מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם עם השתלת גידול מוצק השתלת עצם לעצם

Summary

מודלים של גרורות בעצמות אינם מפתחים גרורות באופן אחיד או בשכיחות של 100%. הזרקה ישירה של תאי גידול תוך אוסאוסיים עלולה לגרום לתסחיף של הריאה. אנו מציגים את הטכניקה שלנו מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם באמצעות השתלת גידול מוצק לתוך העצם, המוביל לקליטה וצמיחה הניתנים לשחזור.

Abstract

גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם מגידולים מוצקים גורמים לנגעים אוסטאוליטיים, אוסטאובלסטיים או מעורבים אוסטאוליטיים/אוסטאובלסטיים כואבים. נגעים אלה פוגעים במבנה העצם, מגבירים את הסיכון לשבר פתולוגי ומשאירים את המטופלים עם אפשרויות טיפול מוגבלות. גידולי עצם ראשוניים שולחים גרורות לאיברים מרוחקים, כאשר סוגים מסוימים מסוגלים להתפשט לאתרי שלד אחרים. עם זאת, ראיות עדכניות מצביעות על כך שבגידולים מוצקים רבים, תאים סרטניים שהתפשטו לעצם עשויים להיות המקור העיקרי לתאים שבסופו של דבר שולחים גרורות למערכות איברים אחרות. רוב המודלים הסינגניים או הקסנוגרפטים של גידולי עצם ראשוניים כוללים הזרקה תוך-אוסית (אורתוטופית) של תרחיפים של תאי גידול. חלק מהמודלים של בעלי חיים של גרורות שלד מגידולים מוצקים תלויים גם בהזרקת עצם ישירה, בעוד שאחרים מנסים לשחזר שלבים נוספים של מפל גרורות העצם על ידי הזרקת תאים תוך כלי דם או לתוך האיבר של הגידול הראשוני. עם זאת, אף אחד מהמודלים הללו אינו מפתח גרורות בעצמות באופן אמין או עם שכיחות של 100%. בנוסף, הזרקה תוך-אוסית ישירה של תאי הגידול הוכחה כקשורה לאמבוליזציה פוטנציאלית של הריאה. תאי גידול תסחיף אלה מושתלים אך אינם משחזרים את המפל הגרורתי. דיווחנו על מודל עכברי של אוסטאוסרקומה שבו קטעי גידול טריים או קריוגניים (המורכבים מתאי גידול בתוספת סטרומה) מושתלים ישירות לתוך השוקה הפרוקסימלית באמצעות טכניקה כירורגית זעיר פולשנית. בעלי חיים אלה פיתחו קליטה ניתנת לשחזור, גדילה, ועם הזמן, אוסטאוליזה וגרורות ריאה. טכניקה זו יש את הרבגוניות לשמש כדי מודל גרורות עצם הגידול מוצק יכול בקלות להשתמש שתלים המורכבים סוג תא אחד או יותר, תאים מהונדסים גנטית, xenografts נגזר המטופל, ו / או תאים מסומנים שניתן לעקוב אחריהם על ידי הדמיה אופטית או מתקדמת. כאן, אנו מדגימים טכניקה זו, מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם באמצעות השתלת גידול מוצק השתלת עצם.

Introduction

מודלים עכבריים של מחלות בני אדם ובעלי חיים הופכים פופולריים יותר ויותר במחקר ביו-רפואי. התועלת בשימוש בעכברים בהקשר זה היא שהאנטומיה והפיזיולוגיה שלהם דומות מאוד לבני אדם. יש להם תקופת הריון קצרה יחסית וזמן בחיים שלאחר הלידה כדי להשיג בגרות, והם קשורים במידה רבה עם עלות נמוכה יחסית וקלות דיור, אם כי עלויות גדלות של פיתוח או רכישה קשורות עם דרגות גבוהות יותר של שינוי גנטי, כשל חיסוני, ו / או הומניזציה¹. שימוש בזנים גזעיים מביא לאוכלוסיית בעלי חיים אחידה במידה רבה לפני הכללת המחקר. ידע מלא של הגנום שלהם מצביע על רמה גבוהה של דמיון לבני אדם. מטרות מולקולריות אורתולוגיות לתהליכי מחלה רבים זוהו בגנום העכבר וכיום יש ספרייה נרחבת של ריאגנטים ספציפיים לעכבר שניתן להשיג בקלות. לכן, הם מספקים הזדמנות לניתוח תפוקה גבוהה יחסית באופן מהיר יותר וזול יותר בהשוואה למודלים גדולים יותר של בעלי חיים¹. בנוסף, עם כניסתן של אסטרטגיות עריכה גנטית המאפשרות ביטוי יתר או מחיקה של גנים מסוימים באופן גלובלי או ספציפי לסוג התא ו / או באופן מכונן או אינדוקטיבי, הם מייצגים מערכת מודל שימושית מאוד מבחינה ביולוגית לחקר מחלות בני אדם ובעלי חיים².

סרטן הוא תחום אחד שבו מודלים עכבר יש תועלת רבה. מודלים גנטיים של סרטן בעכברים מסתמכים על אפנון הביטוי של אונקוגנים או גנים מדכאי גידולים, לבד או בשילוב, כדי שתאים יעברו טרנספורמציה אונקוגנית. הזרקת קווי תאי גידול ראשוניים או מבוססים לעכברים מבוצעת גם. הכנסת קווי תאים או רקמות מבני אדם או ממיני בעלי חיים אחרים, כולל עכברים, נותרה המודל הנפוץ ביותר של סרטן in vivo. השימוש בתאים ורקמות ממינים שונים (xenografts) בעכברים מדוכאי חיסון מבוצע לרוב². עם זאת, השימוש בתאי גידול אלוגרפט או רקמות שבהן גם המארח וגם המקבל הם מאותו מין מאפשר אינטראקציה עם מערכת חיסון שלמה בשילוב עם אותו זן עכבר מארח במערכות סינגניות³.

גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם מגידולים מוצקים גורמים לנגעים אוסטאוליטיים, אוסטאובלסטיים או מעורבים אוסטאוליטיים/אוסטאובלסטיים ^3,4. גידולים אלה פוגעים במבנה העצם, מגבירים את הסיכון לשבר פתולוגי ומשאירים את החולים עם אפשרויות טיפול מוגבלות. גידולי עצם ראשוניים שולחים גרורות לאיברים מרוחקים, כאשר סוגים מסוימים מסוגלים להתפשט לאתרי שלד אחרים. בחולות סרטן השד, העצם היא האתר השכיח ביותר של גרורות ראשונות והאתר הראשון השכיח ביותר של הצגת מחלה גרורתית ^5,6. בנוסף, תאי גידול מפוזרים (DTC) נמצאים במח העצם לפני האבחנה של, ומנבאים את התפתחותן, של גרורות באיברים אחרים⁷. לכן, הוא האמין כי תאים סרטניים נוכח עצם הם המקור של תאים כי בסופו של דבר גרורות למערכות איברים אחרים. קיימים מודלים עכבריים רבים של גרורות גידוליות מוצקות המפתחות גרורות בעיקר בריאה ובבלוטות הלימפה, ובהתאם לסוג הגידול וטכניקת ההזרקה, אולי מערכות איברים אחרות³. עם זאת, חסרים מודלים עכבריים של גרורות עצם שמייצרים באופן מהימן גרורות שלד ספציפיות לאתר ומפתחות גרורות עצם לפני שהעכברים מגיעים לקריטריונים להסרה מוקדמת מנטל הגידול הראשוני או גרורות לאיברים אחרים. דיווחנו על מודל של אוסטאוסרקומה של גידול העצם הראשוני המסתמך על השתלה כירורגית של אלוגרפט גידול מוצק לתוך השוקה הפרוקסימלית של עכברים⁸. גידולי עצם נוצרו ב-100% מהעכברים וב-88% פיתחו גרורות ריאתיות. שכיחות זו של גרורות עולה על מה שמדווח קלינית בדרך כלל אצל אנשים (~ 20-50%), אך היא מעניינת מאוד מכיוון שהריאה היא האתר השכיח ביותר של גרורות לאוסטאוסרקומה 9,10,11. בעוד מודל זה הוא יתרון במידול גידולי עצם ראשוניים, יש לו גם תועלת רבה במידול גרורות עצם מגידולים מוצקים אוסטאוטרופיים אחרים כגון שד, ריאות, ערמונית, בלוטת התריס, כבד, כליות וגידולים במערכת העיכול.

