نمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام مع زرع طعم الورم الصلب في العظام

Summary

لا تتطور نماذج ورم خبيث في العظام إلى ورم خبيث بشكل موحد أو بنسبة 100٪. يمكن أن يؤدي الحقن المباشر داخل الخلايا السرطانية العظمية إلى انصمام الرئة. نقدم تقنيتنا لنمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام ، مما يؤدي إلى النقش والنمو القابل للتكرار.

Abstract

تؤدي أورام العظام الأولية أو النقائل العظمية الناتجة عن الأورام الصلبة إلى آفات مؤلمة في حالة العظم أو عظمية الأرومات أو مختلطة من العظم / العظم. هذه الآفات تضر بنية العظام ، وتزيد من خطر الكسر المرضي ، وتترك للمرضى خيارات علاج محدودة. تنتقل أورام العظام الأولية إلى أعضاء بعيدة، مع بعض الأنواع القادرة على الانتشار إلى مواقع الهيكل العظمي الأخرى. ومع ذلك ، تشير الأدلة الحديثة إلى أنه مع وجود العديد من الأورام الصلبة ، قد تكون الخلايا السرطانية التي انتشرت إلى العظام هي المصدر الرئيسي للخلايا التي تنتقل في النهاية إلى أنظمة الأعضاء الأخرى. تتضمن معظم نماذج الفئران الجينية أو xenograft لأورام العظام الأولية الحقن داخل العظم (تقويم العظام) لمعلقات الخلايا السرطانية. تعتمد بعض النماذج الحيوانية للورم الخبيث الهيكلي من الأورام الصلبة أيضا على الحقن المباشر للعظام ، بينما يحاول البعض الآخر تلخيص خطوات إضافية من سلسلة النقيلي العظمي عن طريق حقن الخلايا داخل الأوعية الدموية أو في عضو الورم الرئيسي. ومع ذلك ، لا يصاب أي من هذه النماذج بورم خبيث في العظام بشكل موثوق أو بنسبة 100٪. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الحقن المباشر داخل العظم للخلايا السرطانية يرتبط بانصمام الورم المحتمل في الرئة. هذه الخلايا السرطانية الصمية تنقش ولكنها لا تلخص الشلال النقيلي. أبلغنا عن نموذج فأر للساركوما العظمية حيث يتم زرع شظايا الورم الطازجة أو المحفوظة بالتبريد (تتكون من الخلايا السرطانية بالإضافة إلى السدى) مباشرة في الساق القريبة باستخدام تقنية جراحية طفيفة التوغل. طورت هذه الحيوانات نقشا قابلا للتكرار ، ونموا ، وبمرور الوقت ، انحلال العظام وورم خبيث في الرئة. تتمتع هذه التقنية بتعدد الاستخدامات لاستخدامها في نمذجة ورم خبيث في عظم الورم الصلب ويمكنها بسهولة استخدام الطعوم التي تتكون من نوع واحد أو عدة أنواع من الخلايا ، والخلايا المعدلة وراثيا ، والطعوم الخارجية المشتقة من المريض ، و / أو الخلايا المصنفة التي يمكن تتبعها عن طريق التصوير البصري أو المتقدم. هنا ، نوضح هذه التقنية ، ونمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام.

Introduction

أصبحت نماذج الفئران للأمراض البشرية والحيوانية شائعة بشكل متزايد في البحوث الطبية الحيوية. فائدة استخدام الفئران في هذا السياق هي أن تشريحها وعلم وظائف الأعضاء متشابهان جدا مع البشر. لديهم فترة حمل قصيرة نسبيا ووقت في حياة ما بعد الولادة لتحقيق النضج ، ويرتبطون إلى حد كبير بتكلفة منخفضة نسبيا وسهولة السكن ، وإن كانت تكاليف التطوير أو الشراء المتزايدة مرتبطة بدرجات أكبر من التعديل الوراثي و / أو نقص المناعة و / أو إضفاء الطابع الإنساني¹. يؤدي استخدام السلالات الفطرية إلى وجود مجموعة موحدة إلى حد كبير قبل إدراج الدراسة. تشير المعرفة الكاملة للجينوم الخاص بهم إلى درجة عالية من التشابه مع البشر. تم تحديد الأهداف الجزيئية المتعامدة للعديد من عمليات المرض في جينوم الفئران وهناك الآن مكتبة واسعة من الكواشف الخاصة بالفئران التي يمكن الحصول عليها بسهولة. لذلك ، فإنها توفر الفرصة للتحليل عالي الإنتاجية نسبيا بطريقة أسرع وأقل تكلفة عند مقارنتها بالنماذج الحيوانية الأكبر¹. بالإضافة إلى ذلك ، مع ظهور استراتيجيات التحرير الجيني التي تسمح بالإفراط في التعبير أو حذف جينات معينة إما على مستوى العالم أو بطريقة محددة لنوع الخلية و / أو بشكل تأسيسي أو بطريقة مستحثة ، فإنها تمثل نظاما نموذجيا مفيدا بيولوجيا للغاية للتحقيق في الأمراض البشرية والحيوانية².

السرطان هو أحد المجالات التي تتمتع فيها نماذج الفئران بفائدة كبيرة. تعتمد نماذج الفئران الجينية للسرطان على تعديل التعبير عن الجينات المسرطنة أو الجينات المثبطة للورم ، بمفردها أو مجتمعة ، حتى تخضع الخلايا للتحول السرطاني. كما يتم حقن خطوط الخلايا السرطانية الأولية أو الثابتة في الفئران. لا يزال إدخال خطوط الخلايا أو الأنسجة من البشر أو الأنواع الحيوانية الأخرى ، بما في ذلك الفئران ، هو النموذج الأكثر استخداما للسرطان في الجسم الحي. يتم استخدام الخلايا والأنسجة من الأنواع غير المتشابهة (الطعوم الخارجية) في الفئران التي تعاني من نقص المناعة^{بشكل شائع 2}. ومع ذلك ، فإن استخدام خلايا أو أنسجة ورم الطعم الخيفي حيث يكون كل من المضيف والمتلقي من نفس النوع يسمح بالتفاعل مع جهاز مناعي سليم عند دمجه مع نفس سلالة الفأر المضيف في الأنظمة الجينية³.

تؤدي أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام من الأورام الصلبة إلى آفات مؤلمة تنحلالية للعظم أو عظمية أو مختلطة / تنحلية عظمية ^3,4. هذه الأورام تضر بنية العظام ، وتزيد من خطر الكسر المرضي ، وتترك للمرضى خيارات علاج محدودة. تنتقل أورام العظام الأولية إلى أعضاء بعيدة، مع بعض الأنواع القادرة على الانتشار إلى مواقع الهيكل العظمي الأخرى. في مرضى سرطان الثدي ، العظام هي الموقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث الأول والموقع الأول الأكثر شيوعا لعرض المرض^{النقيلي 5,6}. بالإضافة إلى ذلك ، توجد الخلايا السرطانية المنتشرة (DTCs) في نخاع العظم قبل تشخيص ورم خبيث في الأعضاء الأخرى وتتنبأ بتطوره⁷. لذلك ، يعتقد أن الخلايا السرطانية الموجودة في العظام هي مصدر الخلايا التي تنتقل في النهاية إلى أنظمة الأعضاء الأخرى. توجد العديد من نماذج الفئران من ورم خبيث الورم الصلب التي تطور ورم خبيث في الغالب في الرئة والغدد الليمفاوية ، واعتمادا على نوع الورم وتقنية الحقن ، من المحتمل أن تكون أنظمة الأعضاء الأخرى³. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران من ورم خبيث العظام تفتقر إلى ذلك بشكل موثوق ، وتنتج بشكل متكرر ورم خبيث هيكلي خاص بالموقع وتطور ورم خبيث في العظام قبل أن تصل الفئران إلى معايير الإزالة المبكرة من عبء الورم الأولي أو ورم خبيث إلى أعضاء أخرى. لقد أبلغنا عن نموذج للساركوما العظمية لورم العظم الأساسي الذي يعتمد على الزرع الجراحي للطعم الخيفي للورم الصلب في الساق القريبة من الفئران⁸. تشكلت أورام العظام في 100 ٪ من الفئران و 88 ٪ وضعت ورم خبيث رئوي. يتجاوز حدوث ورم خبيث هذا ما يتم الإبلاغ عنه سريريا بشكل شائع في الأشخاص (~ 20-50٪) ، ولكنه ذو أهمية كبيرة لأن الرئة هي الموقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث للساركوما العظمية⁹،^10،11. في حين أن هذا النموذج مفيد في نمذجة أورام العظام الأولية ، إلا أنه يتمتع أيضا بفائدة كبيرة في نمذجة ورم خبيث في العظام من أورام صلبة أخرى مثل أورام الثدي والرئة والبروستاتا والغدة الدرقية والكبد والكلى والجهاز الهضمي.

