توصيف خصائص النقل داخل الغضاريف لحاملات الببتيد الموجب

Summary

يحدد هذا البروتوكول امتصاص التوازن وعمق الاختراق ومعدل الانتشار غير المتوازن لحاملي الببتيد الموجب في الغضاريف. توصيف خصائص النقل أمر حاسم لضمان استجابة بيولوجية فعالة. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتصميم ناقلات المخدرات مشحونة على النحو الأمثل لاستهداف الأنسجة المشحونة سلبا.

Abstract

العديد من الأنسجة المشحونة سلبا في الجسم، مثل الغضاريف، تشكل حاجزا أمام تسليم المخدرات المستهدفة بسبب كثافة عالية من aggrecans مشحونة سلبا، وبالتالي، تتطلب أساليب استهداف محسنة لزيادة استجابتها العلاجية. لأن الغضاريف لديها كثافة عالية تهمة ثابتة سلبية، يمكن تعديل الأدوية مع ناقلات المخدرات مشحونة بشكل إيجابي للاستفادة من التفاعلات الكهروستاتيكية، مما يسمح لتعزيز نقل المخدرات داخل الغضاريف. ولذلك، فإن دراسة نقل ناقلي المخدرات أمر بالغ الأهمية للتنبؤ بفعالية العقاقير في الحث على الاستجابة البيولوجية. نعرض تصميم ثلاث تجارب التي يمكن أن تحدد كمية امتصاص التوازن, عمق الاختراق وعدم التوازن معدل الانتشار من حاملات الببتيد الموجبة في explants الغضروف. توفر تجارب امتصاص التوازن مقياسًا لتركيز المذاب داخل الغضاريف مقارنة بالحمام المحيط به ، وهو مفيد للتنبؤ بإمكانات حامل الدواء في تعزيز التركيز العلاجي للأدوية في الغضاريف. عمق دراسات الاختراق باستخدام المجهر confocal تسمح للتمثيل البصري للانتشار 1D من منطقة سطحية إلى منطقة عميقة من الغضاريف، وهو أمر مهم لتقييم ما إذا كانت السولات تصل إلى المصفوفة ومواقعها المستهدفة الخلوية. دراسات معدل الانتشار غير المتوازن باستخدام غرفة نقل مصممة خصيصاً تمكن من قياس قوة التفاعلات الملزمة مع مصفوفة الأنسجة من خلال توصيف معدلات انتشار الفلورسنتات المسماة عبر الأنسجة؛ وهذا مفيد لتصميم الناقلين من قوة الربط الأمثل مع الغضاريف. وتوفر النتائج التي تم الحصول عليها معا من تجارب النقل الثلاث مبادئ توجيهية لتصميم ناقلات المخدرات المشحونة على النحو الأمثل التي تستفيد من تفاعلات الشحن الضعيفة والقابلة للعكس لتطبيقات توصيل المخدرات. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطرائق التجريبية لتقييم نقل المخدرات والاقترانات بين ناقلي المخدرات. علاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه الأساليب للاستخدام في استهداف الأنسجة الأخرى المشحونة سلبا مثل الغضروف المفصلي والقرنية والفكاهة الزجاجي.

Introduction

لا يزال تسليم المخدرات للأنسجة المشحونة سلبا في الجسم تحديا بسبب عدم قدرة المخدرات على اختراق عمق الأنسجة للوصول إلى الخلايا والمصفوفة المواقع المستهدفة¹. العديد من هذه الأنسجة تتألف من كثيفة معبأة، واتهم سلبا aggrecans التي تخلق كثافة عالية تهمة ثابتة سالبة (FCD)² داخل الأنسجة وتعمل كحاجز لتسليم معظم الجزيئات^{الكبيرة 3،4}. ومع ذلك، بمساعدة من حاملي المخدرات المشحونة إيجابيا، يمكن تحويل هذا الحاجز الأنسجة المشحونة سلبا في الواقع إلى مستودع للمخدرات عن طريق تفاعلات شحنة الكهربائية الساكنة للتسليم المستمر للمخدرات^1،5،6،7( الشكل1).

الشكل 1: الشحن القائم على التسليم داخل الغضاريف من CPCs. الحقن داخل المفصل من CPCs في مساحة مفصل الركبة. التفاعلات الكهروستاتيكية بين CPCs مشحونة بشكل إيجابي ومجموعات aggrecan المشحونة بشكل سلبي تمكن من اختراق العمق السريع والكامل من خلال الغضاريف. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami وآخرون^4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في الآونة الأخيرة، قصير طول الببتيد حاملات (CPCs) تم تصميمها بهدف خلق مجالات الموجبة الصغيرة قادرة على حمل علاجات أكبر الحجم لتسليم الغضروف المشحونة سلبا⁴. للتسليم الفعال للأدوية إلى الغضروف لعلاج انتشار^8,9 والأمراض التنكسية مثل هشاشة العظام (OA)¹⁰, فمن الأهمية بمكان أن تتغلغل التركيزات العلاجية للأدوية عميقا داخل الأنسجة, حيث غالبية خلايا الغضاريف (chondrocytes) تكمن¹¹. على الرغم من أن هناك العديد من الأمراض المحتملة تعديل الأدوية المتاحة, لم يحصل أي موافقة ادارة الاغذية والعقاقير لأن هذه غير قادرة على استهداف الغضروف بشكل فعال^12,13. ولذلك، فإن تقييم خصائص نقل ناقلي المخدرات ضروري للتنبؤ بفعالية الأدوية في الحث على الاستجابة العلاجية. هنا، قمنا بتصميم ثلاث تجارب منفصلة يمكن استخدامها لتقييم امتصاص التوازن، وعمق الاختراق، ومعدل الانتشار غير المتوازن لCSCS⁴.

لضمان وجود تركيز كاف من المخدرات داخل الغضاريف التي يمكن أن توفر استجابة علاجية مثلى، تم تصميم تجارب الامتصاص لتحديد التوازن تركيز CPC في الغضاريف⁴. في هذا التصميم، وبعد التوازن بين الغضروف والحمام المحيطة بها، يمكن تحديد المبلغ الإجمالي من المذاب داخل الغضروف (إما ملزمة إلى المصفوفة أو الحرة) باستخدام نسبة امتصاص. وتحسب هذه النسبة عن طريق تطبيع تركيز solutes داخل الغضاريف إلى أن من حمام التوازن. من حيث المبدأ، فإن السونات المحايدة، التي لا يساعدها التفاعلات الشحنية في انتشارها عبر الغضاريف، سيكون لها نسبة امتصاص أقل من 1. وعلى العكس من ذلك، فإن الوبلوتات الموجبة، التي يتم تعزيز نقلها عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية، تظهر نسبة امتصاص أكبر من 1. ومع ذلك ، كما هو مبين مع CPCs ، يمكن أن يؤدي استخدام الشحنة الإيجابية المثلى إلى نسب امتصاص أعلى بكثير (أكبر من 300)^4.

على الرغم من أن تركيز المخدرات العالية داخل الغضروف مهم لتحقيق فائدة علاجية ، إلا أنه من المهم أيضًا أن تنتشر الأدوية من خلال السماكة الكاملة للغضاريف. ولذلك، هناك حاجة إلى دراسات تبين عمق الاختراق لضمان وصول الأدوية إلى عمق الغضاريف حتى يمكن الوصول إلى مواقع المصفوفة والخلايا المستهدفة، وبالتالي توفير علاج أكثر فعالية. وقد صُممت هذه التجربة لتقييم انتشار الوبات في اتجاه واحد من خلال الغضاريف، محاكياً انتشار المخدرات في الغضاريف بعد الحقن داخل المفصلي في الجسم الحي. يسمح التصوير الفلوري باستخدام المجهر الناسخ بتقييم عمق الاختراق في الغضاريف. صافي الجسيمات تهمة تلعب دورا رئيسيا في الاعتدال كيف المخدرات العميقة يمكن أن تنتشر من خلال المصفوفة. مطلوب الشحن الصافي الأمثل على أساس FCD الأنسجة للسماح لتفاعلات الربط ضعيفة قابلة للعكس بين الجسيمات الموجبة ومصفوفة الأنسجة anionic. وهذا يعني أن أي تفاعل ضعيف بما فيه الكفاية بحيث يمكن للجسيمات أن تنأى عن المصفوفة ولكن يمكن عكسها في الطبيعة بحيث يمكن ربطها بموقع ملزم آخر داخل النسيج^4. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تكون الشحنة الصافية الموجبة المفرطة للجسيمات ضارة نحو الانتشار، حيث أن ربط المصفوفة القوي جداً يمنع انفصال الجسيمات عن موقع الربط الأولي في المنطقة السطحية للغضاريف. وهذا من شأنه أن يؤدي إلى استجابة بيولوجية غير كافية لأن غالبية المواقع المستهدفة تقع في عمق الأنسجة¹¹.

لمزيد من التحديد الكمي لقوة التفاعلات الملزمة ، فإن تحليل معدلات انتشار المخدرات من خلال الغضاريف مفيد. دراسات الانتشار غير المتوازن تسمح بمقارنة معدلات الانتشار في الوقت الحقيقي بين مختلف العاهرات. كما تنتشر المخدرات من خلال المناطق السطحية والوسطى والعميقة للغضاريف، وجود التفاعلات ملزمة يمكن أن تغير إلى حد كبير معدلات الانتشار. عندما تكون التفاعلات الملزمة موجودة بين الأدوية ومصفوفة الغضاريف ، يتم تعريفها على أنها الناشرة الفعالة (D_EFF). في هذه الحالة، مرة واحدة وقد تم شغل جميع المواقع ملزمة، ويخضع معدل انتشار المخدرات من قبل انتشار ثابت الدولة (D_SS). المقارنة بين D_EFF من مذاب مختلفة يحدد قوة الربط النسبية من solutes مع المصفوفة. بالنسبة لملذاب معين، إذا كان D_EFF وD_SS ضمن نفس الترتيب من الحجم، فإنه يعني أن هناك الحد الأدنى من الربط الحالي بين المخدرات والمصفوفة أثناء الانتشار. ومع ذلك، إذا كان D_EFF أكبر من D_SS، فإن الربط الكبير للجسيمات إلى المصفوفة موجود.

التجارب المصممة تسمح بشكل فردي لتوصيف النقل المذاب من خلال الغضاريف ، ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تحليل شامل شامل لجميع النتائج لتصميم ناقل مخدرات مشحون على النحو الأمثل. تتحكم الطبيعة الضعيفة والقابلة للعكس في تفاعلات الشحن في معدل انتشار الجسيمات وتسمح باستخلاص توازن عالي واختراق العمق الكامل السريع من خلال الغضاريف. ومن خلال تجارب امتصاص التوازن، ينبغي أن نبحث عن حاملات تظهر درجة عالية من الإقبال نتيجة لتفاعلات الشحن التي يمكن التحقق منها باستخدام دراسات معدل الانتشار غير المتوازن. ومع ذلك، ينبغي أن تكون هذه التفاعلات ملزمة ضعيفة وعكسها في الطبيعة للسماح لاختراق كامل سمك من المنقلب من خلال الغضاريف. الناقل المثالي للمخدرات تمتلك تهمة الأمثل الذي يتيح قوية بما فيه الكفاية ملزمة لامتصاص وارتفاع داخل الغضاريف المخدرات التركيزات، ولكن ليس قوية جدا لعرقلة نشر كامل سمك⁴. وستساعد التجارب المعروضة في خصائص تصميم الأنسجة القائمة على الرسوم التي تستهدف حاملي المخدرات. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لتميز نقل الحزب الشيوعى الصينى من خلال^{الغضروف 4}، ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه على مجموعة متنوعة من المخدرات وحاملي المخدرات من خلال الغضاريف وغيرها من الأنسجة المشحونة سلبا.

Protocol

تم الحصول على موافقات الجامعة لإجراء التجارب على الأنسجة الميتة. تم الحصول على مفاصل الأبقار تجاريا من المسلخ.

1- استخراج الغضاريف

1. باستخدام مشرط (#10 شفرة)، وقطع وإزالة الدهون والعضلات والأربطة والأوتار وجميع الأنسجة الضامة الأخرى لفضح الغضروف من الأخدود فيموروباتيلار من مفاصل الركبة البقرية.
2. باستخدام 3 مم و 6 ملم اللكمات الجلدية، وجعل اللكمات عمودي في الغضاريف لاستخراج المقابس أسطواني. ضع على الفور المقابس في الآبار الفردية من لوحة 48 بئرًا تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول الفوسفات الاحتياطي 1x (PBS) المكملة بنسبة 1٪ v/v مضاد للمضادات الحيوية.
3. وضع الجانب السطحي من المكونات الغضروف التي تواجهها إلى أسفل إلى بئر في لاعبا اساسيا تشريح (الشكل 2). باستخدام شفرة حلاقة، شريحة المكونات على طول سطح لاعبا اساسيا تقطيع للحصول على explant غضروف سميكة 1 مم التي تشمل المنطقة السطحية. كرر كل غضروف المكونات.
4. غضروف التخزين explants بشكل فردي في أنابيب البولي بروبلين التي تحتوي على 500 ميكرولتر من 1X PBS تكملها مثبطات البروتياز (PBS-PI, 1 PI مصغرة قرص لكل 50 مل 1X PBS) في -20 درجة مئوية.
5. قبل إجراء كل من تجارب النقل التالية، اذيب القنينات التي تحتوي على explant لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.

الشكل 2: مصممة خصيصا fixture تقطيع. المعلمات تصميم الفولاذ المقاوم للصدأ تشريح لاعبا اساسيا تستخدم لتشريح explants الغضروف من 3 و 6 ملم القطر. تم وضع إدراجات بلاستيكية ذات سمك متفاوت داخل الآبار لضبط سمك explants شرائح. تم استخدام دبوس أسطواني الفولاذ المقاوم للصدأ من < 1 مم القطر لدفع explant للخروج من لاعبا اساسيا. يتم عرض جميع القيم العددية في مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2- اتقم توازن انكماش الانبعاثات الكيميائية في الغضاريف

1. الداب بلطف explantage (3 مم dia. X 1 مم سميكة.) مع مسح مهمة حساسة لإزالة برنامج تلفزيوني 1X الزائدة من سطح explant. باستخدام التوازن، سجل بسرعة الوزن الرطب لكل explant ثم وضع على الفور في حمام برنامج تلفزيوني 1x لمنع الجفاف.
2. إعداد 30 μM الحلول (300 ميكرولتر لكل explant) من الفلورسنت المسمى CPCs في 1x PBS-PI. استخدام أنابيب البولي بروبلين الخالية من RNase لإعادة تشكيلها.
3. في لوحة 96-well، ماصة 300 ميكرولتر من كل 30 ميكرومتر الحل في آبار منفصلة. تجنب استخدام الآبار بالقرب من حافة الصفيحة لمنع التبخر. باستخدام ملعقة، نقل كل explant إلى الحل الذي يحتوي على الآبار.
4. املأ الآبار المحيطة بـ 300 ميكرولتر من 1x PBS واغطي لوحة البئر بالغطاء. ختم حواف لوحة مع فيلم مرنة للحد من التبخر.
5. داخل حاضنة 37 درجة مئوية، ضع اللوحة على لوحة شاكر للحد من ترسيب الجسيمات. احتضان لمدة 24 ساعة تحت تناوب لطيف (50 دورة في الدقيقة مع مدار 15 ملم) للسماح باستيعاب التوازن من CPCs في الغضاريف(الشكل 3).
6. إنشاء منحنى قياسي للارتباط من الفلوريسكين لتركيز CPC
   1. إعداد التخفيفات التسلسلية من حلول CPC من 30 ميكرومتر – 0 μM (10 2 أضعاف التخفيف) في 1x PBS-PI في أنابيب البولي بروبلين. تأكد من وجود ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من كل تخفيف.
   2. أضف 200 ميكرولتر من كل تخفيف إلى آبار متتالية في لوحة سوداء 96 بئرًا. مكررة في صف آخر لزيادة حجم العينة.
   3. الحصول على قراءات الفلوريسنس لكل عينة باستخدام قارئ لوحة في الإثارة والطول الموجي للانبعاثات من التسمية الفلورية باستخدام قارئ لوحة.
   4. رسم قراءة الفلوريسين مقابل تركيز CPC واستمد معادلة للجزء الخطي من المنحنى.
      ملاحظة: للحد من التغير في قراءات الفلوريسين، احتضان حل الأسهم CPC في ظل نفس الظروف مثل لوحة العينة قبل توليد المنحنى القياسي.
7. بعد 24 ساعة من الحضانة، وجمع حمام التوازن من كل بئر في أنابيب البولي بروبلين منفصلة.
8. نقل 200 ميكرولتر من كل حل إلى آبار منفصلة من لوحة سوداء 96-جيدا. الحصول على قراءات الفلوريسنس لكل عينة تحت نفس إعدادات الفلورسنت كما هو الحال بالنسبة للمنحنى القياسي. إذا لزم الأمر، قم بتخفيف العينة في 1x PBS-PI لضمان أن القراءات تقع ضمن الجزء الخطي من المنحنى القياسي.

الشكل 3: التخطيطي لتجارب امتصاص التوازن. وضعت explants الغضاريف (3 مم dia. x 1 مم) في آبار الأفراد في لوحة 96-well تحتوي على حل CPC الموسومة بالفلورسنت. بعد 24 تم upence ح تم upence بواسطة الغضاريف، وبالتالي تقليل الفلورس من الحمام المحيطة بها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. عمق اختراق CPCs في الغضاريف

1. إعداد 30 μM الحلول (300 ميكرولتر لكل explant) من الفلورسنت المسمى CPCs في 1x PBS-PI. استخدام أنابيب البولي بروبلين الخالية من RNase لإعادة تشكيلها.
2. باستخدام مشرط، وقطع explants الغضروف (6 مم قطرها × 1 مم سمك) في النصف لجعل نصف الأقراص. حافظ على رطوبة explant مع طبقة من 1x PBS-PI أثناء القطع.
3. الغراء explant نصف القرص في منتصف بئر واحدة من غرفة النقل 1-الأبعاد المصممة خصيصا باستخدام الايبوكسي(الشكل 4، الشكل 5). ضمان تطبيق الايبوكسي على الجانب المحيطي (المنحني) من explant. إزالة الغراء الزائد من البئر لمنع الاتصال مع منطقة سطح الانتشار للغضاريف وتقديم مذكرة من الجانب السطحي من explant.
4. إضافة 80 ميكرولتر من 1X PBS-PI إلى كلا الجانبين من explant. الماصات السائل صعودا وهبوطا من جانب واحد من explant للتحقق من تسرب إلى الجانب الآخر. إذا حدث تسرب، إعادة تعديل explant وتطبيق الايبوكسي حسب الحاجة.
5. استبدل 1x PBS-PI من الجانب الذي يواجه السطح السطحي للغضاريف (المنبع) بـ 80 ميكرولتر من محلول CPC 30 ميكرومتر. الحفاظ على 80 ميكرولتر من 1x PBS-PI على الجانب الذي يواجه المنطقة العميقة من الغضاريف (المصب).
6. ضع غرفة النقل بعناية في حاوية قابلة للغطاء. تغطية قاعدة من الحاوية مع طبقة 1X برنامج تلفزيوني لتجنب تبخر الحلول. تأكد من عدم وجود اتصال مباشر بين الحلول من غرف المنبع والمصب.
7. ضع الحاوية المغطاة على لوحة شاكر للحد من ترسيب الجسيمات. احتضان إما 4 أو 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت تناوب لطيف (50 دورة في الدقيقة مع مدار 15 ملم).
8. بعد الحضانة، وإزالة explant من الغرفة وقطع ~ 100 μm شريحة من وسط explant.
   ملاحظة: هذا المقطع عرضية شاملة من المناطق السطحية والوسطى والعميقة للغضاريف.
9. ضع الشريحة بين شريحة زجاجية وأغطية. هيدرات شريحة مع طبقة من 1x PBS-PI.
10. في التكبير 10x، صورة من خلال سمك كامل من شريحة للحصول على z-كومة من الصور الفلورية باستخدام المجهر confocal.
11. باستخدام مشروع ImageJ متوسط كثافة الصور داخل المكدس z لتحديد عمق اختراق CPCs في الغضاريف.
    1. فتح كومة الصورة عن طريق النقر على ملف | مفتوح.
    2. انقر على 'صورة' على شريط المهام وانقر على صورة | مداخن | Z المشروع من القائمة المنسدلة.
    3. إدخال أرقام شريحة من 1 إلى الشريحة النهائية. حدد'متوسط الكثافة'ضمن نوع العرض. انقر على'موافق.'

الشكل 4: غرفة النقل 1-D المصممة خصيصًا. المعلمات تصميم من غرفة النقل PMMA 1D مع 6 آبار فردية. يتم عرض جميع القيم العددية في مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: التخطيطي لعمق دراسات الاختراق. تم قطع explants الغضاريف (6 مم قطر × 1 ملم سمك) في النصف وثابتة في مركز 1-D آبار النقل الناشر. تم إضافة حل CPC الموسومة بفلورسنتلي إلى جانب البئر على اتصال بالمنطقة السطحية (SZ) من الغضاريف. 1x PBS-PI تمت إضافتها إلى جانب البئر على اتصال مع المنطقة العميقة (DZ) من الغضاريف. وبعد الانتشار، تم تصوير مقطع عريض من الغضاريف (3 مم × 1 مم) باستخدام المجهر الناثق. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami et^{al. 4} و Bajpayee et^{al. 3،}يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4- معدل انتشار الانبعاثات غير المتوازنة من اصنـاء الـ CPCs في الغضاريف

1. جلب نصفي غرفة النقل المصممة خصيصا (الشكل 6) معا لتجميع وإغلاق الغرفة. استخدام غسالات، والمكسرات والبراغي لإغلاق بإحكام الغرفة مع وجع.
   ملاحظة: يجب أن تكون غرفة النقل شفافة لعدم التعارض مع القراءات الفلورية. غرف النقل المستخدمة في هذا البروتوكول مصنوعة من بولي ميثيلميتهاكريلات (PMMA).
2. معطف المساحة الداخلية للغرفة مع 0.5٪ ث / V حل الحليب البقري غير الدهني في 1X PBS (2 مل لكل غرفة) لمدة 15 دقيقة لمنع ربط غير محددة من CPCs إلى جدران الغرفة. ثم شطف الغرفة مع 1X PBS (2 مل لكل غرفة).
3. باستخدام لاعبا اساسيا التقطيع المصممة خصيصا (الشكل 2) وشفرة الحلاقة ، شريحة explant غضروف قطر 6 مم (الطائرة العرضية) إلى سمك 500-800 μm ، بما في ذلك المنطقة السطحية. حافظ على explant رطب مع 1x PBS.
4. باستخدام اللكمات التي تحركها المطرقة والجلد، وخلق الحشيات من صفائح مطاطية كما هو مبين في الشكل 7.
5. تجميع كل غرفة نصف النقل لتشمل 1 طوقا مطاطيا كبيرا، 1 PMMA إدراج و 1 طوقا مطاطي صغير لكل من. وضع explant في آبار إدراج البلاستيك، مع منطقة سطحية تواجه غرفة المنبع. ساندويتش نصفين معا لإكمال الجمعية والمسمار بإحكام باستخدام وجع (الشكل 7).
6. ملء غرفة المنبع مع 2 مل من 1X PBS-PI ومراقبة غرفة المصب لتسرب السوائل من غرفة المنبع. إذا كان التسرب موجودًا ، إعادة تجميع الغرفة ، وتعديل موضع طوقاً وضيق البراغي. إذا لم يكن تسرب، ملء غرفة المصب مع 2 مل 1X PBS-PI كذلك.
7. يُضاف بار صغير إلى غرف أعلى وهاب النهر وضع الغرفة على لوحة مقلّد. محاذاة الغرفة بحيث يتم تركيز الليزر من مقياس الطيف الضوئي نحو مركز غرفة المصب. ضع جزء مستقبل الإشارة من مقياس الطيف الضوئي خلف غرفة المصب(الشكل 8).
   ملاحظة: يجب أن يكون الليزر والمستلم من مقياس الطيف مجهزة المرشحات المناسبة لإثارة، وتنبعث منها ونقل الإشارات من البروتين المسمى الفلورسنت. حماية غرفة النقل من الضوء باستخدام صندوق أسود أثناء التجريب لتجنب التداخل في إشارة الفلوريسنس. ومن أفضل الممارسات لختم فتحات على رأس الغرفة مع فيلم مرنة لتجنب التبخر.
8. جمع في الوقت الحقيقي قراءات الانبعاثات الفلورية المصبّيّة وضمان إشارة مستقرة لمدة 5 دقائق على الأقل.
   ملاحظة: يمكن الحصول على Aliquots من غرفة المصب وتقييمها لفلوريسنس باستخدام قارئ لوحة إذا لم يتوفر مقياس الطيف أو غرفة النقل الشفافة المصممة خصيصًا.
9. Pipette حجم محتسب مسبقا من محلول المخزون من الفلورسنت الموسومة CPCs في غرفة المنبع لضمان تركيز نهائي من 3 μM داخل غرفة المنبع. مراقبة إشارة المصب fluorescence والسماح للنقل المذاب للوصول إلى زيادة مطردة في المنحدر.
   ملاحظة: سوف explant الغضروف سمكا تتطلب وقتا أطول للوصول إلى حالة ثابتة.
10. بمجرد أن يتم الوصول إلى حالة ثابتة، خذ 20 ميكرولتر من غرفة المنبع وأضيف إلى غرفة المصب ("اختبار الارتفاع").
    ملاحظة: سيتم ملاحظة ارتفاع في الفلورس المصب. وهذا سيسمح للارتباط بين قراءات الفلوريسنس وتركيزات الـ CPC.
11. جمع قراءات الفلورانس في الوقت الحقيقي.

الشكل 6: غرفة نقل غير متوازنة مصممة خصيصاً. المعلمات تصميم من PMMA غير التوازن في نقل غرفة. يجب أن تكون الغرفة شفافة لعدم التدخل في قراءات الفلوريسنس. وتألفت غرفة النقل كاملة من نصفين متطابقة من لاعبا اساسيا هو مبين. وكان هناك حاجة إلى اثنين من دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ أسطواني (~ 2.94 ملم قطر، ~ 18 مم طويلة) لضمان المحاذاة والإغلاق الكامل لنصفي الغرفة. وأدلت أربع فتحات متطابقة ل6-32 مسامير الموضوع في كل ركن من أركان الغرفة لتجميع ضيق المسمار. يتم عرض جميع القيم العددية في ملليمتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: غرفة نقل غير اتزانية غير مُزَوّرة. المعلمات تصميم (A) إدراج PMMA أسود و (B) حشيات مطاطية كبيرة وصغيرة. تم تعديل سمك الحشيات المطاطية لضمان الإغلاق المحكم للغرفة. يتم عرض جميع القيم العددية في mm. (C) التخطيطي تبين ترتيب التجمع لاثنين من نصفي غرفة النقل مع extilage وضعت في المركز. يشير SZ إلى منطقة سطحية من الغضاريف التي كانت تواجه غرفة المنبع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: التخطيط لتجارب الانتشار غير المتوازن. وضعت explants الغضروف (6 مم قطر × 1 مم سمك) في وسط غرفة النقل مع سطح سطحية تواجه غرفة المنبع. تم ملء كلا الجانبين صعودا وهبوطا من الغرفة مع 1x PBS-PI ومختلطة باستخدام شريط ضجة مصغرة. مع ليزر وأشار نحو غرفة المصب لجمع قراءات الفلورسنت، تم إضافة حل CPC الموسومة الفلورية إلى غرفة المنبع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

بعد امتصاص التوازن من CPCs عن طريق الغضاريف، وفلورية الحمام يقلل عندما تم upute upute من الأنسجة. ومع ذلك، إذا كانت قيمة الفلوريسنس من الحمام النهائي لا تزال مماثلة للاولى، فإنه يشير إلى أنه لا يوجد أي /الحد الأدنى من امتصاص المذاب. تأكيد آخر من امتصاص مذاب هو إذا كان النسيج قد تغير اللون بشكل واضح...

Discussion

10- إن الأساليب والبروتوكولات المذكورة هنا هامة في مجال تسليم الأدوية المستهدفة للأنسجة المشحونة سلباً. بسبب الكثافة العالية لل aggrecans المشحونة سلبا الموجودة في هذه الأنسجة، يتم إنشاء حاجز، وبالتالي منع الأدوية من الوصول إلى مواقعها المستهدفة الخلوية التي تقع في عمق المصفوفة. للتصدي لهذا ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
316 Stainless Steel SAE Washer	McMaster-Carr	91950A044	For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate	Fisherbrand	12566620	Black
Acrylic Thick Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	100x
Bovine Cartilage	Research 87	N/A	2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Custom designed peptide
CPC+20	LifeTein	LT1525	Custom designed peptide
CPC+8	LifeTein	LT1523	Custom designed peptide
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Dermal Punch	MedBlades	MB5-1	3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning Costar	3595	Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film	Bemis Parafilm M Laboratory	1337412
Gold Seal Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	6378701	# 1.5, 18x18 mm
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A15	1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A19	3/4" Diameter
Laser	Chroma Technology	AT480/30m	Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7x2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet	McMaster-Carr	1370N12	1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk	Sigma Aldrich	M7409
Petri Dish	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CMR	1x
Plate Shaker	VWR	89032-088
Protease Inhibitors	Thermo Scientific	A32953
Razor Blades	Fisherbrand	12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	Black transport chamber inserts
RTV Silicone	Loctite	234323	Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel	TedPella	549-3	#10, #11 blades
Signal Receiver	Chroma Technology	ET515lp	Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22363204	1.5 mL
Spatula	TedPella	13508
Synergy H1 Microplate Reader	Biotek	H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Thread size, 1" Long