הרציונל לפיתוח מודל זה היה לפתח חלופה להזרקה התוך-אוסית המסורתית בדרך כלל לתוך השוקה הפרוקסימלית או עצם הירך הדיסטלית כדי למדל גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם¹². המטרה העיקרית שלנו הייתה להקל על מגבלה ידועה של טכניקה זו, כלומר אמבוליזציה של הגידול של הריאה. התוצאה היא קליטה של תאי גידול תסחיפים אלה ו"גרורות מלאכותיות" שאינן משחזרות את המפל הגרורתי המלא מגידול עצם ראשוני מבוסס ששולח גרורות לריאות ^8,13. זה יהיה גם המצב כאשר גרורות עצם מבוססות מתפשטות לאתר מרוחק. בנוסף, טכניקה זו פותחה גם כדי לייצר מודל של גרורות עצם שיבטיח שכיחות גבוהה יותר של השתלה וצמיחה של גידולים בעצם ובאתר אחיד בהשוואה לטכניקות הזרקה אורתוטופיות או תוך וסקולריות. למודל זה יתרונות מובהקים על פני טכניקות מתוארות אלה. מודל זה כולל העברה מבוקרת ועקבית של תאי הגידול לתוך העצם. כמו כן, הוא מונע גרורות ריאה מלאכותיות לאחר אמבוליזציה ריאתית ומבסס אוכלוסיית מחקר אחידה בסיסית. יש יתרון של גידולים ספציפיים לאתר עם מודל זה ללא הסיכון של קריטריונים להסרה מוקדמת כתוצאה מגידולים ראשוניים או גרורות לאיברים אחרים. לבסוף, מודל זה יש תועלת רבה לשינוי, כולל השימוש xenografts נגזר המטופל.

למודל המוצג יש קווי דמיון להזרקת תרחיף תאים ישיר לעצם בעקבות גישה כירורגית ואחריה הזרקה דרך קליפת המוח או העברה לחלל המח לאחר ביצוע פגם קטן בקליפת המוח (עם או בלי כריתה של החלל המדולרי)8,14,15,16,17. עם זאת, ההשתלה של אלוגרפט גידולי הופכת טכניקה זו לשונה במובהק. לכן, מטרת דו"ח זה הייתה להדגים מודל זה של גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם מגידולים מוצקים, המתגבר על מגבלות רבות של מודלים שתוארו קודם לכן. קבוצות מחקר בעלות ניסיון בתרביות תאים, מודלים של עכברים, הרדמה וניתוחים של עכברים ואנטומיה של עכברים מצוידות היטב כדי לשחזר את הטכניקה שלנו למדל גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם בעכברים.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קיימברידג', קיימברידג', בריטניה.

1. הכנת קווי תאים

1. לגדל קווי תאים בהתאם לפרוטוקולי תרביות התאים הסטנדרטיים של המעבדה לתרבית תאים מסורתית או הזרקה לעכברים. פרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים כאן הם גידול בתווך הנשר המעובד של דולבקו המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), L-גלוטמין ופניצילין/סטרפטומיצין (להלן מדיום גדילה מלא).
   הערה: בניסוי זה, תאי Abrams osteosarcoma משמשים בעכברי Balb/c Foxn1 nu/nu . במחקרי סרטן השד נעשה שימוש בתאי 4T1 בעכברי Balb/c ובתאי EO771 בעכברי C57BL/6.
2. לגדל תאים בצלוחיות תרבית רקמה מאווררות או בצלחות תרבית רקמה 6 בארות ב 37 ° C ב 5% CO₂.
3. עוברים את קו העניין של התא ומכינים את התאים להזרקה כאשר התאים מגיעים למפגש נפוץ עם הזרקה של תאים אלה לעכברים.

2. בעלי חיים

1. השתמש Balb/c Foxn1 nu/nu עכברים לפחות 6-8 שבועות של גיל עבור יצירת גידול תת עורי כדי להבטיח כי בעלי החיים הם מעבר לשלב הצמיחה המהירה והגיעו בגרות ובגרות השלד.
2. השתמש בעכברים זכרים או נקבות. יש להחריג את בחירת שורות התאים המגיבות להורמונים (למשל, תאי סרטן השד בעכברים נקבות ותאי סרטן הערמונית בעכברים זכרים).
3. לניסויי xenograft, השתמשו בעכברים עירומים אתימיים מדוכאי חיסון המבוססים על כך שקו התאים אינו תואם למערכת החיסון של עכבר שלם בתנאים רגילים.
4. עבור ניסויים allograft באמצעות שורות תאים murine, זה מומלץ גם מבוסס על רקע גנטי וחיסוני שונה של עכבר. עם זאת, עבור ניסויים סינגניים, להשתמש בבעלי חיים מאותו זן כמו קו התא של עניין.
5. חיות בית בצפיפות סטנדרטית בהתאם למדיניות הגידול של המוסד.

3. גידולים תת עוריים

1. קצור קווי תאים מתרבית על ידי טריפסיניזציה והשהיה מחדש במי מלח סטריליים חוצצי פוספט (PBS).
2. הערך את כדאיות התא וקבע את צפיפות התא באמצעות שיטת ההרחקה הכחולה של טריפאן. השתמש בהמוציטומטר או מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים. כדאיות תא מינימלית של 90% תשמש להזרקה לעכברים ליצירת גידולים תת עוריים.
3. התאם את צפיפות התא כדי להזריק 1-2 x 10⁵ תאים בנפח סופי של 0.1 עד 0.15 מ"ל (100 עד 150 מיקרוליטר) של PBS סטרילי. שמור את התאים על קרח עד ההזרקה.
4. לחלופין, תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים הכדוריים בתווך מטריצת קרום מרתף סטרילי לא מדולל לקבלת 1-2 x 10⁵ תאים בנפח סופי של 0.1 עד 0.15 מ"ל (100 עד 150 מיקרוליטר). שמור את התאים על קרח עד לשימוש נוסף.
5. מרדימים עכברים שישמשו לצמיחת גידול תת עורי עם איזופלורן בהרדמת חמצן. יש להשתמש במינון אינדוקציה של 5% איזופלורן בחמצן של 2 ליטר/דקה ובמינון תחזוקה של 2-3% איזופלורן בחמצן של 2 ליטר/דקה. בדוק את חוסר הרפלקסים של המצמוץ או הדוושה לפני שתמשיך הלאה.
   הערה: איזופלורן הוא חומר הרדמה בשאיפה. השתמש isoflurane באזור מאוורר היטב עם נבלות מתאימות ומערכות איסוף גז חופשי. יש להתייעץ עם הצוות הווטרינרי המוסדי כדי לגבש תוכנית להשראת הרדמה, תחזוקה וניטור, ולוודא שלצוות המעבדה יש הכשרה מתאימה בניטור הרדמה ובטיפול בחומרי הרדמה נדיפים.
6. הסר שיער מהאזור הגבי של בית החזה או הבטן של עכברים מורדמים עם תמיסת depilating או עם קוצץ חשמלי. פתרון Depilating עדיף כדי למזער טראומה פוטנציאלית לעור. דלג על שלב זה אם אתה משתמש בעכברים עירומים אתימיים.
7. נקו את האזור המוכן עם מקלון אתנול 70% לפני הזרקת תרחיף התא.