كان الأساس المنطقي لتطوير هذا النموذج هو تطوير بديل للحقن التقليدي داخل العظم عادة في عظم الساق القريب أو عظم الفخذ البعيد لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيث^{في العظام 12}. كان هدفنا الأساسي هو التخفيف من القيود المعروفة لهذه التقنية ، أي انصمام الورم في الرئة. ينتج عن هذا تطعيم هذه الخلايا السرطانية الصمية و "ورم خبيث اصطناعي" لا يلخص الشلال النقيلي الكامل من ورم عظمي أولي راسخ ينتقل إلى الرئتين ^8,13. سيكون هذا هو الوضع أيضا عندما ينتشر ورم خبيث عظمي ثابت إلى موقع بعيد. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير هذه التقنية أيضا لإنتاج نموذج لورم خبيث في العظام من شأنه أن يضمن زيادة حدوث التطعيمات ونمو الأورام في العظام وفي موقع موحد عند مقارنتها بتقنيات الحقن التقويمي أو داخل الأوعية. هذا النموذج له مزايا مميزة على هذه التقنيات الموصوفة. يتضمن هذا النموذج التوصيل المتحكم فيه والمتسق للخلايا السرطانية إلى العظام. كما أنه يتجنب ورم خبيث في الرئة بعد الانصمام الرئوي ويؤسس مجموعة دراسة موحدة أساسية. هناك فائدة من الأورام الخاصة بالموقع مع هذا النموذج دون التعرض لخطر معايير الإزالة المبكرة الناتجة عن الأورام الأولية أو ورم خبيث إلى الأعضاء الأخرى. أخيرا ، هذا النموذج له فائدة كبيرة للتعديل ، بما في ذلك استخدام الطعوم الخارجية المشتقة من المريض.

النموذج المقدم له أوجه تشابه مع الحقن المباشر لتعليق الخلية في العظام باتباع نهج جراحي متبوعا إما بالحقن عبر القشرة أو التسليم في تجويف النخاع بعد إحداث عيب صغير في القشرة (مع أو بدون توسيع تجويف النخاع)⁸،¹⁴،¹⁵،^16،17. ومع ذلك ، فإن زرع طعم خيفي للورم يجعل هذه التقنية مختلفة بشكل واضح. لذلك ، كان الغرض من هذا التقرير هو إظهار هذا النموذج لأورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام من الأورام الصلبة ، والذي يتغلب على العديد من قيود النماذج الموصوفة سابقا. المجموعات البحثية ذات الخبرة في زراعة الخلايا ، ونماذج الفئران ، وتخدير الفئران وجراحتها ، وتشريح الفئران مجهزة تجهيزا جيدا لإعادة إنتاج تقنيتنا لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في الفئران.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كامبريدج ، كامبريدج ، المملكة المتحدة.

1. إعداد خطوط الخلايا

1. تنمو خطوط الخلايا وفقا لبروتوكولات زراعة الخلايا القياسية في المختبر لزراعة الخلايا التقليدية أو الحقن في الفئران. البروتوكولات القياسية المستخدمة هنا هي النمو في وسط النسر المعدل من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، L-glutamine ، والبنسلين / الستربتومايسين (المعروف فيما يلي باسم وسط النمو الكامل).
   ملاحظة: في هذه التجربة ، تستخدم خلايا ساركوما أبرامز العظمية في فئران Balb / c Foxn1 nu / nu . لدراسات سرطان الثدي ، يتم استخدام خلايا 4T1 في الفئران Balb / c وخلايا EO771 في الفئران C57BL / 6.
2. تنمو الخلايا إما في قوارير زراعة الأنسجة المنفوية أو ألواح زراعة الأنسجة ذات 6 آبار عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
3. اجتياز خط اهتمام الخلية وإعداد الخلايا للحقن عندما تصل الخلايا إلى التقاء شائع الاستخدام مع حقن هذه الخلايا في الفئران.

2. الحيوانات

1. استخدم فئران Balb / c Foxn1 nu / nu على الأقل من عمر 6-8 أسابيع لتوليد الورم تحت الجلد للتأكد من أن الحيوانات تجاوزت مرحلة النمو السريع وحققت مرحلة البلوغ والنضج الهيكلي.
2. استخدم إما ذكور أو إناث الفئران. قم بعمل استثناءات عند اختيار خطوط الخلايا المستجيبة للهرمونات (على سبيل المثال ، خلايا سرطان الثدي في إناث الفئران وخلايا سرطان البروستاتا في ذكور الفئران).
3. بالنسبة لتجارب xenograft ، استخدم الفئران العارية التي تعاني من نقص المناعة بناء على عدم توافق خط الخلية مع نظام المناعة السليم للفأر في ظل الظروف العادية.
4. بالنسبة لتجارب الطعم الخيفي باستخدام خطوط خلايا الفئران ، يوصى بذلك أيضا بناء على خلفيات وراثية ومناعية مختلفة للفئران. ومع ذلك ، بالنسبة للتجارب الجينية ، استخدم الحيوانات من نفس سلالة خط الخلية محل الاهتمام.
5. منزلية بكثافة قياسية اعتمادا على سياسات تربية المؤسسة.

3. الأورام تحت الجلد

1. حصاد خطوط الخلايا من الثقافة عن طريق التربسين وإعادة تعليقها في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
2. تقييم صلاحية الخلية وتحديد كثافة الخلية بطريقة استبعاد التريبان الأزرق. استخدم مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي لحساب الخلايا. يجب استخدام الحد الأدنى من صلاحية الخلية بنسبة 90٪ للحقن في الفئران لإنشاء أورام تحت الجلد.
3. اضبط كثافة الخلية لحقن 1-2 × 10⁵ خلايا في حجم نهائي من 0.1 إلى 0.15 مل (100 إلى 150 ميكرولتر) من PBS المعقم. الحفاظ على الخلايا على الجليد حتى الحقن.
4. بدلا من ذلك ، خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا المحببة في وسط مصفوفة غشاء قاعدي معقم غير مخفف للحصول على 1-2 × 10⁵ خلايا بحجم نهائي من 0.1 إلى 0.15 مل (100 إلى 150 ميكرولتر). الحفاظ على الخلايا على الجليد حتى استخدام مرة أخرى.
5. تخدير الفئران لاستخدامها في نمو الورم تحت الجلد مع إيزوفلوران في تخدير الأكسجين. يجب استخدام جرعة تحريض من 5٪ إيزوفلوران في 2 لتر / دقيقة من الأكسجين وجرعة صيانة من 2-3٪ إيزوفلوران في 2 لتر / دقيقة من الأكسجين. تحقق من عدم وجود ردود فعل وميض أو دواسة قبل المضي قدما.
   ملاحظة: إيزوفلوران هو مخدر استنشاقي. استخدم الأيزوفلوران في منطقة جيدة التهوية مع أنظمة الكسح المناسبة وجمع الغاز المجاني. يرجى استشارة الطاقم البيطري المؤسسي لوضع خطة لتحريض التخدير وصيانته ومراقبته، والتأكد من حصول موظفي المختبر على التدريب المناسب في مجال مراقبة التخدير والتعامل مع عوامل التخدير المستنشقة.
6. إزالة الشعر من المنطقة الظهرية من الصدر أو البطن من الفئران المخدرة مع محلول إزالة الشعر أو مع المقص الكهربائية. يفضل محلول إزالة الشعر لتقليل الصدمات المحتملة للجلد. تخطي هذه الخطوة في حالة استخدام الفئران عارية athymic.
7. نظف المنطقة المحضرة بمسحة إيثانول بنسبة 70٪ قبل حقن تعليق الخلية.
8. استخدم حقنة 1 مل من السل مع إبرة 27 جم لحقن الخلايا تحت الجلد فوق المنطقة الظهرية للصدر أو البطن ، حتى لا تتأثر بحركة لوحي الكتف. بدلا من ذلك ، حقن الخلايا تحت الجلد كمعلق في مصفوفة خارج الخلية المتاحة تجاريا.
   ملاحظة: الحقن في مصفوفة خارج الخلية المتاحة تجاريا سيحد من هجرة معلق الخلية في الفضاء تحت الجلد لأن هذه المصفوفات تتصلب في درجة حرارة الغرفة.
9. استعادة الفئران على وسادة التدفئة في أقفاص فردية حتى الإسعافية. يمكن بعد ذلك وضع الفئران في أقفاصها العادية مع فراش نظيف وجاف.
10. مراقبة حجم الورم تحت الجلد الذي يغطي الصدر الظهري أو البطن باستخدام الفرجار وقياس أوزان الجسم أسبوعيا للتأكد من أن الأورام تحت الجلد لا تتقرح أو أن الفئران تفي بمعايير الإزالة المبكرة على النحو الذي حددته لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسات. يوصى بحد أقصى لحجم الورم 15 مم في أي بعد لتقليل خطر تقرح الجلد أو نخر الورم المركزي.
    ملاحظة: استشر الإرشادات المحلية لتحديد الحد الأقصى المسموح به لحجم / حجم الورم.
11. القتل الرحيم للفئران التي تحمل أوراما تحت الجلد بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع عن طريق استنشاق CO₂ متبوعا بخلع عنق الرحم. اتبع سياسات المؤسسة المقبولة للقتل الرحيم للفئران.
12. حصاد الأورام تحت الجلد باستخدام تقنية جراحية معقمة. تعقيم الجلد الذي يغطي الورم كما كان من قبل باستخدام 70٪ من الإيثانول بعد إزالة الشعر (إن وجد). شق من خلال الجلد الذي يغطي الورم بشفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط). تشريح الورم بحدة من الأنسجة الرخوة المرفقة المحيطة مع زوج من مقص جراحي معقمة.
13. ضع الورم في ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار تحتوي على وسط نمو كامل وقم باللحم المفروم إلى شظايا صغيرة متعددة ذات حجم محدد مسبقا (~ 0.6 مم × 0.6 مم × 0.6 مم - 0.25 مم 3 حتى 1 مم × 1 مم × 1 مم - 1 مم³) بشفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط).
14. الحفاظ على شظايا الورم في وسط نمو كامل معقم في درجة حرارة الغرفة حتى وقت زرع داخل الظنبوب. بالنسبة لخطوط الخلايا التي تحمل جينات لوسيفيراز أو جينات مراسل الفلورسنت ، استخدم التصوير الحيوي خارج الجسم الحي أو التصوير الفلوري لتأكيد صلاحية الورم قبل زرع داخل الظنبوب في الفئران.
15. للحفظ بالتبريد ، ضع شظايا متعددة في نفس cryovial في وسط نمو كامل مكمل ب 20٪ FBS و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بالتجميد تدريجيا باستخدام نظام الحفظ بالتبريد التجاري عند -80 درجة مئوية وتخزينها على المدى الطويل في النيتروجين السائل. الحفاظ على شظايا الورم للتحليل اللاحق ، ولكن ليس للزرع في المستقبل ، عن طريق التجميد المفاجئ باستخدام غمر النيتروجين السائل. قم بتخزين شظايا الورم المجمدة هذه على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تم الإبلاغ سابقا عن أن الأورام المجمدة المفاجئة لن تنقش وتنمو في الجسم الحي⁸.

4. الزرع الجراحي لشظايا الورم تحت الجلد

1. إحضار شظايا جديدة أو محفوظة بالتبريد من الورم تحت الجلد إلى درجة حرارة الغرفة في وسط نمو كامل قبل الزرع الجراحي.
2. تخدير الفئران من سلالة الاهتمام باستخدام الأيزوفلوران في تخدير الأكسجين كما هو موضح في القسم 3. تحقق من عدم وجود ردود فعل دواسة قبل المتابعة. يتم تطبيق البوبرينورفين تحت الجلد بجرعة 0.02-0.05 ملغ/كغ لتوفير التسكين في الفترة المحيطة بالجراحة. يمكن تكرار ذلك كل 6-8 ساعات في فترة ما بعد الجراحة ، إذا لزم الأمر.
3. قم بإزالة الشعر على مفصل الركبة الأيمن والساق القريبة من الطرف الخلفي بمحلول إزالة الشعر لتقليل الصدمة المحتملة للجلد.
4. فرك المنطقة المعدة بمطهر جراحي. افرك أولا بمسحة إيثانول بنسبة 70٪ ثم افركه بالتناوب مع الكلورهيكسيدين والمقشر الملحي.
5. تصور الظنبوب القريب على أنه المنطقة البعيدة عن مفصل الركبة أثناء ثني المفصل وتمديده.
6. قم بإنشاء شق 3-4 مم على مستوى الساق القريبة على الجانب الإنسي من الطرف باستخدام شفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط). شق من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد لفضح القشرة الإنسية للساق القريبة.
7. قم بالضغط برفق بطرف إبرة 25 جم ، مع تدوير الطرف أيضا ، لإنشاء ثقب صغير في القشرة الإنسية للساق القريبة. اجعل هذا الثقب بعيدا حوالي 2 مم عن مفصل الركبة عند نقطة متساوية المسافة بين القشرة الظنبوبية القحفية والذيلية. حدد حجم الإبرة حسب حجم شظايا الورم.
8. استخدم ملقط معقم لالتقاط شظايا الورم وإدخالها في التجويف النخاعي للساق القريبة. استخدم إبرة من 27 إلى 30 جم لمعالجة جزء الورم في القناة النخاعية. اعتمادا على حجم شظايا الورم ، قم بزرع ما لا يقل عن 0.5 مم³ من إجمالي حجم الورم في كل ساق. قد يتطلب ذلك زرع 1 أو أكثر من شظايا الورم اعتمادا على حجم شظايا الورم التي تم إنشاؤها.
   ملاحظة: التعديلات لمنع أو الحد من إزاحة الكسب غير المشروع خارج العظم هي وضع شمع العظام أو الأسمنت العظمي في عيب العظام أو إما رغوة الهلام أو طعم الدهون تحت الجلد فوق الفتحة الموجودة في العظم.
9. ضع حواف الجلد بلاصق مناديل سائلة معقمة أو خياطة جلدية واحدة. لا تستخدم مقاطع الجرح في هذا الموقع. توخ الحذر عند استخدام التصوير الفلوري في فترة ما بعد الجراحة ، لأن كل من المواد اللاصقة للأنسجة والخياطة لديها القدرة على التألق.
10. استعادة الفئران على وسادة التدفئة في أقفاص فردية حتى الإسعافية.

5. التقييم التسلسلي ونقطة النهاية

1. تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران في تخدير الأكسجين كما هو موضح سابقا.
2. قم بتقييم نمو ورم الظنبوب بشكل غير جراحي إما عن طريق التصوير الشعاعي الرقمي الأسبوعي أو التلألؤ الحيوي أو التصوير الفلوري (إذا كنت تستخدم خلايا تعبر عن لوسيفيراز أو جين مراسل فلوريسنت). يمكن أيضا إجراء قياسات الفرجار للطرف في موقع الزرع في الفئران المستيقظة.
3. بالإضافة إلى المراقبة التقليدية للفئران الحاملة للورم (وزن الجسم ، ومستوى النشاط ، ومعدل التنفس ، والاستمالة ، والموقف ، والعقل ، والسلوك) ، راقب الفئران أسبوعيا بحثا عن علامات عرج الأطراف الخلفية والتورم وعدوى موقع الجراحة.
4. راقب الجرح الجراحي الجلدي لأول 10-14 يوما بحثا عن الاحمرار المفرط والتورم والتصريف وتفكك الجرح حتى يلتئم جرح الجلد. بعد 4-5 أسابيع ، قم بتقييم الفئران وفقا لتقييم نتائج الدراسة إما على قيد الحياة أو بعد القتل الرحيم.

النتائج

قد تترافق النتيجة الإيجابية مع تطعيم الورم ونمو الورم التدريجي بمرور الوقت. اعتمادا على نوع الورم ، قد يرتبط نمو الورم داخل العظم بعرج الأطراف الخلفية التدريجي ، لكن العديد من الأورام لا تسبب العرج على الرغم من علامات مرض العظام المصاحب. تم توثيق النقش الناجح بالتصوير المتقدم ، حيث ستكون ?...

Discussion

يوثق هذا التقرير نموذجنا لإنشاء أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام بعد زرع الطعم الخيفي داخل الظنبوب للورم. ونعتقد أن هناك عدة خطوات حاسمة في هذه العملية. يجب إنشاء مستوى مخدر آمن لكل من الحقن تحت الجلد لتعليق الخلايا السرطانية ووضع شظايا الورم الناتجة داخل الظنبوب. يجب أن يكون هنا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed