Доставка антител в мозг с помощью сфокусированного сканирующего ультразвука

Резюме

Здесь представлен протокол для временного открытия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) либо фокально, либо по всему мозгу мыши для доставки флуоресцентно меченых антител и активации микроглии. Также представлен метод обнаружения доставки антител и активации микроглии с помощью гистологии.

Аннотация

Только небольшая часть терапевтических антител, нацеленных на заболевания головного мозга, поглощается мозгом. Сфокусированный ультразвук дает возможность увеличить поглощение антител и взаимодействие через преходящее открытие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). В нашей лаборатории мы разрабатываем терапевтические подходы для нейродегенеративных заболеваний, при которых антитело в различных форматах доставляется через ГЭБ с использованием микропузырьков, сопутствующих целенаправленному ультразвуковому применению через череп, нацеленный на несколько пятен, подход, который мы называем сканирующим ультразвуком (SUS). Механическое воздействие микропузырьков и ультразвука на кровеносные сосуды увеличивает параклеточный транспорт через ГЭБ путем временного разделения плотных соединений и усиливает везикоопосредованный трансцитоз, позволяя антителам и терапевтическим агентам эффективно пересекаться. Кроме того, ультразвук также облегчает поглощение антител из интерстициального мозга в клетки мозга, такие как нейроны, где антитело распределяется по всему телу клетки и даже в невритические процессы. В наших исследованиях флуоресцентно меченые антитела готовят, смешивают с подготовленными внутри компании микропузырьками на основе липидов и вводят мышам непосредственно перед нанесением SUS на мозг. Затем увеличивается концентрация антител в мозге. Чтобы учесть изменения в нормальном гомеостазе мозга, микроглиальный фагоцитоз может быть использован в качестве клеточного маркера. Полученные данные свидетельствуют о том, что ультразвуковая доставка антител является привлекательным подходом к лечению нейродегенеративных заболеваний.

Введение

Терапевтический ультразвук - это новая технология, направленная на лечение заболеваний головного мозга неинвазивным способом, в частности путем облегчения доступа терапевтических агентов к мозгу1,2,3. Поскольку только небольшая часть терапевтических антител, нацеленных на заболевания головного мозга, поглощается и удерживается в ^мозге4, терапевтический ультразвук дает возможность увеличить их поглощение и целевое ^{вовлечение5,6}.

В нашей лаборатории мы разрабатываем терапевтические подходы к нейродегенеративным заболеваниям, при которых антитело в различных форматах доставляется через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) с помощью микропузырьков. Чтобы достичь этого, ультразвук применяется через череп в мозг в нескольких местах с использованием режима сканирования, который мы называем сканирующим ультразвуком (SUS)⁷. Механическое взаимодействие между ультразвуковой энергией, внутривенно вводимыми микропузырьками и сосудистой системой мозга временно разделяет плотные соединения ГЭБ в заданном объеме ультразвука, позволяя антителам и другим грузам, включая терапевтические агенты, эффективно преодолевать этот ^{барьер7,8,9} . Кроме того, было показано, что ультразвук облегчает поглощение антител из интерстициального мозга в клетки мозга, такие как нейроны, где антитело распространяется по всему телу клетки и даже в невритические ^{процессы5,10}.

Болезнь Альцгеймера характеризуется амилоидно-β и тау-патологией11, и доступно множество животных моделей для вскрытия патогенных механизмов и проверки терапевтических стратегий. Подход SUS, при котором ультразвук применяется последовательно по всему мозгу при повторении в течение нескольких сеансов лечения, может уменьшить патологию амилоидных бляшек в мозге амилоидно-β мутантных мышей-предшественников амилоида (APP) и активировать микроглию, которая поглощает амилоид, что приводит к улучшению когнитивной ^{функции7}. Открытие ГЭБ с ультразвуком и микропузырьками также уменьшает патологию тау у pR5, K3 и rTg4510 тау трансгенных мышей5,12,13. Важно отметить, что в то время как микроглия удаляет внеклеточные белковые отложения, одним из основных механизмов клиренса для внутринейрональных патологий, индуцированных SUS, является активация нейрональной аутофагии12.

Здесь мы описываем экспериментальный процесс, с помощью которого получают флуоресцентно меченые антитела, а затем смешивают с собственными микропузырьками на основе липидов с последующей ретроорбитальной инъекцией анестезированным мышам. Ретроорбитальная инъекция является альтернативой инъекции в хвостовую вену, которая, как мы обнаружили, одинаково эффективна и проста в многократном выполнении. За этим сразу же следует применение SUS к мозгу. Чтобы определить поглощение терапевтических антител, мышей приносят в жертву, а затем количественно оценивают повышенную концентрацию антител в мозге. Как прокси изменения гомеостаза мозга, фагоцитарная активность микроглии определяется гистологией и объемной 3D-реконструкцией.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ультразвуковая доставка антител является потенциально привлекательным подходом к лечению нейродегенеративных заболеваний. Протокол может быть аналогичным образом применен к другим кандидатам в лекарства, а также к модельным грузам, таким как флуоресцентно меченый декстранс определенных ^{размеров14}.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике животных Университета Квинсленда.

1. Собственная подготовка микропузырьков

1. Взвешивают молярное соотношение 9:1 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония). Требуется 0,5 мг липидной смеси на 1 мл микропузырькового раствора. Альтернативно, липиды можно купить уже в хлороформе, если с помощью предварительно растворенных липидов перейти к этапу 1.3.
2. Растворите липид в небольшом объеме хлороформа в стеклянном стакане.
3. Испаряйте хлороформ с помощью испарителя или потока азота.
4. Регидратировать высушенную липидную пленку 10 мл PBS + 10% глицерина + 10% раствора пропиленгликоля, который был отфильтрован через фильтр 0,22 мкм.
5. Поместите регидратированный липидный раствор в ультразвуковой аппарат для водяной бани, установленный на 55 °C (выше температуры плавления липидов), и обжайте ультразвуком до полного растворения.
6. Липидный раствор Аликвот в автоклавные флаконы ВЭЖХ 1,5 мл и прикрутить к колпачкам перегородок.
7. Аспирируйте весь воздух во флаконе шприцем объемом 5 мл, оснащенным иглой 27 Г, и создайте вакуум во флаконе.
8. Добавьте октофторпропан во флакон с прилагаемым шприцем, вытягивая газ из канистры. Наполните флакон 1-2 мл октафторпропана, считывая объем в шприце.
9. Запечатайте каждый флакон парафиновой пленкой и поставьте в холодильник.
10. В день эксперимента доведите флакон до комнатной температуры, добавьте во флакон 0,5 мл 0,9% раствора NaCl, затем поместите флакон в амальгаматор и перемешайте в течение 45 с (заданное время) для получения микропузырьков.

2. Контроль качества микропузырьков с помощью счетчика сошников

1. Выньте микропузырьк из амальгаматора и выделите газ из флакона, проткнув перегородки иглой 19 Г.
2. Разбавляют микропузырьковым раствором, выполняя двухэтапные последовательные разведения 1:5000, добавляя 100 мкл микропузырькового раствора в 5 мл фильтрованного проточного раствора с использованием шприца 1 мл с иглой 19 г, а затем принимая 100 мкл разбавленного микропузырькового раствора и пипеткой в 10 мл фильтрованного проточного раствора в кювете с использованием пипетки.
3. Убедитесь, что резервуар для электролитов имеет достаточный поток раствора и что резервуар для отходов пуст.
4. Поместите кювету в контрплатформу сошника и зафиксируйте ее на месте. Используйте диафрагму 30 мкм для сбора образцов.
5. В программном обеспечении загрузите стандартный метод работы (SOM), затем выберите Изменить SOM | концентрации. Вводят 5000x разбавление.
6. В программе выберите подходящее имя файла. Например, microbubble_1_date.
7. Загрузите и закрепите кювету на платформе.
8. В программе выберите Выполнить| Предварительный просмотр и проверка концентрации образца составляет менее 10%. Если это число выше 10%, производят новое разбавление микропузырьков с более высоким коэффициентом разбавления.
9. Выберите «Начать», чтобы начать сбор образца для получения первоначального считывания.
10. Промывайте отверстие счетчика Coulter фильтрованным проточным раствором после каждого измерения. Повторите шаги 2.2-2.9, чтобы получить 3 реплики.
11. Поместите кювету с разбавленным микропузырьком в водяную баню соникатора и храните ультразвуком в течение 30 с.
12. Измерьте раствор ультразвуковыми микропузырьками и пометьте как пустой.
13. В программном обеспечении вычтите окончательное считывание из начального считывания. При этом вычитаются любые частицы, которые не являются микропузырьками и не содержат газа.
14. Выберите Отображать результаты в программном обеспечении, чтобы отобразить концентрацию микропузырьков, распределение по размерам, средний размер и объемную концентрацию.

3. Маркировка флуоресцентных антител

1. Получают 1 мг/мл раствора мышиного IgG в PBS без каких-либо добавок.
2. Нанесите на этикетку 1 мг мышиного IgG с AlexaFluor 647 в буфере бикарбоната натрия 0,1 М, следуя инструкциям производителей, расположенным в комплекте. Этого количества флуоресцентно меченого IgG достаточно для выполнения этой процедуры на 5-7 взрослых мышах, где вводится доза антитела 5 мг / кг.
3. Добавляют краситель в раствор IgG в буфере бикарбоната натрия 0,1 М и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
4. Очищают флуоресцентно меченое антитело путем пипетирования раствора антитела в спиновую колонну и центрифугирования при 1000 х г в течение 5 мин. Свободный краситель останется в колонной кровати.
5. Используйте спектрофотометр для измерения концентрации белка. Измерьте поглощение сопряженного раствора при 280 нм и 650 нм (A280 и A650). Рассчитайте концентрацию белка в образце с помощью уравнения:
   Концентрация белка (М) = [A280 - (A650 x 0,03)] x коэффициент разбавления / 203 000.
6. Используйте спектрофотометр для расчета степени маркировки с помощью уравнения:
   моль краситель на моль белка = A650 x коэффициент разбавления / 239 000 x концентрация белка (M).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимая степень маркировки составляет 3-7 молей красителя на моль белка и обычно получаемая степень маркировки составляет около 6.

4. Настройка ультразвука

1. Используя сфокусированную ультразвуковую систему, добавьте 5-миллиметровую прокладку к водяному болюсу, чтобы расположить ультразвуковой фокус на 9 мм ниже дна водяного болюса.
2. Наполните водный болюс примерно 300 мл деионизированной воды, которая была дегазирована встроенным дегазатором в течение 20 минут (содержание кислорода должно быть ниже 3 ppm). Поместите кольцевой массив в заполненный водяной болюс и используйте стоматологическое зеркало, чтобы проверить, что на поверхности нет пузырьков воздуха. Если она присутствует на поверхности, снимите кольцевой массив и замените его в водяном болюсе.
3. Запустите прикладное программное обеспечение. В меню формы сигнала выберите Задать рабочий цикл формы сигнала. Настройки PRF (Гц) 10, рабочий цикл 10%, фокус 80 мм, центральная частота 1 МГц, амплитуда (пиковое отрицательное давление МПа) 0,65 МПа, механический индекс = 0,65. Нажмите Set (Установить ), чтобы определить форму сигнала и сохранить ее в памяти.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сфокусированная ультразвуковая система предварительно калибруется производителем на основе измерений, сделанных калиброванным гидрофоном.
4. В программном обеспечении сфокусированной ультразвуковой системы определите план лечения. Это требует определения области лечения, состоящей из нескольких отдельных мест лечения, и определения действий, которые должны быть предприняты в каждом из этих мест лечения. При этом зоной лечения является одно полушарие мозга мыши.
5. В окне контроллера движения перейдите на вкладку Сканирование и введите значение запуска, остановки и приращения для движения в измерении x, а также значение запуска, остановки и приращения для движения в направлении y. Введите значения для X: start -4, stop 3.50 и Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
6. Определите действия для сайтов лечения. В окне контроллера движения нажмите кнопку Событие . В окне Редактирования скриптов выберите список действий, которые будут выполняться в порядке, выбранном на каждом сайте обработки. Задайте для параметра Тип движения растровую сетку в верхней части окна скрипта. На вкладке событий выберите Добавить действия , чтобы переместить их на панель сценариев, и добавьте Переместить синхронно, Запустить триггер arb, подождать, Остановить триггер arb. Нажмите на действие ожидания и выберите время ожидания 6 000 мс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки сделают обработку сеткой 6 x 5 лечебных пятен, расположенных на расстоянии 1,5 мм друг от друга, причем каждое пятно будет иметь продолжительность обработки 6 с. Общая продолжительность обработки ультразвуком мозга мыши составляет примерно 3 минуты. Сетка для обработки такого размера подходит для взрослых мышей C57/Bl6 весом около 30 г. Размер сетки обрабатываемых пятен можно регулировать вверх или вниз в зависимости от размера мыши.

5. Подготовка животных

1. Взвешивайте мышь с весами с точностью до 0,1 г.
2. Обезболивают мышь 90 мг/кг кетамина и 6 мг/кг ксилазина внутрибрюшинно. Тест на отсутствие рефлексов с защемлением пальца ноги. Альтернативно, мыши могут быть обезболены изофлураном с использованием соответствующего ингаляционного анестетика с соответствующей маской для лица. При использовании изофлурана мышь следует поместить на грелку во время ультразвука, чтобы предотвратить переохлаждение.
3. С помощью электрической бритвы сбрить волосы с головы животного, затем нанесите крем для удаления волос ватной палочкой, оставьте на 2-3 минуты или до тех пор, пока волосы не будут вытерты влажным куском марли. Следите за тем, чтобы крем для удаления волос не попал в глаза мыши.
4. Пометьте центр головы мыши постоянным маркером. Преобразователь имеет отверстие в центре, и фокус и фокусное пятно преобразователя могут быть выровнены визуально.
5. Наполните небольшую весовую лодку, у которой ранее было отрезано дно и заменено полиэтиленовой пленкой, приклеенной к дну весовой лодки ультразвуковым гелем. Это служит в качестве 8-миллиметровой прокладки и обеспечивает хорошую связь с головкой мыши и позволяет визуально просматривать фокус датчика, выровненный с головкой мыши.

6. Подготовка микропузырьков

1. Нагрейте микропузырьк до комнатной температуры. Для активации добавьте 0,5 мл 0,9% раствора NaCl во флакон и поместите в амальгаматор для перемешивания в течение 45 с для получения микропузырьков.
2. Проветрите флакон, проколов перегородки иглой 27 г.

7. Ультразвуковое лечение

1. Инвертируйте во флаконе микропузырьков и осторожно вытяните 1 мкл/г массы тела раствора. К этому добавляют раствор флуоресцентно меченых антител и аккуратно перемешивают в шприце. Максимальный впрыскиваемый объем составляет 150 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутриготовые микропузырьки примерно в 60 раз менее концентрированы, чем клинически используемые (например, микропузырьки Definity). Отрегулируйте объем или концентрацию таким образом, чтобы количество вводимых микропузырьков было аналогично клинически используемым (т.е. Определенность 1,2 х ¹⁰⁸ микропузырьков/кг массы тела).
2. Вводите раствор микропузырьков и антител ретроорбитально, осторожно вводя осторожно и медленно. Затем нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши.
3. Поместите мышь в держатель головы (см. Таблицу материалов) и зафиксируйте нос мыши. Затем поместите ультразвуковую гелевую заполненную небольшую весовую лодочку на верхнюю часть головы.
4. Опустите водяной болюс до тех пор, пока он не сядет поверх ультразвукового геля в весовой лодке.
5. С помощью джойстика переместите фокус датчика в центр головки. Выберите «Сбросить источник» на вкладке «Движение».
6. Выберите полное сканирование. Шаги 7.3-7.6 займут 2 минуты.
7. Для согласованности установите таймер, чтобы обеспечить 2-минутную задержку между впрыском микропузырьков и выбором полного сканирования.
8. После завершения лечения нанесите офтальмологическую мазь на глаза и поместите мышь в подогретую восстановительную камеру. Если во время процедуры наблюдается гипотермия, под мышь можно поместить согревающую прокладку, чтобы обеспечить дополнительное тепло во время процедуры.

8. Сбор и переработка тканей

1. В точке интереса после проведения ультразвука (не менее 1 ч для выявления высоких уровней антител в головном мозге) глубоко обезболивают мышь при передозировке раствора пентобарбитона (100 мг/кг) и транскардиально перфецируют мышь 30 мл PBS. Хорошая перфузия необходима для конкретного обнаружения флуоресцентно меченых антител, которые были доставлены в мозг.
2. Соберите мозг и зафиксируйте погружением в 4% PFA в течение 24 ч при 4 °C, затем промыть PBS.
3. Представьте мозг в инфракрасном сканере, поместив мозг на лоток и получив изображение в канале 700 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации мозг удаляется из PFA, промывается в PBS и разделяется. Альтернативно, его можно поместить в раствор криопротектора этиленгликоля в течение 24 ч при 4°С или до погружения, а затем переместить в новый криопротектор, содержащий флакон, и поместить при -20°С для длительного хранения.
4. Секция мозга холодная в PBS с помощью вибратома. Приклейте мозг к платформе и вырежьте 30-40 мкм секций и соберите в PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лизосомальная аутофлуоресценция (распространенная в секциях животных старше 12 месяцев) должна быть отбелена ночным освещением секций в световом камерном боксе, при комнатной температуре и в PBS, содержащей азид (0,02%), чтобы блокировать рост бактерий.

9. Окрашивание тканей и получение изображения

1. Переложить срезы на блокирующий раствор (5% BSA в 0,2% Тритон/ПБС) в течение 2 ч при комнатной температуре, затем промыть секции 3х, заменив раствор 0,2% Тритон/ПБС.
2. Инкубировать участки при 4 °C в течение ночи с первичными антителами против Iba1 (разведение 1:1000) и CD68 (разведение 1:500), в 0,2% Triton/PBS, с последующим 3-кратным промыванием с 0,2% Triton/PBS.
3. Инкубировать секции в течение 2 ч при комнатной температуре с флуоресцентными вторичными антителами (разведение 1:500), а затем 3-кратные промывки только с 0,2% Тритона/PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ядра также могут быть окрашены с использованием раствора DAPI (0,5 мкг/мл).
4. Перенесите секции на слайд и крышку с жестко установленным монтажным носителем. Дайте достаточно времени для затвердевания монтажной среды перед визуализацией и получением изображения (в течение ночи).
5. С помощью конфокального микроскопа получают изображения z-стека (глубина не менее 10 мкм и размер шага 0,3 мкм, 10 изображений на животное) ультразвуковой целевой области мозга с помощью конфокального микроскопа и объектива с по меньшей мере 40-кратным увеличением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при получении изображений в динамическом диапазоне сигнала, избегая недостаточной/ чрезмерной экспозиции. Сохраните файлы изображений в соответствующем программном формате, используемом микроскопом.

10. Анализ изображений

1. Преобразуйте файлы микроскопии z-stack с помощью программного средства импорта файлов анализа изображений.
2. Откройте преобразованные файлы в программное обеспечение и отрегулируйте интенсивность канала Iba1 для наблюдения за клетками микроглии.
3. Обрежьте одну микроглиальную ячейку, нарисовав вокруг нее поле, выберите «обрезать» и сохраните новый файл.
4. Постройте 3D-рендеринг поверхности сигнала IBA1 следующим образом:
   1. Откройте одноячечный файл Imaris, созданный на предыдущем шаге.
   2. Добавьте в файл поверхность.
   3. Выберите канал, соответствующий окрашиванию Iba1.
   4. Применение порогового значения, которое должно перекрывать окрашивание Iba1
   5. Выбирайте только интересующую структуру, которая формирует интересующую микроглиальную клетку
5. Завершение процесса
   1. Получение и запись объема окрашивания Iba1
   2. Создание 3D-рендеринга поверхности окрашивания CD68
   3. Внутри подфайла поверхности IBA1 замаскируйте канал CD68 и удалите вокселы снаружи окрашивания IBA1
   4. Добавление новой поверхности в файл
   5. Выберите канал, соответствующий окрашиванию CD68
   6. Нанесите пороговое значение, которое должно перекрывать окрашивание CD68 и максимально точно соответствовать объемам окрашивания
   7. Завершите процесс, так как в этом файле будут присутствовать только внутримикроглиальные структуры CD68 и, таким образом, они не требуют другого порогового этапа фильтрации
   8. Получение и запись количества и среднего объема положительных структур CD68
   9. Рассчитайте относительный объем структур CD68 по соответствующим структурам IBA1 в качестве меры активации микроглии в фагоцитарном состоянии.

Результаты

Используя этот протокол, флуоресцентно меченые антитела доставляются в мозг и могут быть обнаружены вместе с активацией микроглии. Вывод, который можно сделать, заключается в том, что использование сфокусированного ультразвука и микропузырьков заметно усиливает поглощение мозгом ан?...

Обсуждение

Флуоресцентно меченые антитела могут быть доставлены в мозг с помощью сфокусированного ультразвука вместе с микропузырьками, нанесенными в режиме сканирования. Доставка антител, морфология микроглии и лизосомное увеличение могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti	850365C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647 antibody labeling kit	Thermo Fisher	A20186
CD68 antibody	AbD Serotec	MCA1957GA	Use 1:1000 dilution
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Coulter Counter (Multisizer 4e)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo FIsher	A-11008	Use 1:500 dilution
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11077	Use 1:500 dilution
head holder (model SG-4N, Narishige Japan)
Iba1 antibody	Wako	019-19741	Use 1:1000 dilution
Image analysis software	Beckman Coulter	#8547008
Isoflow flow solution	Beckman Coulter	B43905
Near infrared imaging system Odyssey Fc	Licor	2800-03
Octafluoropropane	Arcadophta	0229NC
Propylene Glycol	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS (Therapy Imaging Probe System)	Philips Research	TIPS_007
	Bitplane