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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die nachstehende Methode zielt darauf ab, ein umfassendes Protokoll für die Herstellung der nichtmenschlichen Primaten-Neurochirurgie (NHP) mit einer neuartigen Kombination aus dreidimensionalen (3D) Druckverfahren und MRT-Datenextraktion bereitzustellen.

Zusammenfassung

In diesem Beitrag skizzieren wir ein Verfahren zur chirurgischen Präparation, das die praktische Planung einer Vielzahl von Neurooperationen in NHPs ausschließlich anhand von Daten aus der Magnetresonanztomographie (MRT) ermöglicht. Dieses Protokoll ermöglicht die Generierung von 3D-gedruckten anatomisch genauen physikalischen Modellen des Gehirns und des Schädels sowie eines Agarose-Gel-Modells des Gehirns, das einige der mechanischen Eigenschaften des Gehirns modelliert. Diese Modelle können aus der MRT mit Gehirnextraktionssoftware für das Modell des Gehirns extrahiert werden, und benutzerdefinierter Code für das Modell des Schädels. Das Vorbereitungsprotokoll nutzt modernste 3D-Drucktechnologie, um Schnittstellen gehirn, schädelund formt für Gel-Gehirnmodelle herzustellen. Die Schädel- und Hirnmodelle können verwendet werden, um Hirngewebe im Schädel mit der Zugabe einer Kraniotomie im benutzerdefinierten Code zu visualisieren, was eine bessere Vorbereitung für Operationen ermöglicht, die direkt das Gehirn betreffen. Die Anwendungen dieser Methoden sind für Operationen im Zusammenhang mit neurologischer Stimulation und Aufzeichnung sowie Injektion konzipiert, aber die Vielseitigkeit des Systems ermöglicht eine zukünftige Erweiterung des Protokolls, Extraktionstechniken und Modelle auf ein breiteres Spektrum von Operationen.

Einleitung

Primatenforschung war ein entscheidender Schritt in der Entwicklung der medizinischen Forschung von Tiermodellen zu Studien am Menschen1,2. Dies gilt insbesondere für die Erforschung der Neurowissenschaften und der neuronalen Technik, da es eine große physiologische und anatomische Diskrepanz zwischen Nagetierhirnen und denen nichtmenschlicher Primaten (NHP)1,2,3gibt. Mit aufkommenden genetischen Technologien wie Chemogenetik, Optogenetik und Kalzium-Bildgebung, die genetische Modifikation von Neuronen erfordern, hat die neuronale Ingenieurforschung, die die neuronale Funktion in NHP untersucht, besondere Aufmerksamkeit als präklinisches Modell für das Verständnis der Gehirnfunktion2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. In den meisten Neurowissenschaftsexperimenten von NHP sind neurochirurgische Maßnahmen für die Implantation verschiedener Geräte wie Kopfpfosten, Stimulations- und Aufnahmekammern, Elektrodenarrays und optische Fenster4,5,6,7,10,11,13,14,15,17,18.

Aktuelle NHP-Labore verwenden eine Vielzahl von Methoden, die oft ineffektive Praktiken einschließlich sedieren des Tieres, um die Beine eines Kopfpfostens passen und nähern die Krümmung des Schädels um die Craniotomie-Stelle. Andere Labore passen den Kopfpfosten in der Chirurgie in den Schädel oder verwenden fortschrittlichere Methoden, um die notwendigen Messungen für die Implantation zu gewinnen, wie die Analyse eines NHP-Gehirnatlas und Magnetresonanz-Scans, um zu versuchen, Schädelkrümmungen2,10,11,16zu schätzen. Neurosurgerien in NHPs beinhalten auch Flüssigkeitsinjektionen, und Labore haben oft keine Möglichkeit, die projizierte Injektionsposition im Gehirn zu visualisieren2,4,5,13,14 ausschließlich auf stereotaxic Messungen und Vergleich mit MR-Scans. Diese Methoden haben eine gewisse unvermeidbare Unsicherheit, da sie nicht in der Lage sind, die physikalische Verträglichkeit aller komplexen Komponenten des Implantats zu testen.

Daher ist eine genaue nichtinvasive Methode für die neurochirurgische Planung in NHPs erforderlich. Hier stellen wir ein Protokoll und eine Methodik zur Vorbereitung von Implantations- und Injektionsoperationen bei diesen Tieren vor. Der gesamte Prozess stammt aus MRT-Scans, bei denen Gehirn und Schädel aus den Daten extrahiert werden, um dreidimensionale (3D) Modelle zu erstellen, die dann 3D-gedruckt werden können. Die Schädel- und Hirnmodelle können kombiniert werden, um sich auf Craniotomieoperationen sowie Kopfpfosten mit erhöhter Genauigkeit vorzubereiten. Das Gehirnmodell kann auch verwendet werden, um eine Form für das Gießen eines anatomisch genauen Gelmodells des Gehirns zu erstellen. Das Gel-Gehirn allein und in Kombination mit einem extrahierten Schädel kann verwendet werden, um für eine Vielzahl von Injektionsoperationen vorzubereiten. Im Folgenden beschreiben wir jeden der Schritte, die für die MRT-basierte Toolbox für die neurochirurgische Präparation erforderlich sind.

Protokoll

Alle tiertierischen Verfahren wurden vom University of Washington Institute for Animal Care and Use Committee genehmigt. Es wurden zwei männliche Rhesusmakaken (Affe H: 14,9 kg und 7 Jahre alt, Affe L: 14,8 kg und 6 Jahre alt) verwendet.

1. Bildaufnahme

  1. Transportieren Sie den Affen zu einem 3T MRT-Scanner und legen Sie das Tier in einen MR-kompatiblen stereotaxic Rahmen (Tabelle der Materialien).
  2. Zeichnen Sie den Standard T1 auf (Flip-Winkel = 8°, Wiederholungszeit/Echozeit = 7,5/3,69 s, Matrixgröße = 432 x 432 x 80, Erfassungsdauer = 103,7 s, Multicoil (Materialtabelle), Anzahl der Mittelwerte = 1, Scheibendicke = 1 mm) anatomische MR-Bilder.
    HINWEIS: Für eine erfolgreiche Schädelisolierung verwenden Sie die hier angewendeten MRT-Erfassungsparameter, um die Trennung zwischen Schädel und Gehirn zu maximieren.

2. Gehirnextraktion

  1. In der MR-Bildgebungssoftware zur Gehirnextraktion wählen Sie Open | Öffnen Sie Image. Laden Sie den in Schritt 1.2 erworbenen Scan T1 Quick Magnetization Prepared Rapid Gradient Echo (MPRAGE) in eine MR-Bildgebungssoftware (Tabelle der Materialien).
  2. Um das Gehirn zu extrahieren, wählen Sie unter dem Dropdown-Menü Plugins Brain extrahieren (BET). Extrahieren Sie bei einem Intensitätsschwellenwert um 0,5 bis 0,7, und legen Sie den Schwellenwert gradientauf wert auf 0 fest. Verwenden Sie die Extraktionsfunktion wiederholt bei sukzessive niedrigeren Intensitätsschwellen, bis der Scan nur die kortikale Anatomie enthält (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Dies ist ein iterativer Prozess, da die Software nicht für NHP Gehirne entwickelt wurde und die Extraktion nicht präzise ist
  3. Wählen Sie im Menü Bereich of Interest (ROI) Schwellenwert zum ROI aus und wählen Sie die Option für Shrink Wrap und 3D aus, um eine Bitmap des Gehirns zu erstellen. Dadurch wird das Volume in Binärbits aus einem Farbverlauf konvertiert, wodurch zukünftige Modellgenerierungsprozesse optimiert werden. Wählen Sie einen Schwellenwert (in der Regel um 600), um das Gehirn vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Dieser Schwellenwert kann gefunden werden, indem Sie den Mauszeiger über die graue Materie bewegen. Wählen Sie OK aus, um die Bitmap zu bilden.
  4. Um eine Oberfläche zu erstellen, wählen Sie Unter dem Bildmenü Fläche erstellen aus, und geben Sie den Schwellenwert ein, der zum Extrahieren des Gehirns in Schritt 2.3 verwendet wird. Wählen Sie dann OKaus. Die resultierende Oberfläche kann als Referenz für die Anpassung des Schwellenwerts verwendet werden, um die höchste Qualität der angestrebten Anatomie zu erzeugen (Abbildung 1C).
  5. Wählen Sie unter der Registerkarte Datei Speichern oder Speichern unteraus, und speichern Sie den extrahierten ROI des Gehirns als .nii oder .nii.gz Datei für die Erstellung des Modells des Gehirns.

3. Gehirnmodellierung

  1. Wählen Sie | Wählen Sie Dateien zum Hinzufügen und Laden des extrahierten Gehirns, das in der Datei .nii oder .nii gespeichert ist.gz Dateityp in der medizinischen Bildverarbeitungssoftware ( Tabelle derMaterialien).
  2. Zeigen Sie mit der Maus auf das Dropdown-Menü "Willkommens- und Slicer" in der Symbolleiste der Module, und wechseln Sie zu allen Modulen. Wählen Sie in diesem Menü die Editor-Funktionalität aus. Klicken Sie auf OK in der Popup-Warnung.
  3. Wählen Sie im Menü Editor-Modul schwellenwertisch aus, und passen Sie die Schieberegler für den Schwellenwertbereich an, damit der Teil der Bitmap, der das Gehirn enthält, in allen drei Slices hervorgehoben wird. Beim Laden einer Bitmap wird durch Anpassen beider Schieberegler auf den Wert 1 das gesamte Gehirn ausgewählt. Wählen Sie Anwendenaus.
  4. Öffnen Sie das Modellherstellermodul, und wählen Sie im Dropdown-Menü Eingabevolumina die in Schritt 3.3 generierte Bitmapdatei aus. Wählen Sie unter Modelle die Option Neue Modellhierarchie erstellenaus. Nachdem Sie den Namen des Modells der Hierarchie zugewiesen haben, wählen Sie Anwenden aus, um das Volume zu erstellen.
  5. Speichern Sie die Datei im .stl-Format.
  6. Um das Gehirnmodell weiter zu modifizieren, laden Sie die .stl-Datei als Grafikkörper in computergestützte Design-Software (Tabelle der Materialien)
    HINWEIS: Dies kann eine Weile dauern, da die importierten Netz-Gehirnoberflächen oft recht komplex sind.
  7. Sobald die Datei importiert wurde, klicken Sie im Feature-Baum auf der linken Seite des Bildschirms auf die untergeordneten Elemente des Grafikkörpers und unterdrücken Sie unnötige Grafikfeatures, bis nur noch die Features mit dem Gehirn in der Datei verbleiben. Speichern Sie die verbleibende Datei als .prt für weitere Manipulationen und als .stl für den 3D-Druck. Speichern Sie die verbleibende Datei als .prt für weitere Manipulationen und als .stl für den 3D-Druck.

4. Gehirnformung

  1. Laden Sie das extrahierte Gehirnmodell aus Abschnitt 3 in die computergestützte Entwurfssoftware, indem Sie die .prt-Datei öffnen. Wählen Sie im Menü Features im Einfügemenü die Option In Netzkörper konvertierenaus. Wählen Sie den Grafikkörper des Gehirns aus und konvertieren Sie ihn.
  2. Erstellen einer rechten und linken Form des gesamten Gehirns
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Skizze, und wählen Sie die obere Ebene als Skizzierebene aus. Zeichnen Sie ein Rechteck, das entweder die gesamte rechte oder linke Gehirnhälfte enthält. Wählen Sie das Extrudieren-Boss/Basis-Feature aus, während Sie in der Skizze ein kubisches Rechteck extrudieren, um den oberen Teil des Gehirns zu enthalten.
      HINWEIS: Der Würfel muss möglicherweise in zwei Richtungen extrudiert werden, um die gesamte Hemisphäre zu enthalten. Dies liegt daran, dass der Nullpunkt, an dem sich die Extrusionsebene befindet, innerhalb des Gehirnmodells liegen kann. Das Extrudieren in beide Richtungen stellt sicher, dass die Form das gesamte Volumen des Interesses umfasst.
    2. Wählen Sie im Menü "Features" im Menü "Einfügen" die Option In Netzkörper konvertierenaus. Wählen Sie den extrudierten Cube im Ordner Volumenkörper aus, und konvertieren Sie ihn. Um den negativen Raum zu erstellen, subtrahieren Sie das Modell des Gehirns vom neu extrudierten Würfel mit dem Feature Kombinieren und wählen Sie die Option Subtrahieren aus.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 und 4.2.2 für die andere Gehirnhälfte (links oder rechts) und speichern Sie die resultierenden Dateien als .stl für den 3D-Druck und als .prt für weitere Manipulationen.
  3. Erstellen einer rechten und linken Form der oberen Hälfte des Gehirns.
    1. Erstellen Sie eine Skizze in der oberen Ebene, und zeichnen Sie ein Rechteck, das entweder die gesamte rechte oder linke Gehirnhälfte enthält. Wählen Sie das Extrudieren-Boss/Basis-Kein aus, während Sie in der Skizze befinden, und extrudieren Sie mit dem ausgewählten Feature Versatz aus Ebene. Versetzen Sie die Extrusion bis zu einer Entfernung, in der es keine überhängenden Konturen in der Anatomie des Gehirns gibt, und erfassen Sie nur die obere Anatomie. Wählen Sie im Menü "Features" im Menü "Einfügen" die Option In Netzkörper konvertierenaus. Wählen Sie den extrudierten Cube im Ordner Volumenkörper aus, und konvertieren Sie ihn.
    2. Um den negativen Raum zu erstellen, subtrahieren Sie das Modell des Gehirns vom neu extrudierten Würfel mit dem Feature Kombinieren und wählen Sie die Option Subtrahieren aus.
    3. Erstellen Sie eine Skizzenebene auf der dorsalen Seite der Form, und wählen Sie Entitäten konvertieren aus, und wählen Sie dann die Skizze aus Schritt 4.3.1 aus.
    4. Wählen Sie das Extrudieren-Boss/Basis-Feature in der Skizze aus, und extrudieren Sie den Volumenkörper, wenn Sie die Option "Blindextrudieren" ausgewählt haben, um die subtrahierte Gehirnanatomie vollständig in der Form einzuschließen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1-4.3.4 für die andere Gehirnhälfte (links oder rechts) und speichern Sie die resultierenden Dateien als .stl für den 3D-Druck und als .prt für weitere Manipulationen.
  4. Durch Ändern der Abmessungen und Position des Würfels und nach demselben Protokoll (Schritte 4.1 und 4.2) erstellen Sie Formen, die verschiedene Teile des Gehirns enthalten.
  5. Verwenden Sie für den 3D-Druck eine Infill-Dichte von 70 % und erhöhen Sie die Dicke der Außenhülle des Drucks, um die Leckage des Formmaterials zu minimieren. Wenn es Lücken oder Defekte im Druck gibt, füllen Sie sie mit Nagellack oder einem anderen Bindemittel.

5. Schädelmodellierung

  1. Importieren Sie das QUICK MPRAGE MRT aus Schritt 1.2 als DICOM-Datei in die Matrix-Manipulationssoftware. Die DICOM-Datei kann sich in separaten 2D-Frames befinden. Wenn dies der Fall ist, kombinieren Sie alle Frames in einer 3D-Matrix. Stellen Sie sicher, dass in jedem 2D-Frame der Matrix ein koronales Segment angezeigt wird.
  2. Erstellen Sie eine binäre Maske, indem Sie die 3D-Matrix mit einem größer als dem Operator für einzelne Pixelwerte schwellenwertig erstellen. Passen Sie den Schwellenwert so an, dass die Schädelanatomie von der Maske erfasst wird (siehe Supplemental Coding File CalibrateMask).
    HINWEIS: Die Maske enthält vier verschiedene Ebenen. Von außen werden sie als "außen", "Muskulatur", "Schädel" und "Gehirn" bezeichnet. In diesem Stadium sind "außen" und "Schädel" 0 in der Maske, und "Muskulatur" und "Gehirn" sind 1's.
  3. Um die "Muskulatur"-Schicht zu entfernen, verarbeiten Sie jeden Frame aus der 3D-Maske separat, indem Sie iterativ ein 2D-Slice aus der Maske greifen (d. h. 3D_Mask(:,:,1)).
    1. Wählen Sie für jeden Frame 0 Pixel aus den Ecken des Rahmens in der "Außen"-Ebene als "Seed" aus. Suchen Sie dann nach benachbarten 0's, bis Sie auf ein 1 Pixel stoßen. Fahren Sie mit der Suche fort, bis keine 0 es mehr gefunden werden können. Konvertieren Sie alle angeschlossenen 0 es in 1's. Dies geschieht mit der Matlab-Funktion "imfill", wobei die Ein- und Ausgänge [MASK2] = imfill (MASK1,LOCATIONS,CONNECTIVITY) sind, wobei MASK1 Ihre originale Maske und MASK2 die gefüllte Maske ist (siehe Supplemental Coding File FillExterior).
  4. Einige Schädelinformationen gehen während der Entfernung verloren. Um den Informationsverlust zu verringern, führen Sie Schritt 5.3 in allen drei Dimensionen der Daten aus, und trennen Sie sie.
    HINWEIS: Nun sind sowohl "außen" als auch "Muskulatur" 1 und werden als "außen" betrachtet. Die Maske enthält nun drei unterschiedliche Schichten, "außen", "Schädel" und "Gehirn". "Outside" und "brain" sind 1, und "Schädel" ist 0's.
  5. Invertieren Sie die Werte der Maske mit dem Operator s (d. h. MASK2 = .MASK1). Jetzt ist "Schädel" 1 und "außen" und "Gehirn" sind 0's.
  6. Die 1er, die sich in jeder Maske berühren, können als "Objekte" betrachtet werden. Erstellen Sie einen Index aller Objekte in jeder Maske mit der Matlab-Funktion "bwconncomp", wobei die Ein- und Ausgänge [CC] = bwconncomp(MASK) sind, wobei MASK die 3D-Maskenmatrix ist und CC ein Strukturobjekt ist, das die Indexwerte für jedes Objekt, die Anzahl der Objekte und die Größe der Matrix enthält. Entfernen Sie für jede Maske alle Objekte mit Ausnahme des größten, das die meisten Voxel enthält, indem Sie die Werte der kleineren Objekte auf 0 s setzen (siehe Zusätzliche Codierungsdatei RemoveNoise).
  7. Fügen Sie die Masken hinzu, die aus jedem Durchlauf erstellt wurden (siehe Ergänzungscodierungsdatei MergeMasks).
  8. Skalieren Sie das Gehirn auf eine konsistente Auflösung.
    1. Vergleichen Sie im DICOM-Header die Schrittgröße zwischen jedem Frame des MRT mit den Abmessungen jedes Pixels.
    2. Wenn diese Werte unterschiedlich sind, definieren Sie einen Skalierungsfaktor, um die Auflösungsdifferenz zwischen Schrittgröße und Pixelgröße für jeden Voxel auszugleichen. Wenn z. B. jeder Rahmen 1 mm voneinander entfernt ist und die Pixelabmessung 0,33 mm x 0,33 mm beträgt, beträgt der Skalierungsfaktor 3.
    3. Fügen Sie der 3D-Maske zusätzliche leere Voxel hinzu, bis die Dimension mit der niedrigsten Auflösung der Maske um einen Faktor größer ist, der durch den Skalierungsfaktor definiert wird (siehe Zusätzliche Codierungsdatei "ScaleMask").
    4. Intervenieren Sie die Werte in der Maske linear, bis die Maske den neuen Raum ausfüllt.
    5. Exportieren Sie Schädel als .stl-Datei oder ähnlichen Dateityp für den 3D-Druck.

6. Craniotomie-Erstellung im 3D-Schädelmodell

  1. Anhand der MRT-Datei aus Schritt 5.1 können Sie manuell die ungefähre Lage der Kraniotomie anhand anatomischer Landmarken identifizieren, die im Makaken-Gehirnatlas (z.B. Zentralsulkus) gefunden wurden19.
    1. Zeigen Sie ein einzelnes Segment der 3D-Matrix an (ähnlich Schritt 5.3).
    2. Scannen Sie manuell vorwärts oder rückwärts durch die 3D-Matrix, bis erkennbare anatomische Landmarken gefunden sind.
    3. Speichern Sie die Rahmennummer als z-Koordinate (d. h. 3D_Mask(:,:,z)
    4. Verwenden Sie ein Datenauswahlwerkzeug, um die x- und y-Koordinaten eines einzelnen Punktes auf diesem Frame zu speichern, damit die Kraniotomie mit der Matlab-Funktion "getpts" zentriert werden kann, wobei die Ein- und Ausgänge [x,y] = getpts sind. "getpts" öffnet eine Benutzeroberfläche, klicken Sie auf den gewünschten Frame (siehe Supplemental Coding File LocateCraniotomy).
  2. Konvertieren Sie den Radius der beabsichtigten Kraniotomie von mm in Voxel mit den Informationen im DICOM-Header.
  3. Mit dem in Schritt 6.1 angegebenen Punkt als Mittelpunkt, setzen Sie alle Voxel innerhalb des in 6.2 definierten Radius in der Maske von Schritt 5.8.4 mit der Supplemental Coding File Craniotomy, wobei die Ein- und Ausgänge [craniotomyMask] = Craniotomy(Maske, x, y, z, radius, X, Y, Z, resolution)where cranitomyMask is a 3D matrix with a the craniotomy removed, mask is the initial 3D matrix, x,y,z are the center point coordinates of the craniotomy, radius is the radius of the craniotomy, X,Y,Z are grid vectors of the 3D matrix, and resolution is your radius defined in step 6.2 (siehe Supplemental coding file Craniotomy).
  4. Wiederholen Sie bei mehreren Craniotomien die Schritte 6.1 x 6.3 für jede einzigartige Kraniotomie.
  5. Exportieren Sie Schädel als .stl-Datei oder ähnlichen Dateityp für den 3D-Druck.

7.3D Druck

HINWEIS: Es werden zwei Arten von 3D-Druckern für physische Prototypen (Materialtabelle) verwendet. Für die folgenden Spezifikationen sollten alle Einstellungen für 3D-Drucker und Drucksoftware standardmäßig verwendet werden, sofern nicht anders angegeben.

  1. Um die Prototypen und Formen zu drucken, verwenden Sie einen Standard-PLA-Drucker (Tabelle der Materialien) und erstellen Sie den G-Code mit den folgenden Drucker- und Softwareeinstellungen: Innendichte >50% (dies ist besonders wichtig für die Formen, da sie Flüssigkeit halten müssen), schnelles Waben-Innenfüllmuster, geradliniges externes Füllmuster, Plattentemperatur = 50 °C und Extrudertemperatur = 230 °C.
  2. Um Modelle von Gehirn und Schädel mit höherer Genauigkeit zu drucken, verwenden Sie einen industriellen Drucker, um einen kombinierten Druck von Acrylnitrilbutadien-Styrol (ABS) für das Modell und einem auflösbaren Trägermaterial(Table of Materials )zu machen. Erstellen Sie dann den G-Code und mit den folgenden Druckereinstellungen: Füllstil Sparse - High Density. Alle anderen Einstellungen werden automatisch auf die entsprechende Standardeinstellung festgelegt.
    1. Lösen Sie das Modell in Stützlösungsmittel (Tabelle der Materialien) für 12 h.
  3. Nachdem Sie die entsprechenden Druckereinstellungen implementiert haben, drücken Sie Start, und beobachten Sie die erste Schicht des Drucks, um sicherzustellen, dass die Basisschicht sauber und gleichmäßig ist.
  4. Nach dem 3D-Druck der Formen, patchen Sie alle sichtbaren Löcher mit Nagellack (Tisch aus Materialien) um eine engere Dichtung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die 3D-gedruckten Gehirn- und Schädelmodelle können kombiniert werden, indem das Gehirnmodell in den offenen Schädelboden eingefügt wird. Das Entfernen der Augenanatomie kann die Platzierung des Gehirnmodells erleichtern, ohne wichtige Informationen zu verlieren. Wenn es innerhalb des Schädels platziert wird, richtet sich das Gehirn natürlich an der anatomisch korrekten Position aus.

8. Herstellung von Agarose

  1. Das Agarpulver (Materialtabelle) und das Johannisbrotkernmehlpulver (Materialtabelle) in einem Verhältnis von 1:4 nach Masse mischen.
  2. Kombinieren Sie das Pulvergemisch mit 1x Phosphatgepufferte Lösung (Materialtabelle) zu einer 0,6%igen Konzentrationslösung in einem Erlenmeyerkolben.
    HINWEIS: Die von anderen Labors verwendeten Konzentrationen liegen in einem Bereich von 0,5%-0,6%20,21.
  3. Stellen Sie die Mikrowelle auf maximale Leistung ein und legen Sie den Kolben, der die Lösung enthält, für 2 min in die Mikrowelle.
  4. Beobachten Sie die Lösung. Wenn die Lösung zu sprudeln beginnt, stoppen Sie die Mikrowelle und Timer, entfernen Sie den Kolben, und wirbeln Sie kräftig. Stellen Sie den Kolben wieder in die Mikrowelle und setzen Sie die Mikrowelle und den Timer fort.
    HINWEIS: Der Zweck besteht darin, die Lösung zu erwärmen, ohne das Volumen durch Verdunstung während des Kochens signifikant zu reduzieren.
  5. Wiederholen Sie Schritt 8.4, bis die zwei Minuten abgeschlossen sind.
  6. Entfernen Sie den Kolben und halten Sie wirbeln, um zu verhindern, dass die Lösung im Kolben gesetzt wird.
  7. Laufen Sie kaltes Wasser auf der Außenseite des Kolbens, um die Lösung zu kühlen, während sie wirbelt. Kühlen Sie die Lösung, bis die Außenseite des Kolbens heiß, aber erträglich und sicher ist, um zu verhindern, dass die Lösung die Kunststoffform in den folgenden Schritten verformt.
  8. Wirbeln Sie den Kolben beim Transport der Lösung zur Form, um eine vorzeitige Aushärtung zu vermeiden.

9. Agarose-Formteil

ANMERKUNG: Der unten beschriebene Agarose-Formprozess ist für die gesamte Halbhemisphäre und die obere Halbhalbkugel gleich

  1. Gießen Sie die Agarose-Lösung in eine der Gehirnformen, bis sie voll ist. Fahren Sie fort, um die verbleibende Lösung im Kolben zu wirbeln.
  2. Überwachen Sie den Lösungsgrad in der Form auf Leckagen. Füllen Sie die Form nach Bedarf, da die Einstellung Agarose alle Lecks in der Form abdichten wird.
  3. Lassen Sie die Lösung in der Form ungestört bei Raumtemperatur sitzen, bis die Lösung eingestellt und zu einem Feststoff gehärtet hat.
    HINWEIS: Während die Wartezeiten je nach Lösungsvolumen und anderen Faktoren variieren können, wird festgestellt, dass 2 h eine zuverlässige Wartezeit ist.
  4. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Gelmodell vorsichtig aus der Form zu entfernen. Seien Sie strategisch mit der Position der Spachtel-Einfügung in die Form, um mögliche Verformungen an der Oberfläche der Form zu verhindern.
  5. Um den natürlichen Verdampfungsprozess und die Exposition gegenüber biologischen Arbeitsstoffen zu verlangsamen, legen Sie das Gelmodell in einen verschlossenen Behälter in einen Kühlschrank.

10. Injektion in Agarose-Gel-Modell

  1. Bereiten Sie die Pumpe für die Infusion vor und fixieren Sie sie in einem stereotaxic Arm auf einem stereotaxic Rahmen (Tabelle der Materialien). Positionieren Sie die Pumpe auf die richtige Einspritzbahn und Position normal zur Oberfläche des Gelmodells ab Abschnitt 9.
  2. Füllen Sie eine 250-L-Spritze(Materialtabelle) mit DI-Wasser. Montieren Sie die Spritze auf die Pumpe (Materialtabelle).
    HINWEIS: Vor dem Zeichnen eines Farbstoffs sollte DI-Wasser die Injektionskanüle (Materialtabelle) vollständig füllen. Auf diese Weise, wenn der Farbstoff durch die Kanüle gezogen wird, gibt es keine Kompression oder Ausdehnung der Luft durch den Kolben, die das Injektionsvolumen beeinflussen könnte.
  3. Verwenden Sie den Pumpentreiber (Materialtabelle), um die Lebensmittelfarbe (Materialtabelle) in die Spritze zum Zielvolumen für die Injektion zu ziehen. Injizieren Sie die Lebensmittelfarbe langsam, bis sich an der Spitze der Kanüle eine kleine Perle bildet, um zu verhindern, dass Luftblasen in das Gel injiziert werden. Trocknen Sie die Perle von der Spitze der Kanüle.
  4. Positionieren Sie das Gelmodell unter der Kanüle. Senken Sie die Kanüle, bis die Spitze die Oberfläche des Gelmodells berührt. Beachten Sie die Messungen am stereotaxic Arm.
  5. Senken Sie die Kanüle schnell und reibungslos in das Gelmodell und stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Gels um die Kanüle herum versiegelt ist.
  6. Führen Sie die Pumpe aus und beobachten Sie die Ausbreitung der Lebensmittelfärbung, bis das Zielvolumen injiziert wird. Beginnen Sie mit einer Durchflussrate von 1 l/min und erhöhen Sie jede Minute auf 5 l/min mit Schritten von 1 l/min. Die Verbreitung der Lebensmittelfärbung im Gel ist eine Annäherung an die Ausbreitung eines viralen Vektors im Gehirn.
  7. Entfernen Sie die Kanüle schnell und reibungslos aus dem Gel.
  8. Erfassen Sie Bilder der Verbreitung der Lebensmittelfärbung mit einem fotografischen Gerät (Materialtabelle) und messen Sie physisch die Abmessungen der Embolie, um das Ellipsoidvolumen der Injektion zu berechnen. Dieser Ansatz ist aufgrund der transparenten Natur des Gels möglich.

Ergebnisse

Die Manipulation und Analyse von MRTs als präoperative Craniotomie-Planungsmaßnahme wurde in denletzten2,5,10,16erfolgreich eingesetzt. Dieser Prozess wurde jedoch durch die Zugabe der 3D-Modellierung des Gehirns, schädel, und Craniotomie erheblich verbessert. Wir waren in der Lage, erfolgreich ein anatomisch genaues physikalisches Modell des Gehirns zu erstellen, das den Interessenbereich f...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine Toolbox zur Vorbereitung von Neurosurgerien in NHPs unter Verwendung von physikalischen und CAD-Modellen der Schädel- und Hirnanatomie, die aus MR-Scans extrahiert wurden.

Während die extrahierten und 3D-gedruckten Schädel- und Hirnmodelle speziell für die Vorbereitung von Craniotomieoperationen und Kopfpfostenimplantationen entwickelt wurden, eignet sich die Methodik für mehrere andere Anwendungen. Wie bereits beschrieben, ermöglicht das physikalische Mode...

Offenlegungen

Die Autoren haben derzeit keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde vom Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development der National Institutes of Health unter der Award-Nummer K12HD073945, dem Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), dem Center for Neurotechnology (CNT, einem National Science Foundation Engineering Research Center unter Grant EEC-1028725) und der University of Washington Royalty Research Funds unterstützt. Die Finanzierung der Macknik- und Martinez-Conde-Labore für dieses Projekt erfolgte durch einen BRAIN Initiative NSF-NCS Award 1734887 sowie NSF Awards 1523614 & 1829474 und SUNY Empire Innovator Scholarships an jeden Professor. Wir danken Karam Khateeb für seine Hilfe bei der Agarose-Vorbereitung und Toni J Huan für die technische Hilfe.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Printing Software (GrabCAD Print)StratasysVersion 1.36Used for High quality 3D printing
3D Printing Software (Simplify 3D)Simplify3DVersion 4.1Used for PLA 3D printing
AgaroseBenchmark ScientificA1700Used for making gel brains
Black Nail PolishL.A. ColorsCNP637Used for gel molding
Cannula (ID 450 um, OD 666 um)Polymicro Technologies1068150625Used to inject dye into gel brain
Catheter ConnectorB BraunPCC2000Perifix for 20-24 Gage epidural catheters; Units per Cs 50
Dremel 3D Digilab 3D45 printerDremelF0133D45AAUsed for prototyping in PLA
ECOWORKSStratasys300-00104Used to dissolve QSR support structures
Erlymeyer flaskPyrex4980Used for gel molding
Ethyl cyanoacrylateThe Original Super Glue Corp.15187Used to make combined cannula
Graduated cylinder3023Used for gel molding
HATCHBOX PLA 3D Printer FilamentHATCHBOX3DPLA-1KG1.75-RED/3DPLA-1KG1.75-BLACK1kg Spool, 1.75mm, Red/Black
Locust Bean GumModernist Pantry1018Gumming agent for gel brain mixtures
MATLABMathWorksR2019bUsed for skull extraction
McCormick Yellow Food ColorMcCormickUsed for dye injection
MicrowavePanasonicNN-SD975SUsed for agarose curing
MR Imaging Software (3D Slicer)3D SlicerVersion 4.10.2Used for 3D model generation
MR Imaging Software (Mango with BET plugin)Reasearch Imaging InstituteVersion 4.1Used for brain extraction
Philips Acheiva MRI SystemPhilips4522 991 19391Used to image non-human primates
Phosphate Buffered SolutionGibco70011-04410X diluted with DI water to 1X
PumpWPIUMP3T-1Used for dye injection
Pump driverWPIUMP3T-1Used for dye injection
RefrigeratorGeneral ElectricUsed to preserve agarose gel
Scientific SpatulaVWR82027-494Used to extract gel molds
SolidWorksDassault Systemes2019
Stratasys ABS-M30 filamentStratasys333-60304Used for high quality 3D printing
Stratasys F170 3D printerStratasys123-10000Used for high quality 3D printing
Stratasys QSR supportStratasys333-63500Used to create supports with ABS model
SyringeSGESGE250TLLUsed for dye injection

Referenzen

  1. Phillips, K. A., et al. Why primate models matter. American Journal of Primatology. 76 (9), 801-827 (2014).
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