Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mit Implantation eines soliden Tumortransplantats in den Knochen

Zusammenfassung

Knochenmetastasenmodelle entwickeln Metastasen nicht gleichmäßig oder mit einer 100%igen Inzidenz. Die direkte intraossäre Injektion von Tumorzellen kann zu einer Embolisation der Lunge führen. Wir stellen unsere Technik zur Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mittels solider Tumortransplantatimplantation in den Knochen vor, was zu reproduzierbarem Transplantat und Wachstum führt.

Zusammenfassung

Primäre Knochentumoren oder Knochenmetastasen von soliden Tumoren führen zu schmerzhaften osteolytischen, osteoblastischen oder gemischten osteolytischen/osteoblastischen Läsionen. Diese Läsionen beeinträchtigen die Knochenstruktur, erhöhen das Risiko einer pathologischen Fraktur und lassen den Patienten nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten. Primäre Knochentumoren metastasieren in entfernte Organe, wobei sich einige Arten auf andere Skelettstellen ausbreiten können. Neuere Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass bei vielen soliden Tumoren Krebszellen, die sich in den Knochen ausgebreitet haben, die primäre Quelle für Zellen sein können, die schließlich in andere Organsysteme metastasieren. Die meisten syngenen oder Xenograft-Mausmodelle von primären Knochentumoren beinhalten eine intraossäre (orthotope) Injektion von Tumorzellsuspensionen. Einige Tiermodelle für Skelettmetastasen aus soliden Tumoren basieren ebenfalls auf einer direkten Knocheninjektion, während andere versuchen, zusätzliche Schritte der Knochenmetastaskade zu rekapitulieren, indem Zellen intravaskulär oder in das Organ des Primärtumors injiziert werden. Keines dieser Modelle entwickelt jedoch zuverlässig oder mit einer Inzidenz von 100% Knochenmetastasen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die direkte intraossäre Injektion von Tumorzellen mit einer möglichen Tumorembolisation der Lunge assoziiert ist. Diese embolischen Tumorzellen transplantieren die metastasierende Kaskade, rekapitulieren sie aber nicht. Wir berichteten über ein Mausmodell des Osteosarkoms, bei dem frische oder kryokonservierte Tumorfragmente (bestehend aus Tumorzellen plus Stroma) mit minimalinvasiver Operationstechnik direkt in die proximale Tibia implantiert werden. Diese Tiere entwickelten reproduzierbares Transplantat, Wachstum und im Laufe der Zeit Osteolyse und Lungenmetastasen. Diese Technik ist so vielseitig, dass sie zur Modellierung solider Tumorknochenmetastasen verwendet werden kann, und kann problemlos Transplantate verwenden, die aus einem oder mehreren Zelltypen, genetisch veränderten Zellen, von Patienten stammenden Xenotransplantaten und/oder markierten Zellen bestehen, die durch optische oder fortschrittliche Bildgebung verfolgt werden können. Hier demonstrieren wir diese Technik, indem wir primäre Knochentumore und Knochenmetastasen mit Hilfe der Implantation eines soliden Tumortransplantats in den Knochen modellieren.

Einleitung

Mausmodelle für menschliche und tierische Krankheiten werden in der biomedizinischen Forschung immer beliebter. Der Nutzen der Verwendung von Mäusen in diesem Zusammenhang besteht darin, dass ihre Anatomie und Physiologie dem Menschen sehr ähnlich sind. Sie haben eine relativ kurze Tragzeit und Zeit im postnatalen Leben, um die Reife zu erreichen, und sind weitgehend mit relativ niedrigen Kosten und einfacher Unterbringung verbunden, obwohl steigende Entwicklungs- oder Anschaffungskosten mit einem höheren Grad an genetischer Veränderung, Immunschwäche und/oder Humanisierung verbunden sind¹. Die Verwendung von Inzuchtstämmen führt zu einer weitgehend einheitlichen Tierpopulation vor dem Studieneinschluss. Eine vollständige Kenntnis ihres Genoms deutet auf ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen hin. Orthologe molekulare Angriffspunkte für viele Krankheitsprozesse wurden im Genom der Maus identifiziert und es gibt nun eine umfangreiche Bibliothek mausspezifischer Reagenzien, die leicht erhältlich sind. Daher bieten sie die Möglichkeit, im Vergleich zu größeren Tiermodellen eine relativ schnelle und kostengünstigere Analyse mit relativ hohem Durchsatz durchzuführen¹. Darüber hinaus stellen sie mit dem Aufkommen genetischer Editierungsstrategien, die die Überexpression oder Deletion bestimmter Gene entweder global oder zelltypspezifisch und/oder konstitutiv oder induzierbar ermöglichen, ein biologisch sehr nützliches Modellsystem für die Untersuchung menschlicher und tierischer Krankheiten^{dar 2}.

Krebs ist ein Bereich, in dem Mausmodelle von großem Nutzen sind. Genetische Mausmodelle für Krebs beruhen auf der Modulation der Expression von Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen, allein oder in Kombination, damit Zellen eine onkogene Transformation durchlaufen können. Auch die Injektion von primären oder etablierten Tumorzelllinien in Mäuse wird durchgeführt. Die Einführung von Zelllinien oder Geweben von Menschen oder anderen Tierarten, einschließlich Mäusen, ist nach wie vor das am weitesten verbreitete Modell für Krebs in vivo. Die Verwendung von Zellen und Geweben unterschiedlicher Spezies (Xenotransplantate) bei immungeschwächten Mäusen wird am häufigsten durchgeführt². Die Verwendung von Allotransplantat-Tumorzellen oder -geweben, bei denen sowohl der Wirt als auch der Empfänger derselben Spezies angehören, ermöglicht jedoch die Interaktion mit einem intakten Immunsystem, wenn sie mit demselben Wirtsmausstamm in syngenen Systemen kombiniert werden³.

Primäre Knochentumoren oder Knochenmetastasen von soliden Tumoren führen zu schmerzhaften osteolytischen, osteoblastischen oder gemischten osteolytischen/osteoblastischen Läsionen ^3,4. Diese Tumore beeinträchtigen die Knochenstruktur, erhöhen das Risiko einer pathologischen Fraktur, und lassen den Patienten nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten. Primäre Knochentumoren metastasieren in entfernte Organe, wobei sich einige Arten auf andere Skelettstellen ausbreiten können. Bei Brustkrebspatientinnen ist der Knochen der häufigste Ort der ersten Metastasierung und der häufigste Ort des ersten Auftretens einer metastasierenden Erkrankung ^5,6. Darüber hinaus sind disseminierte Tumorzellen (DTCs) im Knochenmark vor der Diagnose vorhanden und sagen die Entwicklung von Metastasen in anderen Organen voraus⁷. Daher wird angenommen, dass Krebszellen, die im Knochen vorhanden sind, die Quelle von Zellen sind, die schließlich in andere Organsysteme metastasieren. Es gibt viele Mausmodelle solider Tumormetastasen, die Metastasen vor allem in der Lunge und in den Lymphknoten und je nach Tumorart und Injektionstechnik möglicherweise auch in anderen Organsystemen entwickeln³. Es fehlen jedoch Mausmodelle für Knochenmetastasen, die zuverlässig und reproduzierbar ortsspezifische Skelettmetastasen erzeugen und Knochenmetastasen entwickeln, bevor Mäuse die Kriterien für eine frühzeitige Entfernung von der Primärtumorlast oder Metastasierung in andere Organe erreichen. Wir haben über ein Modell des primären Knochentumorosteosarkoms berichtet, das auf der chirurgischen Implantation eines soliden Tumorallotransplantats in die proximale Tibia von Mäusen^{beruht 8}. Bei 100 % der Mäuse bildeten sich Knochentumore und bei 88 % der Mäuse entwickelten sich Lungenmetastasen. Diese Inzidenz von Metastasen übersteigt das, was üblicherweise klinisch bei Menschen berichtet wird (~20-50%), ist aber von großem Interesse, da die Lunge der häufigste Ort der Metastasierung bei Osteosarkomen ist 9,10,11. Während dieses Modell bei der Modellierung von primären Knochentumoren von Vorteil ist, hat es auch einen großen Nutzen bei der Modellierung von Knochenmetastasen aus anderen osteotropen soliden Tumoren wie Brust-, Lungen-, Prostata-, Schilddrüsen-, Leber-, Nieren- und Magen-Darm-Tumoren.

Der Grundgedanke für die Entwicklung dieses Modells war die Entwicklung einer Alternative zur traditionellen intraossären Injektion, typischerweise in die proximale Tibia oder den distalen Femur zur Modellierung von primären Knochentumoren oder Knochenmetastasen¹². Unser primäres Ziel war es, eine bekannte Einschränkung dieser Technik, nämlich die Tumorembolisation der Lunge, zu lindern. Dies führt zur Transplantation dieser embolischen Tumorzellen und zu einer "künstlichen Metastasierung", die nicht die vollständige Metastaskade eines etablierten primären Knochentumors, der in die Lunge metastasiert, rekapituliert ^8,13. Dies wäre auch der Fall, wenn sich eine etablierte Knochenmetastase auf eine entfernte Stelle ausbreitet. Darüber hinaus wurde diese Technik auch entwickelt, um ein Modell der Knochenmetastasierung zu erstellen, das im Vergleich zu orthotopen oder intravaskulären Injektionstechniken eine höhere Inzidenz von Transplantaten und Wachstum von Tumoren im Knochen und an einer einheitlichen Stelle gewährleisten würde. Dieses Modell hat deutliche Vorteile gegenüber diesen beschriebenen Techniken. Bei diesem Modell geht es um eine kontrollierte, konsistente Abgabe von Tumorzellen in den Knochen. Es vermeidet auch künstliche Lungenmetastasen nach Lungenembolisation und schafft eine einheitliche Studienpopulation zu Studienbeginn. Mit diesem Modell haben ortsspezifische Tumoren den Vorteil, dass keine vorzeitigen Entfernungskriterien durch Primärtumore oder Metastasen in andere Organe entstehen. Schließlich hat dieses Modell einen großen Nutzen für Modifikationen, einschließlich der Verwendung von Xenotransplantaten, die von Patienten stammen.

Das vorgestellte Modell weist Ähnlichkeiten mit der direkten Injektion einer Zellsuspension in den Knochen nach einem chirurgischen Ansatz auf, gefolgt von einer Injektion durch die Rinde oder einer Abgabe in die Knochenmarkhöhle nach einem kleinen Defekt in der Rinde (mit oder ohne Ausreiben der Markhöhle)8,14,15,16,17 . Durch die Implantation eines Tumor-Allotransplantats unterscheidet sich diese Technik jedoch deutlich. Daher war es das Ziel dieses Berichts, dieses Modell von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen aus soliden Tumoren zu demonstrieren, das viele Einschränkungen der zuvor beschriebenen Modelle überwindet. Forschungsgruppen mit Erfahrung in Zellkultur, Mausmodellen, Mausanästhesie und -chirurgie sowie Mausanatomie sind gut gerüstet, um unsere Technik zur Modellierung von primären Knochentumoren oder Knochenmetastasen bei Mäusen zu reproduzieren.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Cambridge, Cambridge, UK, genehmigt.

1. Herstellung von Zelllinien

1. Züchten Sie Zelllinien in Übereinstimmung mit den Standard-Zellkulturprotokollen des Labors für herkömmliche Zellkulturen oder Injektionen in Mäuse. Die hier verwendeten Standardprotokolle sind das Wachstum in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium, das 10 % fötales Kälberserum (FBS), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin (im Folgenden als vollständiges Wachstumsmedium bezeichnet) enthält.
   HINWEIS: In diesem Experiment werden Abrams-Osteosarkomzellen in Balb/c Foxn1 nu/nu-Mäusen verwendet. Für Brustkrebsstudien werden 4T1-Zellen in Balb/c-Mäusen und EO771-Zellen in C57BL/6-Mäusen verwendet.
2. Die Zellen werden entweder in belüfteten Gewebekulturflaschen oder in 6-Well-Gewebekulturplatten bei 37 °C in 5 % CO₂ gezüchtet.
3. Passieren Sie die interessierende Zelllinie und bereiten Sie die Zellen für die Injektion vor, wenn die Zellen eine Konfluenz erreichen, die üblicherweise bei der Injektion dieser Zellen in Mäuse verwendet wird.

2. Tiere

1. Verwenden Sie Balb/c Foxn1 nu/nu-Mäuse im Alter von mindestens 6-8 Wochen für die subkutane Tumorbildung, um sicherzustellen, dass die Tiere die schnelle Wachstumsphase hinter sich gelassen haben und das Erwachsenenalter und die Skelettreife erreicht haben.
2. Verwenden Sie entweder männliche oder weibliche Mäuse. Machen Sie Ausnahmen bei der Auswahl hormonempfindlicher Zelllinien (z. B. Brustkrebszellen bei weiblichen Mäusen und Prostatakrebszellen bei männlichen Mäusen).
3. Verwenden Sie für Xenograft-Experimente immundefiziente athymische Nacktmäuse, die darauf basieren, dass die Zelllinie unter normalen Bedingungen mit einem intakten Immunsystem der Maus inkompatibel ist.
4. Für Allotransplantat-Experimente mit murinen Zelllinien wird dies auch aufgrund unterschiedlicher genetischer und immuner Hintergründe der Maus empfohlen. Verwenden Sie jedoch für syngene Experimente Tiere desselben Stammes wie die gewünschte Zelllinie.
5. Unterbringung von Tieren in Standarddichten, abhängig von den Haltungsrichtlinien der Einrichtung.

3. Subkutane Tumoren

1. Entnahme von Zelllinien aus Kultur durch Trypsinisierung und Resuspendierung in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und bestimmen Sie die Zelldichte mit der Trypanblau-Ausschlussmethode. Verwenden Sie ein Hämozytometer oder einen automatischen Zellzähler, um die Zellen zu zählen. Eine Zellviabilität von mindestens 90 % soll für die Injektion in Mäuse verwendet werden, um subkutane Tumore zu erzeugen.
3. Passen Sie die Zelldichte an, um 1-2 x 10⁵ Zellen in einem Endvolumen von 0,1 bis 0,15 ml (100 bis 150 μl) sterilem PBS zu injizieren. Bewahren Sie die Zellen bis zur Injektion auf Eis auf.
4. Alternativ können Pelletzellen durch Zentrifugieren bei 800 x g für 5 min zentrifugiert werden. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die pelletierten Zellen in unverdünntem sterilem Basalmembran-Matrixmedium, um 1-2 x 10⁵ Zellen in einem Endvolumen von 0,1 bis 0,15 ml (100 bis 150 μl) zu erhalten. Bewahren Sie die Zellen bis zur weiteren Verwendung auf Eis auf.
5. Anästhesieren Sie Mäuse für das subkutane Tumorwachstum mit Isofluran in der Sauerstoffanästhesie. Verwenden Sie eine Induktionsdosis von 5 % Isofluran in 2 l/min Sauerstoff und eine Erhaltungsdosis von 2-3 % Isofluran in 2 l/min Sauerstoff. Überprüfen Sie, ob keine Blinzel- oder Pedalreflexe vorhanden sind, bevor Sie fortfahren.
   HINWEIS: Isofluran ist ein inhalatives Anästhetikum. Verwenden Sie Isofluran in einem gut belüfteten Bereich mit geeigneten Spül- und Freigassammelsystemen. Bitte wenden Sie sich an das Veterinärpersonal der Institution, um einen Plan für die Einleitung, Wartung und Überwachung der Anästhesie zu entwickeln, und stellen Sie sicher, dass das Laborpersonal über eine angemessene Ausbildung in der Anästhesieüberwachung und im Umgang mit Inhalationsanästhetika verfügt.
6. Entfernen Sie Haare aus dem dorsalen Bereich des Brustkorbs oder des Abdomens von anästhesierten Mäusen mit einer Enthaarungslösung oder mit einer elektrischen Haarschneidemaschine. Eine Enthaarungslösung wird bevorzugt, um ein mögliches Trauma der Haut zu minimieren. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Sie athymische Nacktmäuse verwenden.
7. Reinigen Sie den vorbereiteten Bereich vor der Injektion der Zellsuspension mit einem Tupfer mit 70%igem Ethanol.
8. Verwenden Sie eine 1-ml-Tuberkulinspritze mit einer 27-G-Nadel, um die Zellen subkutan über den dorsalen Bereich des Thorax oder des Abdomens zu injizieren, damit sie nicht durch Bewegungen der Schulterblätter beeinträchtigt werden. Alternativ können die Zellen subkutan als Suspension in handelsübliche extrazelluläre Matrix injiziert werden.
   HINWEIS: Die Injektion in eine kommerziell erhältliche extrazelluläre Matrix begrenzt die Migration der Zellsuspension im subkutanen Raum, da diese Matrizen bei Raumtemperatur erstarren.
9. Bringen Sie die Mäuse auf einem Heizkissen in einzelnen Käfigen zurück, bis sie gehfähig sind. Die Mäuse können dann in ihre normalen Käfige mit sauberer, trockener Einstreu gesetzt werden.
10. Überwachen Sie die Größe des subkutanen Tumors, der über dem dorsalen Thorax oder Abdomen liegt, mit einem Messschieber und messen Sie wöchentlich das Körpergewicht, um sicherzustellen, dass die subkutanen Tumore nicht ulzerieren oder Mäuse die Kriterien für eine frühzeitige Entfernung erfüllen, die vom Tierpflege- und -verwendungsausschuss der Institutionen festgelegt wurden. Eine maximale Tumorgröße von 15 mm in jeder Dimension wird empfohlen, um das Risiko von Hautulzerationen oder zentralen Tumornekrosen zu verringern.
    HINWEIS: Konsultieren Sie die örtlichen Richtlinien, um die maximal zulässige Tumorgröße/das maximal zulässige Tumorvolumen zu bestimmen.
11. Euthanasieren Sie Mäuse mit subkutanen Tumoren nach drei bis vier Wochen durch CO_{2 -} Inhalation mit anschließender Zervixluxation. Befolgen Sie die akzeptablen Richtlinien der Institution für die Euthanasie von Mäusen.
12. Entnahme von subkutanen Tumoren mit aseptischer Operationstechnik. Sterilisieren Sie die Haut über dem Tumor wie zuvor mit 70%igem Ethanol nach Entfernung der Haare (falls zutreffend). Schnitt durch die Haut über dem Tumor mit einer #15 Skalpellklinge (mit oder ohne Skalpellklingengriff). Präparieren Sie den Tumor scharf von den umgebenden anhaftenden Weichteilen mit einer sterilen chirurgischen Schere.
13. Platzieren Sie den Tumor in 6-Well-Gewebekulturplatten, die das vollständige Wachstumsmedium enthalten, und zerkleinern Sie ihn in mehrere kleine Fragmente vorbestimmter Größe (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm – 0,25 mm^{, 3} bis 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm³) mit einer #15 Skalpellklinge (mit oder ohne Skalpellklingengriff).
14. Bewahren Sie die Tumorfragmente bis zum Zeitpunkt der intratibialen Implantation in sterilem vollständigem Wachstumsmedium bei Raumtemperatur auf. Verwenden Sie für Zelllinien, die Luciferase- oder fluoreszierende Reportergene tragen, eine biolumineszente oder fluoreszierende Ex-vivo-Bildgebung, um die Lebensfähigkeit des Tumors vor der intratibialen Implantation in Mäuse zu bestätigen.
15. Zur Kryokonservierung werden mehrere Fragmente in dasselbe Kryo in ein vollständiges Wachstumsmedium gegeben, das mit 20 % FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) angereichert ist. Mit einer handelsüblichen Kryokonservierungsanlage bei –80 °C schrittweise einfrieren und langfristig in flüssigem Stickstoff lagern. Bewahren Sie Tumorfragmente für die spätere Analyse, aber nicht für eine zukünftige Implantation auf, indem Sie sie durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff einfrieren. Lagern Sie diese gefrorenen Tumorfragmente langfristig bei –80 °C.
    HINWEIS: Es wurde bereits berichtet, dass schockgefrorene Tumore in vivo^nicht transplantieren und wachsen 8.

4. Chirurgische Implantation von subkutanen Tumorfragmenten

1. Frische oder kryokonservierte Fragmente eines subkutanen Tumors werden vor der chirurgischen Implantation in einem vollständigen Nährmedium auf Raumtemperatur gebracht.
2. Anästhesieren Sie Mäuse des interessierenden Stammes mit Isofluran in Sauerstoffanästhesie, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Überprüfen Sie, ob keine Pedalreflexe vorhanden sind, bevor Sie fortfahren. Verabreichen Sie subkutanes Buprenorphin in einer Dosis von 0,02-0,05 mg/kg zur perioperativen Analgesie. Dies kann bei Bedarf alle 6-8 Stunden in der postoperativen Phase wiederholt werden.
3. Entfernen Sie die Haare am rechten Kniegelenk und am proximalen Schienbein der Hintergliedmaße mit einer Enthaarungslösung, um das mögliche Trauma der Haut zu minimieren.
4. Schrubben Sie den vorbereiteten Bereich mit einem chirurgischen Antiseptikum. Schrubben Sie zuerst mit einem 70%igen Ethanoltupfer und schrubben Sie dann abwechselnd mit Chlorhexidin und Kochsalzlösung.
5. Stellen Sie sich die proximale Tibia als die Region direkt distal des Kniegelenks vor, während Sie das Gelenk beugen und strecken.
6. Erstellen Sie einen 3-4 mm großen Schnitt auf Höhe des proximalen Schienbeins auf der medialen Seite der Extremität mit einer #15 Skalpellklinge (mit oder ohne Skalpellklingengriff). Schnitt durch die Haut und das Unterhautgewebe, um den medialen Kortex der proximalen Tibia freizulegen.
7. Üben Sie mit der Spitze einer 25-G-Nadel sanften Druck aus und drehen Sie die Spitze, um ein kleines Loch in der medialen Rinde der proximalen Tibia zu erzeugen. Machen Sie dieses Loch etwa 2 mm distal des Kniegelenks an einem Punkt, der zwischen der kranialen und kaudalen Tibiarinde gleich weit entfernt ist. Wählen Sie die Nadelstärke abhängig von der Größe der Tumorfragmente.
8. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Tumorfragmente aufzunehmen und in die Markhöhle der proximalen Tibia einzuführen. Mit einer 27 bis 30 G Nadel wird das Tumorfragment in den Markkanal manipuliert. Implantieren Sie je nach Größe der Tumorfragmente mindestens 0,5 mm³ Gesamttumorvolumen in jedes Schienbein. Dies kann die Implantation von 1 oder mehreren Tumorfragmenten erfordern, abhängig von der Größe der erzeugten Tumorfragmente.
   Anmerkungen: Modifikationen, um eine Verschiebung des Transplantats außerhalb des Knochens zu verhindern oder zu begrenzen, wären das Platzieren von Knochenwachs oder Knochenzement in den Knochendefekt oder entweder Gelschaum oder ein subkutanes Fetttransplantat über dem Loch im Knochen.
9. Fixieren Sie die Hautränder mit sterilem Flüssiggewebekleber oder einer einzelnen Hautnaht. Verwenden Sie auf dieser Website keine Wundclips. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie in der postoperativen Phase eine Fluoreszenzbildgebung verwenden, da sowohl Gewebekleber als auch Nahtmaterial fluoreszieren können.
10. Bringen Sie die Mäuse auf einem Heizkissen in einzelnen Käfigen zurück, bis sie gehfähig sind.

5. Serien- und Endpunktbewertung

1. Anästhesieren Sie Mäuse mit Isofluran in der Sauerstoffanästhesie, wie zuvor beschrieben.
2. Beurteilen Sie das Wachstum von Tibiatumoren nicht-invasiv entweder durch wöchentliche digitale Radiographie, Biolumineszenz oder Fluoreszenzbildgebung (bei Verwendung von Zellen, die Luciferase oder ein fluoreszierendes Reportergen exprimieren). Messschiebermessungen der Extremität an der Implantationsstelle können auch bei wachen Mäusen durchgeführt werden.
3. Zusätzlich zur traditionellen Überwachung von tumortragenden Mäusen (Körpergewicht, Aktivitätsniveau, Atemfrequenz, Fellpflege, Körperhaltung, Mentation und Verhalten) werden Mäuse wöchentlich auf Anzeichen von Lahmheit, Schwellungen und Infektionen der Operationsstelle überwacht.
4. Überwachen Sie die chirurgische Wunde in den ersten 10-14 Tagen auf übermäßige Rötungen, Schwellungen, Drainagen und Wunddehiszenz, bis die Hautwunde verheilt ist. Nach 4-5 Wochen sind die Mäuse in Übereinstimmung mit der Bewertung des Studienergebnisses entweder lebend oder nach Euthanasie zu bewerten.

Ergebnisse

Ein positives Ergebnis wäre mit einer Tumortransplantation und einem fortschreitenden Tumorwachstum im Laufe der Zeit verbunden. Je nach Tumorart kann das intraossäre Tumorwachstum mit einer fortschreitenden Lahmheit der Hintergliedmaßen einhergehen, aber viele Tumoren verursachen trotz Anzeichen einer begleitenden Knochenerkrankung keine Lahmheit. Das erfolgreiche Engraftment wurde mit fortschrittlicher Bildgebung dokumentiert, wobei es zu progressiven röntgendialogischen, μCT- oder μMRT-Veränderungen in der prox...

Diskussion

Dieser Bericht dokumentiert unser Modell zur Erzeugung von primären Knochentumoren oder Knochenmetastasen nach intratibialer Implantation eines Tumorallotransplantats. Wir glauben, dass es in diesem Prozess mehrere kritische Schritte gibt. Sowohl für die subkutane Injektion der Tumorzellsuspension als auch für die intratibiale Platzierung der resultierenden Tumorfragmente sollte eine sichere Anästhesieebene geschaffen werden. Die Operationsstelle sollte sowohl für die Entfernung des subkutanen Allotransplantats als ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed