Livraison d’anticorps dans le cerveau à l’aide d’ultrasons à balayage focalisé

Résumé

Présenté ici est un protocole pour ouvrir transitoirement la barrière hémato-encéphalique (BHE) soit de manière focale, soit dans tout le cerveau d’une souris pour délivrer des anticorps marqués par fluorescence et activer la microglie. Une méthode permettant de détecter l’administration d’anticorps et l’activation de la microglie par histologie est également présentée.

Résumé

Seule une petite fraction des anticorps thérapeutiques ciblant les maladies du cerveau sont absorbés par le cerveau. L’échographie focalisée offre la possibilité d’augmenter l’absorption des anticorps et l’engagement par l’ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Dans notre laboratoire, nous développons des approches thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives dans lesquelles un anticorps de différents formats est délivré à travers le BBB à l’aide de microbulles, en même temps que l’application d’ultrasons focalisés à travers le crâne ciblant plusieurs points, une approche que nous appelons échographie de balayage (SUS). Les effets mécaniques des microbulles et des ultrasons sur les vaisseaux sanguins augmentent le transport paracellulaire à travers la BHE en séparant transitoirement les jonctions serrées et améliorent la transcytose médiée par les vésicules, permettant aux anticorps et aux agents thérapeutiques de se croiser efficacement. De plus, l’échographie facilite également l’absorption des anticorps du cerveau interstitiel dans les cellules du cerveau telles que les neurones où l’anticorps se distribue dans tout le corps cellulaire et même dans les processus neurigineux. Dans nos études, des anticorps marqués par fluorescence sont préparés, mélangés à des microbulles à base de lipides préparées en interne et injectés à des souris immédiatement avant l’application du SUS sur le cerveau. L’augmentation de la concentration d’anticorps dans le cerveau est ensuite quantifiée. Pour tenir compte des altérations de l’homéostasie cérébrale normale, la phagocytose microgliale peut être utilisée comme marqueur cellulaire. Les données générées suggèrent que l’administration d’anticorps par ultrasons est une approche attrayante pour traiter les maladies neurodégénératives.

Introduction

L’échographie thérapeutique est une technologie émergente visant à traiter les maladies du cerveau de manière non invasive, en partie en facilitant l’accès des agents thérapeutiques au ^cerveau1,2,3. Comme seule une petite fraction des anticorps thérapeutiques ciblant les maladies du cerveau sont absorbés et retenus dans le ^cerveau4, les ultrasons thérapeutiques offrent la possibilité d’augmenter leur absorption et leur engagement ^cible5,6.

Dans notre laboratoire, nous développons des approches thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives dans lesquelles un anticorps de différents formats est délivré à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) à l’aide de microbulles. Pour ce faire, l’échographie est appliquée à travers le crâne dans le cerveau à plusieurs endroits en utilisant un mode de balayage que nous appelons échographie de balayage (SUS)⁷. L’interaction mécanique entre l’énergie ultrasonore, les microbulles injectées par voie intraveineuse et la vascularisation cérébrale sépare transitoirement les jonctions serrées du BHE dans un volume de sonication donné, permettant aux anticorps et autres cargaisons, y compris les agents thérapeutiques, de traverser efficacement cette ^{barrière7,8,9} . De plus, il a été démontré que les ultrasons facilitent l’absorption des anticorps du cerveau interstitiel dans les cellules du cerveau, telles que les neurones, où l’anticorps se distribue dans tout le corps cellulaire et même dans les processus neurigineux5,10.

La maladie d’Alzheimer est caractérisée par une pathologie β et tau ^amyloïde11, et une foule de modèles animaux sont disponibles pour disséquer les mécanismes pathogènes et valider les stratégies thérapeutiques. Une approche SUS, par laquelle l’échographie est appliquée de manière séquentielle sur l’ensemble du cerveau, lorsqu’elle est répétée au cours de plusieurs séances de traitement, peut réduire la pathologie de la plaque amyloïde dans le cerveau des souris mutantes de la protéine précurseur amyloïde β déposant l’amyloïde (APP) et activer la microglie qui absorbe l’amyloïde, conduisant à une amélioration de la fonction ^cognitive7. L’ouverture BBB avec ultrasons et microbulles réduit également la pathologie tau chez les souris transgéniques pR5, K3 et rTg4510 tau5,12,13. Il est important de noter que si les microglies éliminent les dépôts de protéines extracellulaires, l’un des mécanismes de clairance sous-jacents aux pathologies intraneuronales induites par le SUS est l’activation de l’autophagie ^neuronale12.

Ici, nous décrivons un processus expérimental, par lequel des anticorps marqués par fluorescence sont préparés, puis mélangés à des microbulles internes à base de lipides, suivis d’une injection rétroorbitaire dans des souris anesthésiées. L’injection rétroorbitaire est une alternative à l’injection de veine caudale qui, nous l’avons trouvée, est tout aussi efficace et plus simple à effectuer à plusieurs reprises. Ceci est immédiatement suivi par l’application de SUS au cerveau. Pour déterminer l’absorption d’anticorps thérapeutiques, les souris sont sacrifiées et l’augmentation de la concentration d’anticorps dans le cerveau est ensuite quantifiée. En tant que proxy du changement dans l’homéostasie cérébrale, l’activité phagocytaire microgliale est déterminée par l’histologie et la reconstruction 3D volumétrique.

Les données générées suggèrent que l’administration d’anticorps par échographie est une approche potentiellement attrayante pour traiter les maladies neurodégénératives. Le protocole peut être appliqué de la même manière à d’autres candidats médicaments, ainsi qu’à des cargaisons modèles telles que le dextrans marqué par fluorescence de tailles ^définies14.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’Université du Queensland.

1. Préparation interne des microbulles

1. Peser un rapport molaire de 9:1 de 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine et de 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylèneglycol)-2000] (sel d’ammonium). 0,5 mg de mélange lipidique est nécessaire pour 1 mL de solution de microbulles. Alternativement, les lipides peuvent être achetés déjà dans le chloroforme, si vous utilisez des lipides pré-dissous, passez à l’étape 1.3.
2. Dissoudre le lipide dans un petit volume de chloroforme dans un bécher en verre.
3. Évaporer le chloroforme avec un évaporateur ou un flux d’azote.
4. Réhydrater le film lipidique séché avec 10 mL de PBS + 10% de glycérol + 10% de solution de propylène glycol qui a été filtré à travers un filtre de 0,22 μm.
5. Placer la solution lipidique réhydratée dans un sonicateur au bain-marie réglé à 55 °C (au-dessus de la température de fusion des lipides) et soniquer jusqu’à dissolution complète.
6. Solution lipidique aliquote dans des flacons HPLC autoclavés de 1,5 mL et visser les capuchons septa.
7. Aspirer tout l’air dans le flacon avec une seringue de 5 mL équipée d’une aiguille de 27 G et créer un vide dans le flacon.
8. Ajouter l’octofluoropropane au flacon avec la seringue incluse, en aspirant le gaz de la cartouche. Remplissez le flacon avec 1-2 mL d’octafluoropropane en lisant le volume dans la seringue.
9. Sceller chaque flacon avec un film de paraffine et réfrigérer.
10. Le jour de l’expérience, amener le flacon à température ambiante, ajouter 0,5 mL de solution de NaCl à 0,9% au flacon, puis placer le flacon dans un amalgamateur et agiter pendant 45 s (temps prédéfini) pour produire les microbulles.

2. Contrôle de la qualité des microbulles à l’aide d’un compteur de coulter

1. Retirez la solution de microbulles de l’amalgamateur et évacuez le gaz du flacon en perçant les septa avec une aiguille de 19 G.
2. Diluer la solution de microbulles en effectuant des dilutions en série en deux étapes 1:5 000 en ajoutant 100 μL de solution de microbulles dans 5 mL de solution à écoulement filtré à l’aide d’une seringue de 1 ml avec aiguille de 19 G, puis en prenant 100 μL de solution de microbulles diluées 1:50 et en pipetant dans une solution à écoulement filtré de 10 mL dans une cuvette à l’aide d’une pipette.
3. Vérifiez que le réservoir d’électrolyte a une solution d’écoulement suffisante et que le réservoir de déchets est vide.
4. Placez la cuvette dans la plate-forme du comptoir coulter et verrouillez-la en place. Utilisez une ouverture de 30 μm pour l’acquisition d’échantillons.
5. Dans le logiciel, chargez le mode d’exploitation standard (SOM), puis sélectionnez Modifier la concentration de | SOM. Entrez la dilution 5000x.
6. Dans le logiciel, choisissez un nom de fichier approprié. Par exemple, microbubble_1_date.
7. Chargez et fixez la cuvette dans la plate-forme.
8. Dans le logiciel, sélectionnez Exécuter| Prévisualisez et vérifiez que la concentration de l’échantillon est inférieure à 10 %. Si ce nombre est supérieur à 10%, effectuez une nouvelle dilution des microbulles avec un facteur de dilution plus élevé.
9. Sélectionnez « Démarrer » pour commencer l’acquisition de l’échantillon afin d’obtenir la lecture initiale.
10. Rincez l’ouverture du compteur Coulter avec une solution d’écoulement filtrée après chaque mesure. Répétez les étapes 2.2 à 2.9 pour obtenir 3 réplications.
11. Placer une cuvette avec une solution de microbulles diluées dans un bain-marie sonique et sonicate pendant 30 s.
12. Mesurez la solution avec des microbulles soniquées et étiquetez-la comme étant vierge.
13. Dans le logiciel, soustrayez la lecture finale de la lecture initiale. Cela soustrait toutes les particules qui ne sont pas des microbulles et ne contiennent pas de gaz.
14. Sélectionnez Afficher les résultats dans le logiciel pour afficher la concentration en microbulles, la distribution de taille, la taille moyenne et la concentration en volume.

3. Marquage des anticorps fluorescents

1. Obtenir une solution de 1 mg/mL d’IgG de souris dans le PBS sans aucun additif.
2. Étiqueter 1 mg d’IgG de souris avec AlexaFluor 647 dans un tampon de bicarbonate de sodium de 0,1 M en suivant les instructions du fabricant situées dans le kit. Cette quantité d’IgG marquées par fluorescence est suffisante pour effectuer cette procédure sur 5 à 7 souris adultes où une dose de 5 mg / kg d’anticorps est administrée.
3. Ajouter le colorant à la solution d’IgG dans un tampon de bicarbonate de sodium de 0,1 M et incuber pendant 15 min à température ambiante.
4. Purifier l’anticorps marqué par fluorescence en pipetant la solution d’anticorps dans une colonne de spin et en centrifugant à 1 000 x g pendant 5 min. Le colorant libre restera dans le lit de la colonne.
5. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration en protéines. Mesurer l’absorbance de la solution conjuguée à 280 nm et 650 nm (A280 et A650). Calculer la concentration de protéines dans l’échantillon à l’aide de l’équation :
   Concentration en protéines (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x facteur de dilution / 203 000.
6. Utilisez un spectrophotomètre pour calculer le degré d’étiquetage à l’aide de l’équation :
   colorant moles par protéine mole = A650 x facteur de dilution / 239 000 x concentration en protéines (M).
   REMARQUE: Un degré acceptable d’étiquetage est de 3 à 7 moles de colorant par protéine de mole et le degré d’étiquetage généralement obtenu est d’environ 6.

4. Configuration de l’échographie

1. À l’aide du système à ultrasons focalisés, ajoutez l’espaceur de 5 mm au bol d’eau pour positionner le foyer à ultrasons à 9 mm sous le fond du bol d’eau.
2. Remplissez le bol d’eau avec environ 300 mL d’eau désionisée qui a été dégazée avec un dégazeur en ligne pendant 20 min (la teneur en oxygène doit être inférieure à 3 ppm). Placez le réseau annulaire dans le bolus d’eau rempli et utilisez un miroir dentaire pour vérifier qu’il n’y a pas de bulles d’air à la surface. S’il est présent à la surface, retirez le réseau annulaire et remplacez-le dans le bolus d’eau.
3. Lancez le logiciel d’application. Dans le menu Forme d’onde, sélectionnez Définir le rapport cyclique de la forme d’onde. Les réglages sont PRF (Hz) 10, rapport cyclique 10%, mise au point 80 mm, fréquence centrale 1 MHz, amplitude (pression négative de crête MPa) 0,65 MPa, indice mécanique = 0,65. Appuyez sur Définir pour définir la forme d’onde et la stocker en mémoire.
   REMARQUE: Le système à ultrasons focalisés est pré-étalonné par le fabricant à partir de mesures prises par un hydrophone étalonné.
4. Dans le logiciel du système d’échographie focalisée, définissez un plan de traitement. Cela nécessite de définir une région de traitement composée de plusieurs sites de traitement individuels et de définir les mesures à prendre dans chacun de ces sites de traitement. Dans ce cas, la zone de traitement est un hémisphère du cerveau de la souris.
5. Dans la fenêtre du contrôleur de mouvement, accédez à l’onglet Numérisation et entrez la valeur de début, d’arrêt et d’incrément pour le mouvement dans la dimension x, et la valeur de démarrage, d’arrêt et d’incrément pour le mouvement dans la direction y. Entrez les valeurs pour X: start -4, stop 3.50 et Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
6. Définir les actions pour les sites de traitement. Dans la fenêtre du contrôleur de mouvement, sélectionnez le bouton Événement . Dans la fenêtre d’édition de script, sélectionnez une liste d’actions qui seront exécutées dans l’ordre sélectionné sur chaque site de traitement. Définissez Type de mouvement sur Grille raster en haut de la fenêtre de script. Dans l’onglet Événements, sélectionnez Ajouter des actions pour les déplacer vers le panneau de script, puis ajoutez Déplacer de manière synchrone, Démarrer le déclencheur arb, Attendre, Arrêter le déclencheur arb. Cliquez sur l’action d’attente et sélectionnez un temps d’attente de 6 000 ms.
   REMARQUE: Ces réglages feront du traitement une grille de 6 x 5 points de traitement espacés de 1,5 mm, chaque point ayant une durée de traitement de 6 s. La durée totale pour soniquer le cerveau d’une souris est d’environ 3 min. Cette grille de traitement de taille convient aux souris adultes C57/Bl6 pesant environ 30 g. La taille de la grille de points de traitement peut être ajustée vers le haut ou vers le bas en fonction de la taille de la souris.

5. Préparation des animaux

1. Pesez la souris avec une balance précise à 0,1 g.
2. Anesthésier la souris avec 90 mg/kg de kétamine et 6 mg/kg de xylazine par voie intrapéritonéale. Testez l’absence de réflexes avec un pincement des orteils. Alternativement, les souris peuvent être anesthésiées avec de l’isoflurane à l’aide d’un appareil anesthésique par inhalation approprié avec un masque facial approprié. Si vous utilisez de l’isoflurane, la souris doit être placée sur un coussin chauffant pendant l’échographie pour prévenir l’hypothermie.
3. Utilisez un rasoir électrique pour raser les poils de la tête de l’animal, puis appliquez une crème dépilatoire avec un coton-tige, laissez agir pendant 2-3 minutes ou jusqu’à ce que les poils soient nettoyés avec un morceau de gaze humide. Veillez à ce que la crème dépilatoire ne pénètre pas dans les yeux de la souris.
4. Marquez le centre de la tête de la souris avec un marqueur permanent. Le transducteur a un trou en son centre et la mise au point et le point focal du transducteur peuvent être alignés visuellement.
5. Remplissez un petit bateau de pesage dont le fond a déjà été coupé et remplacé par une pellicule de plastique collée au fond du bateau de pesée avec du gel à ultrasons. Cela sert d’entretoise de 8 mm et fournit un bon couplage à la tête de la souris et permet une inspection visuelle de la mise au point du transducteur aligné avec la tête de la souris.

6. Préparation des microbulles

1. Réchauffer un flacon de microbulle à température ambiante. Pour activer, ajouter 0,5 mL de solution de NaCl à 0,9% au flacon et placer dans un amalgamateur pour agiter pendant 45 s pour produire les microbulles.
2. Ventilez le flacon en perçant les septa avec une aiguille de 27 G.

7. Traitement par ultrasons

1. Inverser le flacon de microbulles et aspirer doucement 1 μL/g de poids corporel de la solution. À cela, ajoutez une solution d’anticorps marqués par fluorescence et mélangez doucement dans la seringue. Le volume maximal injecté est de 150 μL.
   REMARQUE : Les microbulles préparées à l’interne sont environ 60 fois moins concentrées que les microbulles utilisées cliniquement (p. ex., les microbulles Definity). Ajuster le volume ou la concentration de manière à ce que le nombre de microbulles injectées soit similaire à celui utilisé cliniquement (c.-à-d. Définition 1,2 x ¹⁰⁸ microbulles/kg de poids corporel).
2. Injecter la solution de microbulles et d’anticorps rétroorbitalement, en prenant soin d’injecter doucement et lentement. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.
3. Placez la souris dans le porte-tête (voir Tableau des matériaux) et fixez le nez de la souris. Ensuite, placez le petit bateau de pesage rempli de gel à ultrasons sur le dessus de la tête.
4. Abaissez le bolus d’eau jusqu’à ce qu’il repose sur le gel à ultrasons dans le bateau de pesée.
5. Utilisez le joystick pour déplacer la mise au point du transducteur vers le centre de la tête. Sélectionnez Réinitialiser l’origine dans l’onglet Mouvement.
6. Sélectionnez Terminer l’analyse. Les étapes 7.3 à 7.6 prendront 2 min.
7. Pour plus de cohérence, réglez une minuterie pour assurer un délai de 2 minutes entre l’injection de microbulles et la sélection du scan complet.
8. Une fois le traitement terminé, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux et placez la souris dans une chambre de récupération chauffée. Si une hypothermie est observée pendant la procédure, un coussin chauffant peut être placé sous la souris pour fournir une chaleur supplémentaire pendant la procédure.

8. Prélèvement et transformation des tissus

1. Au moment de l’intérêt après l’accouchement par échographie (au moins 1 h pour détecter des niveaux élevés d’anticorps dans le cerveau), anesthésier en profondeur la souris avec un surdosage de solution de pentobarbitone (100 mg / kg) et perfuser la souris avec 30 mL de PBS. Une bonne perfusion est nécessaire pour détecter spécifiquement les anticorps marqués par fluorescence qui ont été délivrés au cerveau.
2. Recueillir le cerveau et fixer par immersion dans 4% de PFA pendant 24 h à 4 °C, puis laver avec du PBS.
3. Imagez le cerveau dans un scanner infrarouge en plaçant le cerveau sur le plateau et en acquérant une image dans le canal 700 nm.
   REMARQUE: Après la fixation, le cerveau est retiré du PFA, lavé dans pbS et sectionné. Alternativement, il peut être placé dans une solution cryoprotectrice d’éthylène glycol pendant 24 h à 4 °C ou jusqu’à ce qu’il soit immergé, puis déplacé vers un nouveau flacon contenant un cryoprotecteur et placé à -20 °C pour un stockage à long terme.
4. Coupez le rhume cérébral dans PBS à l’aide d’un vibratome. Collez le cerveau à la plate-forme et coupez des sections de 30 à 40 μm et collectez-les dans PBS.
   REMARQUE: L’autofluorescence lysosomale (répandue dans les sections d’animaux âgés de plus de 12 mois environ) doit être blanchie par un éclairage nocturne des sections dans une boîte à chambre à lumière, à température ambiante et dans du PBS contenant de l’azoture (0,02%) pour bloquer la croissance bactérienne.

9. Coloration tissulaire et acquisition d’images

1. Transférer les sections dans la solution bloquante (5% de BSA dans 0,2% de Triton/PBS) pendant 2 h à température ambiante, puis laver les sections 3x en remplaçant la solution par 0,2% de Triton/PBS.
2. Incuber des coupes à 4 °C pendant la nuit avec les anticorps primaires contre Iba1 (dilution 1:1 000) et CD68 (dilution 1:500), dans 0,2 % Triton/PBS, suivies de 3x lavages avec 0,2 % Triton/PBS.
3. Incuber des sections pendant 2 h à température ambiante avec des anticorps secondaires fluorescents (dilution 1:500), suivies de 3x lavages avec 0,2% de Triton/PBS uniquement.
   REMARQUE: Les noyaux peuvent également être colorés à l’aide d’une solution de DAPI (0,5 μg / mL).
4. Transférez les sections sur une glissière et un couvercle avec un support de montage rigide. Prévoyez suffisamment de temps pour que le support de montage se solidifie avant la visualisation et l’acquisition d’images (pendant la nuit).
5. Avec un microscope confocal, obtenez des images z-stack (au moins 10 μm de profondeur et 0,3 μm de taille de pas, 10 images par animal) de la zone cérébrale ciblée par ultrasons à l’aide d’un microscope confocal et d’un objectif d’un grossissement d’au moins 40x.
   REMARQUE: Veillez à acquérir des images dans la plage dynamique du signal, en évitant la sous-exposition / surexposition. Enregistrez les fichiers image dans le format logiciel correspondant utilisé par le microscope.

10. Analyse d’images

1. Convertissez les fichiers de microscopie z-stack à l’aide de l’importateur de fichiers du logiciel d’analyse d’images.
2. Ouvrez les fichiers convertis dans le logiciel et ajustez l’intensité du canal Iba1 pour observer les cellules microgliales.
3. Recadrez une seule cellule microgliale en dessinant une boîte autour d’elle, sélectionnez 'recadrer' et enregistrez le nouveau fichier.
4. Construisez le rendu de surface 3D du signal IBA1 en :
   1. Ouvrez le fichier Imaris à cellule unique généré à l’étape précédente.
   2. Ajoutez une surface au fichier.
   3. Sélectionnez le canal correspondant à la coloration Iba1.
   4. Appliquer un seuil qui devrait chevaucher la coloration Iba1
   5. Sélectionnez uniquement la structure d’intérêt qui forme la cellule microgliale d’intérêt
5. Finaliser le processus
   1. Obtenir et enregistrer le volume de la coloration Iba1
   2. Construire le rendu de surface 3D de la coloration CD68
   3. À l’intérieur du sous-fichier de surface IBA1, masquez le canal CD68 et retirez les voxels à l’extérieur de la coloration IBA1
   4. Ajouter une nouvelle surface au fichier
   5. Sélectionnez le canal correspondant à la coloration CD68
   6. Appliquer un seuil qui doit chevaucher la coloration CD68 et qui correspond le plus possible aux volumes de coloration
   7. Finaliser le processus, car seules les structures cd68 intra-microgliales seront présentes dans ce fichier et, par conséquent, elles ne nécessitent pas une autre étape de filtrage de seuil
   8. Obtenir et enregistrer le nombre et le volume moyen des structures positives CD68
   9. Calculer le volume relatif des structures CD68 selon ses structures IBA1 correspondantes comme mesure de l’activation microgliale à l’état phagocytaire.

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Résultats

En utilisant ce protocole, des anticorps marqués par fluorescence sont délivrés au cerveau et peuvent être détectés, ainsi que l’activation de la microglie. La conclusion que l’on peut tirer est que l’utilisation d’ultrasons focalisés et de microbulles améliore considérablement l’absorption des anticorps par le cerveau et peut délivrer des anticorps à l’ensemble du cerveau ou de l’hémisphère d’une souris lorsqu’elle est utilisée en mode de balayage. La figure 1

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Discussion

Les anticorps marqués par fluorescence peuvent être délivrés au cerveau à l’aide d’ultrasons focalisés et de microbulles appliquées en mode balayage. L’administration d’anticorps, la morphologie microgliale et l’élargissement lysosomal peuvent être détectés par microscopie à fluorescence après une échographie à balayage. Les microglies peuvent absorber dans leurs lysosomes des anticorps et des antigènes auxquels les anticorps se sont liés dans un processus médié par le récepteur

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti	850365C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647 antibody labeling kit	Thermo Fisher	A20186
CD68 antibody	AbD Serotec	MCA1957GA	Use 1:1000 dilution
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Coulter Counter (Multisizer 4e)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo FIsher	A-11008	Use 1:500 dilution
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11077	Use 1:500 dilution
head holder (model SG-4N, Narishige Japan)
Iba1 antibody	Wako	019-19741	Use 1:1000 dilution
Image analysis software	Beckman Coulter	#8547008
Isoflow flow solution	Beckman Coulter	B43905
Near infrared imaging system Odyssey Fc	Licor	2800-03
Octafluoropropane	Arcadophta	0229NC
Propylene Glycol	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS (Therapy Imaging Probe System)	Philips Research	TIPS_007
	Bitplane