8. השתמש מזרק שחפת 1 מ"ל עם מחט 27 G כדי להזריק תאים תת עורית על האזור הגבי של בית החזה או הבטן, לא להיות מושפע על ידי תנועה של השכמות. לחלופין, הזריקו את התאים באופן תת-עורי כתרחיף במטריצה חוץ-תאית זמינה מסחרית.
   הערה: הזרקה במטריצה חוץ-תאית זמינה מסחרית תגביל את נדידת תרחיף התא בחלל התת-עורי מכיוון שמטריצות אלה מתמצקות בטמפרטורת החדר.
9. החזירו את העכברים על כרית חימום בכלובים נפרדים עד לאמבולטורי. לאחר מכן ניתן להכניס עכברים לכלובים הרגילים שלהם עם מצעים נקיים ויבשים.
10. יש לעקוב אחר גודל הגידול התת עורי מעל בית החזה הגבי או הבטן עם קליפר ולמדוד את משקל הגוף מדי שבוע כדי לוודא שהגידולים התת עוריים אינם כיבים או שהעכברים עומדים בקריטריונים להסרה מוקדמת כפי שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסדות. גודל גידול מקסימלי של 15 מ"מ בכל ממד מומלץ כדי להפחית את הסיכון לכיב בעור או לנמק של הגידול המרכזי.
    הערה: עיין בהנחיות המקומיות כדי לקבוע גודל/נפח הגידול המרבי המותר.
11. המתת חסד של עכברים הנושאים גידולים תת עוריים לאחר שלושה עד ארבעה שבועות על ידי שאיפת_CO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם. פעל בהתאם למדיניות המקובלת של המוסד בנוגע להמתת חסד של עכברים.
12. קציר גידולים תת עוריים בטכניקה כירורגית אספטית. לעקר את העור מעל הגידול כמו קודם עם 70% אתנול לאחר הסרת השיער (אם רלוונטי). חתך דרך העור מעל הגידול עם להב אזמל #15 (עם או בלי ידית להב אזמל). נתחו בחדות את הגידול מהרקמות הרכות המחוברות שמסביב בעזרת זוג מספריים כירורגיים סטריליים.
13. מקם את הגידול בלוחות תרבית רקמה 6 בארות המכילות מדיום צמיחה שלם וטחון למספר שברים קטנים בגודל שנקבע מראש (~ 0.6 מ"מ x 0.6 מ"מ x 0.6 מ"מ – 0.25 מ"מ 3 עד 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ –^{1 מ"} מ³) עם להב אזמל #15 (עם או בלי ידית להב אזמל).
14. יש לשמור על שברי הגידול במצע צמיחה סטרילי שלם בטמפרטורת החדר עד למועד ההשתלה התוך-טיביאלית. עבור קווי תאים הנושאים גנים של לוציפראז או כתב פלואורסצנטי, השתמש בהדמיה ביולומינסנטית או פלואורסצנטית ex-vivo כדי לאשר את כדאיות הגידול לפני השתלה תוך טיביאלית בעכברים.
15. לשימור בהקפאה, הניחו מקטעים מרובים באותו קריוביאל במדיום גידול מלא בתוספת 20% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש להקפיא בהדרגה באמצעות מערכת הקפאה מסחרית בטמפרטורה של -80°C ולאחסן לטווח ארוך בחנקן נוזלי. שמור על שברי הגידול לניתוח לאחר מכן, אך לא להשתלה עתידית, על ידי הקפאת בזק באמצעות טבילת חנקן נוזלי. אחסנו את שברי הגידול הקפואים הללו לטווח ארוך בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: בעבר דווח כי גידולים קפואים בזק לא ישתרשו ויגדלו in vivo⁸.

4. השתלה כירורגית של שברי גידול תת עורי

1. יש להביא שברים טריים או שמורים בהקפאה של גידול תת עורי לטמפרטורת החדר במצע צמיחה מלא לפני ההשתלה הכירורגית.
2. מרדימים עכברים מהזן המעניין באמצעות איזופלורן בהרדמת חמצן כמתואר בסעיף 3. בדוק את היעדר רפלקסי הדוושה לפני שתמשיך. לנהל buprenorphine תת עורית במינון של 0.02-0.05 מ"ג / ק"ג כדי לספק שיכוך כאבים peri-operation. ניתן לחזור על כך כל 6-8 שעות בתקופה שלאחר הניתוח, במידת הצורך.
3. הסר שיער על מפרק הברך הימני ואת השוקה הפרוקסימלית של הגפה האחורית עם פתרון depilating כדי למזער את הטראומה הפוטנציאלית לעור.
4. לשפשף את האזור מוכן עם חיטוי כירורגי. יש לשפשף תחילה עם מקלון אתנול 70% ולאחר מכן לשפשף עם כלורהקסידין וקרצוף מלוחים לסירוגין.
5. דמיינו את השוקה הפרוקסימלית כאזור פשוט דיסטלי למפרק הברך תוך כדי כיפוף והארכת המפרק.
6. צור חתך 3-4 מ"מ ברמת השוקה הפרוקסימלית באספקט המדיאלי של הגפה עם להב אזמל #15 (עם או בלי ידית להב אזמל). חותכים דרך העור והרקמה התת עורית כדי לחשוף את קליפת המוח המדיאלית של השוקה הפרוקסימלית.
7. הפעילו לחץ עדין עם קצה של מחט 25 גרם, תוך כדי סיבוב הקצה, כדי ליצור חור קטן בקליפת המוח המדיאלית של השוקה הפרוקסימלית. הפוך את החור הזה לדיסטלי בערך 2 מ"מ למפרק הברך בנקודה שווה בין קליפת המוח הטיביאלית הגולגולתית והקאודלית. בחר את גודל המחט בהתאם לגודל של שברי הגידול.
8. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להרים ולהחדיר את שברי הגידול לתוך החלל המדולרי של השוקה הפרוקסימלית. השתמש במחט של 27 עד 30 גרם כדי לתפעל את קטע הגידול לתוך התעלה המדולרית. בהתאם לגודל שברי הגידול, יש להשתיל לפחות 0.5 מ"מ³ נפח גידול כולל בכל שוקה. זה עשוי לדרוש השתלה של 1 או יותר שברי הגידול בהתאם לגודל של קטעי הגידול שנוצרו.
   הערה: שינויים כדי למנוע או להגביל את התזוזה של השתל מחוץ לעצם יהיו מיקום של שעוות עצם או מלט עצם בפגם העצם או קצף ג'ל או שתל שומן תת עורי מעל החור בעצם.
9. יש להדביק את קצוות העור בעזרת דבק רקמה נוזלי סטרילי או תפר עור יחיד. אין להשתמש בקליפסים לפצעים באתר זה. היזהר אם אתה משתמש בהדמיה פלואורסצנטית בתקופה שלאחר הניתוח, שכן הן דבקי רקמות והן תפר יש פוטנציאל פלואורסצנטי.
10. החזירו את העכברים על כרית חימום בכלובים נפרדים עד לאמבולטורי.

5. הערכה טורית ונקודת קצה

1. מרדימים עכברים באמצעות איזופלורן בהרדמת חמצן כפי שתואר קודם לכן.
2. להעריך את צמיחת הגידול הטיביאלי באופן לא פולשני על ידי רדיוגרפיה דיגיטלית שבועית, ביולומינסנציה או הדמיה פלואורסצנטית (אם משתמשים בתאים המבטאים לוציפראז או בגן כתב פלואורסצנטי). מדידות קליפר של האיבר באתר ההשתלה יכולות להתבצע גם בעכברים ערים.
3. בנוסף לניטור המסורתי של עכברים נושאי גידול (משקל גוף, רמת פעילות, קצב נשימה, טיפוח, יציבה, מנטציה והתנהגות) יש לעקוב אחר עכברים מדי שבוע לאיתור סימנים של צליעה בגפיים האחוריות, נפיחות וזיהום באתר הניתוח.
4. יש לעקוב אחר הפצע הניתוחי בעור במשך 10-14 הימים הראשונים לאיתור אדמומיות יתר, נפיחות, ניקוז והידרדרות הפצע עד לריפוי פצע העור. לאחר 4-5 שבועות, יש להעריך עכברים בהתאם להערכת תוצאות המחקר בחיים או לאחר המתת חסד.

תוצאות

תוצאה חיובית תהיה קשורה לקליטת הגידול ולצמיחת הגידול המתקדמת לאורך זמן. בהתאם לסוג הגידול, גידול תוך אוסוסי עשוי להיות קשור לצליעה מתקדמת בגפיים האחוריות, אך גידולים רבים אינם גורמים לצליעה למרות סימנים של מחלת עצם נלווית. השתלה מוצלחת תועדה באמצעות הדמיה מתקדמת, לפיה יהיו שינויים רדיוגר...

Discussion

דו"ח זה מתעד את המודל שלנו ליצירת גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם לאחר השתלה תוך טיביאלית של אלוגרפט גידולי. אנו מאמינים כי ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך זה. יש לקבוע מישור הרדמה בטוח הן להזרקה תת עורית של תרחיף תאי הגידול והן למיקום תוך טיביאלי של שברי הגידול המתקבלים. צריכה להיות הכנה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed