفيف من فقدان المعلومات، قم بتنفيذ الخطوة 5.3 في كافة الأبعاد الثلاثة للبيانات، والاحتفاظ بها منفصلة.
    ملاحظة: الآن كل من "خارج" و "العضلات" هي 1، وسوف تعتبر "خارج". يحتوي القناع الآن على ثلاث طبقات متميزة ، "خارج" ، "الجمجمة" ، و "الدماغ". "خارج" و "الدماغ" هي 1، و "الجمجمة" هو 0.
  5. عكس قيم القناع باستخدام ~ عامل التشغيل (أي، MASK2 = ~ MASK1). الآن "الجمجمة" هو 1 و "خارج" و "الدماغ" هي 0.
  6. 1 التي يتم لمس بعضها البعض في كل قناع يمكن اعتبارها "الكائنات". إنشاء فهرس لكافة الكائنات في كل قناع باستخدام دالة Matlab "bwconncomp"، مع المدخلات والمخرجات يجري [CC] = bwconncomp(MASK)، حيث MASK هو مصفوفة قناع 3D، وCC هو كائن الهيكلية التي تحتوي على قيم مؤشر لكل كائن، وعدد الكائنات وحجم المصفوفة. لكل قناع، قم بإزالة كافة الكائنات باستثناء أكبر واحد يحتوي على معظم voxels عن طريق تعيين قيم الكائنات الأصغر إلى 0 (انظر ملف التشفير الإضافي RemoveNoise).
  7. إضافة الأقنعة التي تم إنشاؤها من كل تمريرة معا (انظر ملف ترميز إضافي الدمج).
  8. تحجيم الدماغ إلى قرار ثابت.
    1. من رأس DICOM، قارن حجم الخطوة بين كل إطار من الرنين المغناطيسي لأبعاد كل بكسل.
    2. إذا كانت هذه القيم مختلفة، قم بتعريف عامل مقياس لتعويض الفرق في الدقة بين حجم الخطوة وحجم البيكسل لكل voxel. على سبيل المثال، إذا كان كل إطار 1 مم عن بعضها، وكان بعد البكسل 0.33 مم × 0.33 مم، فإن عامل المقياس سيكون 3.
    3. إضافة voxels فارغة إضافية إلى قناع 3D حتى البعد أدنى دقة من القناع أكبر من قبل عامل تعريفه من قبل عامل مقياس (انظر ملف التشفير التكميلي "ScaleMask").
    4. يُقيم القيم في القناع خطياً حتى يملأ القناع المساحة الجديدة.
    5. تصدير الجمجمة كملف .stl أو نوع ملف مشابه للطباعة ثلاثية الأبعاد.

6. خلق القحف في نموذج الجمجمة 3D

  1. باستخدام ملف التصوير بالرنين المغناطيسي من الخطوة 5.1، حدد يدويا الموقع التقريبي لعملية استئصال القحف من المعالم التشريحية الموجودة في أطلس الدماغ المكاك (على سبيل المثال، sulcus المركزية)19.
    1. عرض شريحة فردية من المصفوفة ثلاثية الأبعاد (على غرار الخطوة 5.3).
    2. المسح الضوئي يدويا إلى الأمام أو الخلف من خلال مصفوفة 3D حتى يتم تحديد المعالم التشريحية يمكن التعرف عليها.
    3. حفظ رقم الإطار كإحداثيات z (أي، 3D_Mask(:،:،،z)
    4. استخدام أداة اختيار البيانات لحفظ س و ص إحداثيات نقطة واحدة على هذا الإطار لغرس القحف أن تكون مركزة على استخدام وظيفة Matlab "getpts" ، مع المدخلات والمخرجات يجري [س ، ص] = getpts. "getpts" يفتح واجهة المستخدم، انقر على الإطار المطلوب (انظر ملف التشفير التكميلي LocateCraniotomy).
  2. تحويل نصف قطر استئصال القحف المقصود من مم إلى voxels باستخدام المعلومات في رأس DICOM.
  3. باستخدام النقطة المحددة في الخطوة 6.1 كنقطة وسط، تعيين جميع voxels داخل دائرة نصف قطرها 6.2 إلى الصفر في القناع من الخطوة 5.8.4 باستخدام ملف التشفير التكميلية استئصال القحف ،حيث المدخلات والمخرجات هي [القحف التومسك] = القحف (قناع ، س ، ص ، ض ، دائرة نصف قطرها ، س ، ص ، ض ، القرار)حيث cranitomyMask هو مصفوفة 3D مع استئصال القحف إزالتها، قناع هو مصفوفة 3D الأولي، x،y،z هي إحداثيات centerpoint من استئصال القحف، نصف القطر هو نصف قطرها من استئصال القحف، X، Y، Z هي ناقلات الشبكة من مصفوفة 3D، والقرار هو نصف قطرها المحدد في الخطوة 6.2 (انظر ملف الترميز التكميلي Craniotomy).
  4. بالنسبة إلى عمليات استئصال القحف المتعددة، كرر الخطوات 6.1−6.3 لكل عملية استئصال القحف الفريدة.
  5. تصدير الجمجمة كملف .stl أو نوع ملف مشابه للطباعة ثلاثية الأبعاد.

7.3D الطباعة

ملاحظة: يتم استخدام نوعين من الطابعات ثلاثية الأبعاد للنماذج الأولية الفعلية(جدول المواد). بالنسبة للمواصفات التالية، يجب أن تكون كافة إعدادات الطابعة ثلاثية الأبعاد وبرامج الطباعة افتراضية ما لم يرد ذكر خلاف ذلك.

  1. من أجل طباعة النماذج والقوالب، واستخدام طابعة جيش التحرير الشعبي القياسية(جدول المواد)وإنشاء G-رمز مع الطابعة والبرمجيات الإعدادات التالية: الكثافة الداخلية > 50٪ (وهذا مهم بشكل خاص بالنسبة للقوالب لأنها يجب أن تعقد السائل)، سريع العسل نقش التعبئة الداخلية، نمط التعبئة الخارجية المستقيمة، درجة حرارة لوحة = 50 درجة مئوية، ودرجة الحرارة الطارد = 230 درجة مئوية.
  2. من أجل طباعة نماذج أعلى دقة من الدماغ والجمجمة استخدام طابعة الصناعية الصف لجعل الطباعة مجتمعة من الاكريلونيتريل butadiene الستايرين (ABS) لنموذج ومواد الدعم dissolvable (جدول المواد). ثم إنشاء رمز G ومع إعدادات الطابعة التالية: تعبئة نمط متفرق - الكثافة العالية. سيتم تعيين كافة الإعدادات الأخرى تلقائياً إلى الإعداد الافتراضي المناسب.
    1. حل النموذج في المذيبات الدعم(جدول المواد)ل ~ 12 ساعة.
  3. بعد تنفيذ إعدادات الطابعة المناسبة، اضغط على ابدأ واشاهد الطبقة الأولى من الطباعة للتأكد من أن الطبقة الأساسية نظيفة وحتى.
  4. بعد طباعة 3D القوالب، التصحيح أي ثقوب مرئية مع طلاء الأظافر (جدول المواد) لضمان ختم أكثر إحكاما.
    ملاحظة: يمكن الجمع بين الدماغ والجمجمة المطبوعة ثلاثية الأبعاد عن طريق إدخال نموذج الدماغ في الجزء السفلي المفتوح من الجمجمة. يمكن أن يؤدي إزالة تشريح العين إلى تسهيل وضع نموذج الدماغ دون فقدان معلومات مهمة. عندما توضع داخل الجمجمة، ينحاز الدماغ بشكل طبيعي إلى الوضع الصحيح تشريحيا.

