توصيل الأجسام المضادة إلى الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة

Summary

يظهر هنا بروتوكول لفتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB) بشكل عابر إما عن طريق الفوك أو في جميع أنحاء دماغ الفأر لتوصيل الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. كما تم تقديم طريقة للكشف عن تسليم الأجسام المضادة وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق علم الأنسجة.

Abstract

يتم تناول جزء صغير فقط من الأجسام المضادة العلاجية التي تستهدف أمراض الدماغ من قبل الدماغ. توفر الموجات فوق الصوتية المركزة إمكانية زيادة امتصاص الأجسام المضادة والمشاركة من خلال الفتح العابر للحاجز الدموي الدماغي (BBB). في مختبرنا ، نقوم بتطوير أساليب علاجية للأمراض العصبية التنكسية حيث يتم تسليم جسم مضاد بأشكال مختلفة عبر BBB باستخدام microbubbles ، بالتزامن مع تطبيق الموجات فوق الصوتية المركز من خلال الجمجمة التي تستهدف بقع متعددة ، وهو نهج نشير إليه باسم الموجات فوق الصوتية (SUS). تزيد التأثيرات الميكانيكية للفقاعات الدقيقة والموجات فوق الصوتية على الأوعية الدموية من النقل شبه الخلوي عبر BBB عن طريق فصل التقاطعات الضيقة بشكل عابر وتعزز نقل الخلايا بوساطة الحويصلة ، مما يسمح للأجسام المضادة والعوامل العلاجية بالعبور بفعالية. علاوة على ذلك ، تسهل الموجات فوق الصوتية أيضا امتصاص الأجسام المضادة من الدماغ الخلالي إلى خلايا الدماغ مثل الخلايا العصبية حيث ينتشر الجسم المضاد في جميع أنحاء جسم الخلية وحتى في العمليات العصبية. في دراساتنا ، يتم تحضير الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية ، وخلطها مع الفقاعات الدقيقة القائمة على الدهون المحضرة داخليا وحقنها في الفئران مباشرة قبل تطبيق SUS على الدماغ. ثم يتم تحديد تركيز الأجسام المضادة المتزايد في الدماغ. لحساب التغيرات في توازن الدماغ الطبيعي ، يمكن استخدام البلعمة الدبقية الدقيقة كعلامة خلوية. تشير البيانات التي تم إنشاؤها إلى أن توصيل الموجات فوق الصوتية للأجسام المضادة هو نهج جذاب لعلاج الأمراض التنكسية العصبية.

Introduction

الموجات فوق الصوتية العلاجية هي تقنية ناشئة تهدف إلى علاج أمراض الدماغ بطريقة غير جراحية ، جزئيا عن طريق تسهيل وصول العوامل العلاجية إلى ^{الدماغ1}،^2،3. نظرا لأن جزءا صغيرا فقط من الأجسام المضادة العلاجية التي تستهدف أمراض الدماغ يتم تناولها والاحتفاظ بها في ^{الدماغ4} ، فإن الموجات فوق الصوتية العلاجية توفر إمكانية زيادة امتصاصها والمشاركة ^{المستهدفة5,6}.

في مختبرنا ، نقوم بتطوير مناهج علاجية للأمراض العصبية التنكسية حيث يتم تسليم جسم مضاد بأشكال مختلفة عبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB) باستخدام الفقاعات الدقيقة. لتحقيق ذلك ، يتم تطبيق الموجات فوق الصوتية من خلال الجمجمة إلى الدماغ في بقع متعددة باستخدام وضع المسح الضوئي الذي نشير إليه باسم المسح بالموجات فوق الصوتية (SUS) ⁷. التفاعل الميكانيكي بين طاقة الموجات فوق الصوتية ، والفقاعات الدقيقة المحقونة عن طريق الوريد والأوعية الدموية في الدماغ يفصل بشكل عابر التقاطعات الضيقة ل BBB في حجم صوتنة معين ، مما يسمح للأجسام المضادة والشحنات الأخرى بما في ذلك العوامل العلاجية بعبور هذا الحاجز بشكل ^{فعال7,8,9} . علاوة على ذلك ، ثبت أن الموجات فوق الصوتية تسهل امتصاص الأجسام المضادة من الدماغ الخلالي إلى خلايا الدماغ ، مثل الخلايا العصبية ، حيث ينتشر الجسم المضاد في جميع أنحاء جسم الخلية وحتى في العمليات العصبية5,10.

يتميز مرض الزهايمر بأمراض أميلويد β وتاو ¹¹، وتتوفر مجموعة من النماذج الحيوانية لتشريح الآليات المسببة للأمراض والتحقق من صحة الاستراتيجيات العلاجية. يمكن لنهج SUS ، الذي يتم من خلاله تطبيق الموجات فوق الصوتية في نمط متسلسل عبر الدماغ بأكمله ، عند تكراره على مدى عدة جلسات علاجية ، أن يقلل من أمراض لوحة الأميلويد في أدمغة الفئران الطافرة لبروتين السلائف الأميلويد المودعة β (APP) وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة التي تأخذ الأميلويد ، مما يؤدي إلى تحسن في الوظيفة المعرفية ⁷. فتح BBB مع الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة يقلل أيضا من أمراض تاو في pR5 و K3 و rTg4510 تاو الفئران المعدلة وراثيا5،^12،13. الأهم من ذلك ، في حين أن الخلايا الدبقية الصغيرة تزيل رواسب البروتين خارج الخلية ، فإن إحدى آليات التطهير الأساسية للأمراض داخل الخلايا العصبية التي يسببها SUS هي تنشيط الالتهام الذاتي ^{العصبي12}.

هنا ، نحدد عملية تجريبية ، يتم من خلالها إعداد الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية ، ثم يتم خلطها مع الفقاعات الدقيقة القائمة على الدهون في المنزل ، تليها الحقن بأثر رجعي في الفئران المخدرة. الحقن خلف الحجاج هو بديل لحقن الوريد الذيل الذي وجدنا أنه فعال بنفس القدر وأبسط في الأداء المتكرر. ويتبع ذلك مباشرة تطبيق SUS على الدماغ. لتحديد امتصاص الأجسام المضادة العلاجية ، يتم التضحية بالفئران ثم يتم تحديد تركيز الأجسام المضادة المتزايد في الدماغ. كوكيل للتغيير في توازن الدماغ ، يتم تحديد نشاط البلعمة الدبقية الدقيقة من خلال علم الأنسجة وإعادة البناء الحجمي 3D.

تشير البيانات التي تم إنشاؤها إلى أن توصيل الموجات فوق الصوتية للأجسام المضادة هو نهج جذاب محتمل لعلاج الأمراض التنكسية العصبية. ويمكن تطبيق البروتوكول بالمثل على الأدوية المرشحة الأخرى، فضلا عن الشحنات النموذجية مثل الدكسترونات ذات الأحجام المحددة بالفلورسنت14.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة كوينزلاند.

1. في المنزل إعداد microbubble

1. وزن نسبة مولية 9: 1 من 1،2-ديستيرويل-sn-glycero-3-phosphocholine و 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] (ملح الأمونيوم). مطلوب 0.5 ملغ من خليط الدهون لكل 1 مل من محلول microbubble. بدلا من ذلك ، يمكن شراء الدهون بالفعل في الكلوروفورم ، إذا انتقل استخدام الدهون الذائبة مسبقا إلى الخطوة 1.3.
2. يذوب الدهون في حجم صغير من الكلوروفورم في كوب زجاجي.
3. تبخر الكلوروفورم باستخدام مبخر أو تيار نيتروجين.
4. أعد ترطيب فيلم الدهون المجفف باستخدام 10 مل من PBS + 10٪ جلسرين + محلول بروبيلين جليكول 10٪ تم ترشيحه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
5. ضع محلول الدهون المعاد ترطيبه في سونيكتور حمام مائي مضبوط على 55 درجة مئوية (أعلى من درجة حرارة انصهار الدهون) وسونيكات حتى تذوب تماما.
6. Aliquot محلول الدهون في قوارير HPLC 1.5 مل معقمة والمسمار على قبعات الحاجز.
7. استنشق كل الهواء في القارورة باستخدام حقنة سعة 5 مل مجهزة بإبرة 27 جم وقم بإنشاء فراغ في القارورة.
8. أضف الأوكتوفلوروبروبان إلى القارورة باستخدام المحقنة المضمنة ، واسحب الغاز من العلبة. املأ القارورة ب 1-2 مل من ثماني فلورو بروبان عن طريق قراءة الحجم في المحقنة.
9. أغلق كل قارورة بفيلم بارافين وضعيها في الثلاجة.
10. في يوم التجربة ، أحضر القارورة إلى درجة حرارة الغرفة ، وأضف 0.5 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ إلى القارورة ، ثم ضع القارورة في ملغمة وحرك لمدة 45 ثانية (وقت محدد مسبقا) لإنتاج الفقاعات الدقيقة.

2. مراقبة جودة Microbubble باستخدام عداد coulter

1. أخرج محلول الفقاعة الدقيقة من الملغم وقم بتنفيس الغاز من القارورة عن طريق ثقب الحاجز بإبرة 19 جم.
2. قم بتخفيف محلول microbubble عن طريق إجراء تخفيفات تسلسلية من خطوتين 1: 5,000 عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول microbubble إلى 5 مل من محلول التدفق المصفى باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 19 G ، ثم أخذ 100 ميكرولتر من محلول microbubble المخفف 1:50 والسحب إلى محلول تدفق مصفى 10 مل في كوفيت باستخدام ماصة.
3. تحقق من أن خزان المنحل بالكهرباء يحتوي على محلول تدفق كاف وأن خزان النفايات فارغ.
4. ضع الكوفيت في منصة عداد كولتر وقم بتثبيته في مكانه. استخدم فتحة عدسة 30 ميكرومتر للحصول على العينة.
5. في البرنامج، قم بتحميل طريقة التشغيل القياسية (SOM)، ثم حدد تحرير SOM | تركيز. أدخل تخفيف 5000x.
6. في البرنامج ، اختر اسم ملف مناسب. على سبيل المثال ، microbubble_1_date.
7. قم بتحميل وتأمين cuvette في المنصة.
8. في البرنامج ، حدد تشغيل| معاينة والتحقق من أن تركيز العينة أقل من 10٪. إذا كان هذا الرقم أعلى من 10٪ ، فقم بإجراء تخفيف جديد للفقاعات الدقيقة مع عامل تخفيف أعلى.
9. حدد "ابدأ" لبدء الحصول على العينة للحصول على القراءة الأولية.
10. اشطف فتحة عدسة عداد كولتر بمحلول التدفق المصفى بعد كل قياس. كرر الخطوات 2.2-2.9 للحصول على 3 نسخ متماثلة.
11. ضع كوفيت بمحلول microbubble مخفف في حمام مائي سونيكتور وسونيكات لمدة 30 ثانية.
12. قم بقياس المحلول باستخدام الفقاعات الدقيقة الصوتية وقم بتصنيفه على أنه فارغ.
13. في البرنامج، اطرح القراءة النهائية من القراءة الأولية. هذا يطرح أي جزيئات ليست فقاعات صغيرة ولا تحتوي على غاز.
14. حدد عرض النتائج في البرنامج، لعرض تركيز الفقاعة الدقيقة وتوزيع الحجم ومتوسط الحجم وتركيز الحجم.

3. وضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية

1. احصل على محلول 1 ملغم / مل من الماوس IgG في PBS دون أي إضافات.
2. تسمية 1 ملغ من الماوس IgG مع AlexaFluor 647 في 0.1 M بيكربونات الصوديوم المخزن المؤقت باتباع تعليمات الشركات المصنعة الموجودة في المجموعة. هذه الكمية من IgG المسمى بالفلورسنت كافية لتنفيذ هذا الإجراء على 5-7 فئران بالغة حيث يتم إعطاء جرعة 5 ملغم / كغم من الأجسام المضادة.
3. أضف الصبغة إلى محلول IgG في مخزن مؤقت بيكربونات الصوديوم 0.1 M واحتضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. قم بتنقية الجسم المضاد الموسوم بالفلورسنت عن طريق سحب محلول الأجسام المضادة في عمود دوار والطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق. ستبقى الصبغة الحرة في سرير العمود.
5. استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز البروتين. قم بقياس امتصاص المحلول المقترن عند 280 نانومتر و 650 نانومتر (A280 و A650). احسب تركيز البروتين في العينة باستخدام المعادلة:
   تركيز البروتين (M) = [A280 - (A650 × 0.03)] × عامل التخفيف / 203000.
6. استخدم مقياس الطيف الضوئي لحساب درجة وضع العلامات باستخدام المعادلة:
   صبغة الشامات لكل بروتين مول = A650 × عامل التخفيف / 239000 × تركيز البروتين (M).
   ملاحظة: درجة مقبولة من وضع العلامات هي 3-7 شامات صبغة لكل بروتين مول وعادة ما تكون درجة وضع العلامات التي يتم الحصول عليها حوالي 6.

4. إعداد الموجات فوق الصوتية

1. باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية المركزة، أضف الفاصل 5 مم إلى بلعة الماء لوضع تركيز الموجات فوق الصوتية على بعد 9 مم أسفل الجزء السفلي من بلعة الماء.
2. املأ البلعة المائية بحوالي 300 مل من الماء منزوع الأيونات الذي تم نزع غازه باستخدام مزيل مضمن لمدة 20 دقيقة (يجب أن يكون محتوى الأكسجين أقل من 3 أجزاء في المليون). ضع الصفيف الحلقي في بلعة الماء المملوءة واستخدم مرآة الأسنان للتحقق من عدم وجود فقاعات هواء على السطح. إذا كانت موجودة على السطح ، فقم بإزالة الصفيف الحلقي واستبدله في بلعة الماء.
3. قم بتشغيل البرنامج التطبيقي. في قائمة الشكل الموجي، حدد تعيين دورة عمل الشكل الموجي. الإعدادات هي PRF (هرتز) 10 ، دورة العمل 10 ٪ ، التركيز 80 مم ، تردد المركز 1 ميجاهرتز ، السعة (ذروة الضغط السلبي في MPa) 0.65 ميجا باسكال ، المؤشر الميكانيكي = 0.65. اضغط على Set (تعيين ) لتحديد الشكل الموجي وتخزينه في الذاكرة.
   ملاحظة: تتم معايرة نظام الموجات فوق الصوتية المركز مسبقا من قبل الشركة المصنعة من القياسات التي يتم إجراؤها بواسطة هيدروفون معايرة.
4. في برنامج نظام الموجات فوق الصوتية المركزة ، حدد خطة علاجية. وهذا يتطلب تحديد منطقة علاج تتكون من مواقع علاج فردية متعددة، وتحديد الإجراءات الواجب اتخاذها في كل موقع من مواقع العلاج هذه. في هذه الحالة ، تكون منطقة العلاج عبارة عن نصف كرة واحد من دماغ الفأر.
5. في نافذة وحدة التحكم في الحركة، انتقل إلى علامة التبويب المسح الضوئي وأدخل قيمة البدء والإيقاف والزيادة للحركة في البعد x، وقيمة البدء والتوقف والزيادة للحركة في الاتجاه y. أدخل قيم X: ابدأ -4، أوقف 3.50 و Y: -3.00، إيقاف 3، زيادة 1.5، # حلقات: 1.
6. تحديد الإجراءات الخاصة بمواقع العلاج. في نافذة وحدة التحكم في الحركة، حدد زر الحدث . في نافذة تحرير البرنامج النصي، حدد قائمة بالإجراءات التي سيتم تنفيذها بالترتيب المحدد في كل موقع معالجة. اضبط نوع الحركة على شبكة البيانات النقطية أعلى نافذة البرنامج النصي. في علامة التبويب الأحداث، حدد إضافة إجراءات لنقلها إلى لوحة البرنامج النصي، وأضف نقل متزامن، وابدأ تشغيل arb، وانتظر، وإيقاف تشغيل arb. انقر فوق إجراء الانتظار وحدد وقت انتظار 6000 مللي ثانية.
   ملاحظة: ستجعل هذه الإعدادات المعالجة عبارة عن شبكة 6 × 5 من بقع المعالجة متباعدة بمقدار 1.5 مم ، مع كل بقعة لها مدة علاج تبلغ 6 ثوان. المدة الإجمالية لسونيك دماغ الفأر حوالي 3 دقائق. شبكة المعالجة ذات الحجم هذه مناسبة للفئران البالغة C57 / Bl6 التي تزن حوالي 30 جم. يمكن تعديل حجم شبكة بقع المعالجة لأعلى أو لأسفل اعتمادا على حجم الماوس.

5. إعداد الحيوانات

1. وزن الماوس بميزان دقيق يصل إلى 0.1 جم.
2. تخدير الفأر مع 90 ملغم / كغ من الكيتامين و 6 ملغ / كغ من الزيلازين داخل الصفاق. اختبار عدم وجود ردود الفعل مع قرصة إصبع القدم. بدلا من ذلك ، يمكن تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران باستخدام جهاز تخدير استنشاقي مناسب مع قناع وجه مناسب. في حالة استخدام الأيزوفلوران ، يجب وضع الماوس على وسادة حرارية أثناء الموجات فوق الصوتية لمنع انخفاض حرارة الجسم.
3. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الشعر من رأس الحيوان ، ثم ضع كريم إزالة الشعر مع برعم قطني ، واتركه لمدة 2-3 دقائق أو حتى يتم مسح الشعر نظيفا بقطعة رطبة من الشاش. احرص على ألا يدخل كريم إزالة الشعر في عيون الماوس.
4. ضع علامة على مركز رأس الماوس بعلامة دائمة. يحتوي محول الطاقة على ثقب في مركزه ويمكن محاذاة تركيز المحول والبقعة البؤرية بصريا.
5. املأ قارب وزن صغير سبق أن تم قطع القاع واستبداله بغلاف بلاستيكي ملتصق بقاع قارب الوزن باستخدام هلام الموجات فوق الصوتية. هذا بمثابة فاصل 8 مم ويوفر اقتران جيد برأس الماوس ويسمح بالفحص البصري لتركيز محول الطاقة المحاذي لرأس الماوس.

6. إعداد الفقاعات الدقيقة

1. قم بتسخين قارورة microbubble إلى درجة حرارة الغرفة. للتنشيط ، أضف 0.5 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ إلى القارورة وضعها في ملغم للتحريك لمدة 45 ثانية لإنتاج الفقاعات الدقيقة.
2. تنفيس القارورة عن طريق ثقب الحاجز بإبرة 27 جم.

7. العلاج بالموجات فوق الصوتية

1. عكس قارورة الفقاعات الدقيقة ورسم بلطف 1 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من المحلول. لهذا إضافة محلول من الأجسام المضادة المسمى بالفلورسنت وتخلط بلطف في المحقنة. الحد الأقصى لحجم الحقن هو 150 ميكرولتر.
   ملاحظة: الفقاعات الدقيقة المحضرة داخليا أقل تركيزا بحوالي 60 ضعفا من الفقاعات الدقيقة المستخدمة سريريا (على سبيل المثال، الفقاعات الدقيقة المحددة). اضبط الحجم أو التركيز بحيث يكون عدد الفقاعات الدقيقة التي يتم حقنها مشابها لتلك المستخدمة سريريا (أي. تحديد 1.2 × ¹⁰⁸ ميكروفقاعات / كجم من وزن الجسم).
2. حقن الفقاعة الدقيقة ومحلول الأجسام المضادة بأثر رجعي ، مع الحرص على الحقن بلطف وببطء. ثم ، ضع مرهم العيون على عيون الماوس.
3. ضع الماوس في حامل الرأس (انظر جدول المواد) وقم بإصلاح أنف الماوس. ثم ضع قارب الوزن الصغير المملوء بالموجات فوق الصوتية المملوء بالهلام فوق الرأس.
4. اخفض بلعة الماء حتى تجلس فوق هلام الموجات فوق الصوتية في قارب الوزن.
5. استخدم عصا التحكم لنقل تركيز محول الطاقة إلى وسط الرأس. حدد إعادة تعيين الأصل في علامة التبويب الحركة.
6. حدد الفحص الكامل. ستستغرق الخطوات من 7.3 إلى 7.6 دقيقتين.
7. من أجل الاتساق ، قم بتعيين مؤقت لضمان تأخير 2 دقيقة بين حقن microbubbles وتحديد الفحص الكامل.
8. بعد اكتمال العلاج ، ضع مرهم العيون على العينين وضع الماوس في غرفة الشفاء الدافئة. إذا لوحظ انخفاض حرارة الجسم أثناء الإجراء ، يمكن وضع وسادة الاحترار تحت الماوس لتوفير حرارة تكميلية أثناء الإجراء.

8. حصاد الأنسجة ومعالجتها

1. في الوقت المناسب من الاهتمام بعد التسليم بالموجات فوق الصوتية (على الأقل 1 ساعة للكشف عن مستويات عالية من الأجسام المضادة في الدماغ) تخدير عميق للفأر مع جرعة زائدة من محلول بنتوباربيتون (100 ملغ / كغ) وأداء الماوس عبر القلب مع 30 مل PBS. مطلوب تروية جيدة للكشف على وجه التحديد عن الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت التي تم تسليمها إلى الدماغ.
2. جمع الدماغ وإصلاحه عن طريق الغمر في PFA 4٪ لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية ، ثم اغسله باستخدام PBS.
3. قم بتصوير الدماغ في ماسح ضوئي بالأشعة تحت الحمراء عن طريق وضع الدماغ على الدرج والحصول على صورة في قناة 700 نانومتر.
   ملاحظة: بعد التثبيت ، تتم إزالة الدماغ من PFA ، وغسله في PBS وتقسيمه. بدلا من ذلك ، يمكن وضعه في محلول مبرد الإيثيلين جلايكول لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية أو حتى يغمرها المياه ، ثم يتم نقله إلى مادة تبريد جديدة تحتوي على قارورة ووضعها عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
4. قسم الدماغ البارد في PBS باستخدام اهتزاز. قم بلصق الدماغ على المنصة وقطع أقسام 30-40 ميكرومتر وجمعها في PBS.
   ملاحظة: يجب تبييض التألق الذاتي الليزوزومي (المنتشر في أقسام من الحيوانات التي يزيد عمرها عن 12 شهرا تقريبا) عن طريق الإضاءة الليلية للأقسام في صندوق غرفة الضوء ، في درجة حرارة الغرفة وفي PBS التي تحتوي على أزيد (0.02٪) لمنع نمو البكتيريا.

9. تلطيخ الأنسجة والحصول على الصور

1. انقل الأقسام إلى محلول الحجب (5٪ BSA في 0.2٪ Triton / PBS) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل الأقسام 3x عن طريق استبدال المحلول ب 0.2٪ Triton / PBS.
2. احتضان الأقسام عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية ضد Iba1 (التخفيف 1: 1000) و CD68 (التخفيف 1: 500) ، في 0.2 ٪ Triton / PBS ، تليها 3x يغسل مع 0.2 ٪ Triton / PBS.
3. احتضان الأقسام لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية (التخفيف 1:500) ، تليها غسلات 3x مع 0.2٪ Triton / PBS فقط.
   ملاحظة: يمكن أيضا تلطيخ النوى باستخدام محلول DAPI (0.5 ميكروغرام / مل).
4. انقل الأقسام إلى شريحة وغطاء مع وسائط تركيب ثابتة. امنح وقتا كافيا لتصلب وسيط التركيب قبل التصور والحصول على الصورة (بين عشية وضحاها).
5. باستخدام المجهر متحد البؤرة ، احصل على صور z-stack (عمق 10 ميكرومتر على الأقل وحجم خطوة 0.3 ميكرومتر ، 10 صور لكل حيوان) لمنطقة الدماغ المستهدفة بالموجات فوق الصوتية باستخدام مجهر متحد البؤرة وهدف تكبير 40x على الأقل.
   ملاحظة: احرص على الحصول على صور ضمن النطاق الديناميكي للإشارة، وتجنب التعرض الناقص/الزائد. احفظ ملفات الصور بتنسيق البرنامج المقابل الذي يستخدمه المجهر.

10. تحليل الصور

1. قم بتحويل ملفات المجهر z-stack باستخدام مستورد ملف برنامج تحليل الصور.
2. افتح الملفات المحولة إلى البرنامج واضبط كثافة قناة Iba1 لمراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة.
3. اقتصاص خلية دبقية صغيرة واحدة عن طريق رسم مربع حولها ، وحدد "اقتصاص" واحفظ الملف الجديد.
4. بناء العرض السطحي ثلاثي الأبعاد لإشارة IBA1 من خلال:
   1. افتح ملف Imaris أحادي الخلية الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة.
   2. إضافة سطح إلى الملف.
   3. حدد القناة المقابلة لتلطيخ Iba1.
   4. تطبيق عتبة يجب أن تتداخل مع تلطيخ Iba1
   5. حدد فقط بنية الاهتمام التي تشكل الخلية الدبقية الصغيرة ذات الأهمية
5. وضع اللمسات الأخيرة على العملية
   1. الحصول على حجم تلطيخ Iba1 وتسجيله
   2. بناء تقديم سطح 3D من تلطيخ CD68
   3. داخل الملف الفرعي لسطح IBA1 ، قم بإخفاء قناة CD68 وإزالة voxels خارج تلطيخ IBA1
   4. إضافة سطح جديد إلى الملف
   5. حدد القناة المقابلة لتلطيخ CD68
   6. تطبيق عتبة يجب أن تتداخل مع تلطيخ CD68 وتكون مطابقة قدر الإمكان لأحجام التلطيخ
   7. قم بوضع اللمسات الأخيرة على العملية ، حيث لن تكون موجودة في هذا الملف سوى هياكل CD68 داخل الدبقية الدقيقة ، وبالتالي ، فإنها لا تتطلب خطوة تصفية عتبة أخرى
   8. الحصول على وتسجيل عدد ومتوسط حجم الهياكل الإيجابية CD68
   9. احسب الحجم النسبي لهياكل CD68 وفقا لهياكل IBA1 المقابلة لها كمقياس للتنشيط الدبقي الصغير في حالة البلعمة.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تسليم الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية إلى الدماغ ويمكن اكتشافها ، إلى جانب تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. الاستنتاج الذي يمكن استخلاصه هو استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة والفقاعات الدقيقة يعزز بشكل ملحوظ امتصاص الدماغ للأجسام المضادة ويمكن أن يو...

Discussion

يمكن توصيل الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت إلى الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة جنبا إلى جنب مع الفقاعات الدقيقة المطبقة في وضع المسح. يمكن الكشف عن توصيل الأجسام المضادة ومورفولوجيا الخلايا الدبقية الدقيقة وتضخم الليزوسومات عن طريق الفحص المجهري الفلوري بعد المسح بالم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti	850365C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647 antibody labeling kit	Thermo Fisher	A20186
CD68 antibody	AbD Serotec	MCA1957GA	Use 1:1000 dilution
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Coulter Counter (Multisizer 4e)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo FIsher	A-11008	Use 1:500 dilution
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11077	Use 1:500 dilution
head holder (model SG-4N, Narishige Japan)
Iba1 antibody	Wako	019-19741	Use 1:1000 dilution
Image analysis software	Beckman Coulter	#8547008
Isoflow flow solution	Beckman Coulter	B43905
Near infrared imaging system Odyssey Fc	Licor	2800-03
Octafluoropropane	Arcadophta	0229NC
Propylene Glycol	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS (Therapy Imaging Probe System)	Philips Research	TIPS_007
	Bitplane