8- إعداد أجاروز

  1. خلط مسحوق أجار (جدول المواد) ومسحوق علكة الفول الجراد (جدول المواد) في نسبة 1:4 حسب الكتلة.
  2. الجمع بين خليط مسحوق مع 1x الفوسفات المخزنة حل(جدول المواد)إلى 0.6٪ تركيز الحل في قارورة Erlenmeyer.
    ملاحظة: التركيزات المستخدمة من قبل مختبرات أخرى تقع في نطاق 0.5٪ -0.6٪20،21.
  3. تعيين الميكروويف إلى السلطة القصوى ووضع قارورة تحتوي على حل في الميكروويف لمدة 2 دقيقة.
  4. مراقبة الحل. عندما يبدأ الحل في الفقاعة ، أوقف الميكروويف والمؤقت ، وأزل القارورة ، ودوامة بقوة. تعيين قارورة مرة أخرى في الميكروويف واستئناف الميكروويف والموقت.
    ملاحظة: الغرض هو تسخين المحلل دون تقليل حجم التبخر بشكل كبير أثناء الغليان.
  5. كرر الخطوة 8.4 حتى اكتمال دقيقتين.
  6. قم بإزالة القارورة وحافظ على الدوام لمنع الحل من وضعها في القارورة.
  7. تشغيل الماء البارد على السطح الخارجي للقارورة لتبريد الحل أثناء الدوران. تبريد الحل حتى خارج القارورة الساخنة لمسة، حتى الآن مقبولة وآمنة، لمنع الحل من تشويه القالب البلاستيك في الخطوات التالية.
  8. دوامة قارورة أثناء نقل الحل إلى القالب لتجنب تصلب سابق لأوانه.

9. أغاروز صب

ملاحظة: عملية صب agarose المبينة أدناه هو نفسه لنصف الكرة الكامل ونصف النصف قوالب العلوي

  1. صب حل agarose في واحدة من قوالب الدماغ حتى الكامل. استمر في الدوران في الحل المتبقي في القارورة.
  2. مراقبة مستوى الحل في القالب للتسريبات. إعادة ملء القالب حسب الضرورة منذ وضع agarose سوف ختم أي تسرب في القالب.
  3. السماح للحل في القالب للجلوس غير مضطرب في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تعيين الحل وتصلب في صلبة.
    ملاحظة: أثناء أوقات الانتظار قد تختلف استناداً إلى حجم الحل وعوامل أخرى، 2 ح تم العثور على وقت انتظار موثوق بها.
  4. استخدام ملعقة لإزالة بلطف نموذج هلام من القالب. تكون استراتيجية مع موقع ملعقة الإدراج في القالب من أجل منع التشوهات المحتملة إلى سطح القالب.
  5. لإبطاء عملية التبخر الطبيعي والتعرض للعوامل البيولوجية، ضع نموذج الجل في وعاء مغلق في الثلاجة.

10. حقن في نموذج هلام agarose

  1. إعداد مضخة للضخ وإصلاحه في ذراع stereotaxic على إطار stereotaxic(جدول المواد). ضع المضخة على مسار الحقن الصحيح والموقع الطبيعي على سطح نموذج الجل من القسم 9.
  2. ملء حقنة 250 ميكرولتر(جدول المواد)مع المياه DI. جبل حقنة على المضخة (جدول المواد).
    ملاحظة: قبل رسم أي صبغة، يجب أن المياه DI ملء كانولا الحقن (جدول المواد)تماما. و بهذه الطريقة عندما يتم رسم الصبغة من خلال القنية لا يوجد ضغط أو توسع للهواء من قبل المكبس الذي قد يؤثر على حجم الحقن.
  3. استخدام برنامج تشغيل مضخة (جدول المواد) لسحب تلوين الطعام (جدول المواد) في حقنة إلى الحجم المستهدف للحقن. حقن تلوين الطعام ببطء حتى تتشكل حبة صغيرة في طرف القنية لمنع فقاعات الهواء من أن يتم حقنها في الجل. جففي الخرزة من طرف القنية.
  4. ضع نموذج الجل تحت القنية. خفض القنية حتى تلامس طرف سطح نموذج هلام. لاحظ القياسات على ذراع stereotaxic.
  5. خفض كانولا في نموذج هلام بسرعة وسلاسة إلى عمق الحقن الهدف وضمان أن سطح الجل قد مختومة حول القنية.
  6. تشغيل المضخة ومراقبة انتشار تلوين الطعام حتى يتم حقن الحجم المستهدف. تبدأ مع معدل تدفق 1 ميكرولتر / دقيقة وزيادة إلى 5 ميكرولتر / دقيقة مع 1 ميكرولتر / دقيقة الخطوات كل دقيقة. انتشار تلوين الطعام في الجل هو تقريب لانتشار ناقل فيروسي في الدماغ.
  7. إزالة القنية من هلام بسرعة وسلاسة.
  8. التقاط صور لانتشار تلوين الطعام مع جهاز التصوير الفوتوغرافي(جدول المواد)وقياس أبعاد الانسداد من أجل حساب حجم الإهليلجي للحقن. هذا النهج هو ممكن نظرا لطبيعة شفافة من هلام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وقد استخدم التلاعب وتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي كإجراء تخطيط استئصال القحف قبل الجراحة بنجاح فيالماضي 2،5،10،16. ومع ذلك، فقد تعززت هذه العملية إلى حد كبير بإضافة النمذجة ثلاثية الأبعاد للدماغ والجمجمة والاستئصال ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

توضح هذه المقالة مجموعة أدوات للتحضير لجرّاح الأعصاب في NHPs باستخدام النماذج الفيزيائية و CAD لتشريح الجمجمة والدماغ المستخرجة من فحوصات MR.

في حين تم تصميم نماذج الجمجمة والمخ المطبوعة ثلاثية الأبعاد المستخرجة والمستخرجة من 3D خصيصًا لإعداد عمليات استئصال القحف وزرع الرأس ، ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه في الوقت هذا الوقت.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا المشروع من قبل معهد يونيس كينيدي شيفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم K12HD073945، ومركز واشنطن الوطني لبحوث الرئيسيات (WaNPCR، P51 OD010425)، ومركز التكنولوجيا العصبية (CNT، مركز أبحاث الهندسة التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت منحة EEC-1028725) وجامعة واشنطن المتخصصة في الأبحاث. وجاء تمويل مختبرات ماكنك ومارتينيز كوندي لهذا المشروع من مبادرة BRAIN NSF-NCS جائزة 17348887، فضلا عن جوائز NSF 1523614 & 1829474، وSY الإمبراطورية المنح المبتكرة لكل أستاذ. نشكر كرم الخطيب على مساعدته في إعداد أغاروز، وتوني جي هوان على المساعدة الفنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Printing Software (GrabCAD Print)StratasysVersion 1.36Used for High quality 3D printing
3D Printing Software (Simplify 3D)Simplify3DVersion 4.1Used for PLA 3D printing
AgaroseBenchmark ScientificA1700Used for making gel brains
Black Nail PolishL.A. ColorsCNP637Used for gel molding
Cannula (ID 450 um, OD 666 um)Polymicro Technologies1068150625Used to inject dye into gel brain
Catheter ConnectorB BraunPCC2000Perifix for 20-24 Gage epidural catheters; Units per Cs 50
Dremel 3D Digilab 3D45 printerDremelF0133D45AAUsed for prototyping in PLA
ECOWORKSStratasys300-00104Used to dissolve QSR support structures
Erlymeyer flaskPyrex4980Used for gel molding
Ethyl cyanoacrylateThe Original Super Glue Corp.15187Used to make combined cannula
Graduated cylinder3023Used for gel molding
HATCHBOX PLA 3D Printer FilamentHATCHBOX3DPLA-1KG1.75-RED/3DPLA-1KG1.75-BLACK1kg Spool, 1.75mm, Red/Black
Locust Bean GumModernist Pantry1018Gumming agent for gel brain mixtures
MATLABMathWorksR2019bUsed for skull extraction
McCormick Yellow Food ColorMcCormickUsed for dye injection
MicrowavePanasonicNN-SD975SUsed for agarose curing
MR Imaging Software (3D Slicer)3D SlicerVersion 4.10.2Used for 3D model generation
MR Imaging Software (Mango with BET plugin)Reasearch Imaging InstituteVersion 4.1Used for brain extraction
Philips Acheiva MRI SystemPhilips4522 991 19391Used to image non-human primates
Phosphate Buffered SolutionGibco70011-04410X diluted with DI water to 1X
PumpWPIUMP3T-1Used for dye injection
Pump driverWPIUMP3T-1Used for dye injection
RefrigeratorGeneral ElectricUsed to preserve agarose gel
Scientific SpatulaVWR82027-494Used to extract gel molds
SolidWorksDassault Systemes2019
Stratasys ABS-M30 filamentStratasys333-60304Used for high quality 3D printing
Stratasys F170 3D printerStratasys123-10000Used for high quality 3D printing
Stratasys QSR supportStratasys333-63500Used to create supports with ABS model
SyringeSGESGE250TLLUsed for dye injection

References

  1. Phillips, K. A., et al. Why primate models matter. American Journal of Primatology. 76 (9), 801-827 (2014).
  2. Macknik, S. L., et al. Advanced Circuit and Cellular Imaging Methods in Nonhuman Primates. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8267-8274 (2019).
  3. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3507-3512 (2013).
  4. Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biol. 16 (8), 2005839(2018).
  5. Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
  6. Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in nonhuman primates. Elife. 7, (2018).
  7. Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
  8. Yao, Z., Yazdan-Shahmorad, A. A Quantitative Model for Estimating the Scale of Photochemically Induced Ischemic Stroke. Conference proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 2744-2747 (2018).
  9. Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Sabes, P. N. Novel techniques for large-scale manipulations of cortical networks in nonhuman primates. Conference proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 5479-5482 (2018).
  10. Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
  11. Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in nonhuman primates. SPIE BiOS. , (2015).
  12. Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Progress in Brain Research. 196, 215-233 (2012).
  13. Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), 7297-7306 (2016).
  14. May, T., et al. Detection of optogenetic stimulation in somatosensory cortex by nonhuman primates--towards artificial tactile sensation. PLoS One. 9 (12), 114529(2014).
  15. Griggs, D. J., K, K., Philips, S., Chan, J. W., Ojemann, W. K. S., Yazdan-Shahmorad, A. Optimized large-scale optogenetic interface for nonhuman primates. SPIE BiOS. , (2019).
  16. Khateeb, K., Griggs, D. J., Sabes, P. N., Yazdan-Shahmorad, A. Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  17. Lucas, T. H., Fetz, E. E. Myo-cortical crossed feedback reorganizes primate motor cortex output. Journal of Neuroscience. 33 (12), 5261-5274 (2013).
  18. Jackson, A., Mavoori, J., Fetz, E. E. Long-term motor cortex plasticity induced by an electronic neural implant. Nature. 444 (7115), 56-60 (2006).
  19. Paxinos, G., Huang, X. F., Petrides, M., Toga, A. W. The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates. 2nd Edition. , Elsevier Science. (2008).
  20. Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
  21. Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
  22. Cheng, H., et al. Prolonged operative duration is associated with complications: a systematic review and meta-analysis. Journal of Surgical Research. 229, 134-144 (2018).
  23. Michikawa, T., et al. Automatic extraction of endocranial surfaces from CT images of crania. PLoS One. 12 (4), 0168516(2017).
  24. Soliman, A. S., et al. A realistic phantom for validating MRI-based synthetic CT images of the human skull. Medical Physics. 44 (9), 4687-4694 (2017).
  25. Blonde, J. D., et al. Customizable cap implants for neurophysiological experimentation. Journal of Neuroscience Methods. 304, 103-117 (2018).
  26. Overton, J. A., et al. Improved methods for acrylic-free implants in nonhuman primates for neuroscience research. Journal of Neurophysiology. 118 (6), 3252-3270 (2017).
  27. Lohmeier, J., Kaneko, T., Hamm, B., Makowski, M. R., Okano, H. atlasBREX: Automated template-derived brain extraction in animal MRI. Scientific Reports. 9 (1), 12219(2019).
  28. Ortiz-Rios, M., et al. Improved methods for MRI-compatible implants in nonhuman primates. Journal of Neuroscience Methods. 308, 377-389 (2018).
  29. Nishimura, Y., Perlmutter, S. I., Eaton, R. W., Fetz, E. E. Spike-timing-dependent plasticity in primate corticospinal connections induced during free behavior. Neuron. 80 (5), 1301-1309 (2013).
  30. Seeman, S. C., Mogen, B. J., Fetz, E. E., Perlmutter, S. I. Paired Stimulation for Spike-Timing-Dependent Plasticity in Primate Sensorimotor Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (7), 1935-1949 (2017).
  31. Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 122 (4), 1502-1517 (2019).
  32. Schweizer-Gorgas, D., et al. Magnetic resonance imaging features of canine gliomatosis cerebri. Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 180-187 (2018).
  33. Galvan, A., et al. Nonhuman Primate Optogenetics: Recent Advances and Future Directions. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10894-10903 (2017).
  34. Galvan, A., Caiola, M. J., Albaugh, D. L. Advances in optogenetic and chemogenetic methods to study brain circuits in nonhuman primates. Journal of Neural Transmission. 125 (3), 547-563 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 161

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved