هجرة خدش فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكيف

Summary

نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة لجراتش الهجرة التي توفر نهجا جديدا لتحديد هجرة الخلايا دون استخدام أساليب مكثفة المعدات. في حين تم استخدام الخلايا الليفية في هذا البروتوكول، يمكن تكييفها واستخدامها لدراسة أنواع الخلايا الإضافية والتأثيرات على ترحيل الخلايا.

Abstract

تعد هجرة الخلايا مكونًا أساسيًا في الأحداث الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. مطلوب ترحيل الخلايا العادية لوظائف أساسية مثل تطوير وتركيب استجابة مناعية. عندما يحدث خلل أو تغيير مع عملية هجرة الخلية ، يمكن أن يكون له نتائج ضارة (أي الانبثاث السرطاني ، والتئام الجروح ، وتشكيل الندبة). نظرا لأهمية هجرة الخلايا، فمن الضروري أن يكون الوصول إلى خلية الهجرة فحص بأسعار معقولة، والتكيف، وتكرار. الاستفادة من اختبار الهجرة الصفر المشتركة، وضعنا نهجا جديدا لتحليل الهجرة الخلية التي تستخدم معدات المختبرات العامة. تستخدم الطريقة الموصوفة علامات بصرية تسمح باستعادة مناطق محددة ذات أهمية دون استخدام المجهر الفاصل الزمني. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر المرونة في التصميم التجريبي، بدءا من تغيير الركيزة مصفوفة الهجرة إلى إضافة المعدلات الدوائية. وعلاوة على ذلك، يحدد هذا البروتوكول طريقة لحساب منطقة ترحيل الخلايا، والتي لا يتم اعتبارها من قبل عدة طرق عند فحص ترحيل الخلايا. يقدم هذا النهج الجديد اختبارًا للهجرة الصفرية لجمهور أكبر وسيتيح فرصة أكبر للباحثين لفحص التأثير الفسيولوجي والفيزيولوجي لهجرة الخلايا.

Introduction

تعد هجرة الخلايا أمرًا حاسمًا للعديد من الأحداث الفسيولوجية وكذلك المرضية. وهو مطلوب أثناء التطوير ، لتركيب استجابة مناعية ، ولتضميد الجروح المناسبة^1،2،3. ويمكن أن يتم تشغيل العديد من هذه الأحداث الهجرة الخلية عن طريق الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية. على سبيل المثال، أثناء الاستجابة المناعية، سوف تنتقل الكريات البيض نحو موقع الإصابة استجابة لـ^2. بالإضافة إلى ذلك، الكريات البيض سوف تطلق أيضا السيتوكينات للحث على الهجرة من الخلايا المناعية إضافية، فضلا عن أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية، التي تشارك في عملية التئام الجروح، وبالتالي، بدء استجابة متعددة الخلايا⁴. قدرة الخلايا على الهجرة ضرورية لوظيفة فسيولوجية مناسبة; ومع ذلك ، عندما يذهب هجرة الخلايا دون رادع ، يمكن أن يكون لها استجابة سلبية وتساهم في الأحداث المرضية ، مثل الالتهاب المزمن ، وأمراض الأوعية الدموية ، ونقائل السرطان ، وضعف التئام الجروح^{2،3،4،5،6،7}. التئام الجروح الضعيفة هي إصابة شائعة لمرضى السكري بسبب عيوب في هجرة الخلايا ، وإذا لم يتم معالجة هذه العيوب ، فقد يؤدي ذلك إلى مزيد من المضاعفات (على سبيل المثال ، بتر^8،9). وقد أشارت هذه الدراسة، فضلا عن غيرها، إلى الحاجة إلى زيادة فهم العملية التي تحدث بها هجرة الخلايا، إما في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية العادية، وهي حيوية لتعزيز هذا المجال من البحوث. ولتحقيق ذلك، يجب أن تكون هناك مقايسات للهجرة متاحة يمكن الوصول إليها وبتكلفة معقولة للباحثين، الذين قد لا يمتلكون المعدات اللازمة لإجراء هذه الأقوال.

حاليا، هناك مجموعة متنوعة من المقايسات الهجرة المتاحة لدراسة مجموعة واسعة من المواضيع المتعلقة بهجرة الخلايا. وقد تم تطوير كلا من نموذجي الهجرة 2D و 3D، كل منهما يستهدف مناطق محددة تؤثر على هجرة الخلايا. ترتبط نماذج الهجرة ثلاثية الأبعاد عادةً بدراسات غزو الخلايا وتقييم تأثير المصفوفة خارج الخلية على هجرة الخلايا^10،11،12، في حين أن مقايسات الهجرة 2D لديها نطاق أكبر من التطبيق وتستخدم في المقام الأول لدراسة الهجرة الكيميائية ، والتئام الجروح ، والتغيرات الوظيفية أثناء هجرة الخلايا^{13،14،15،16}. العديد من هذه المقايسات تتطلب معدات إضافية، مثل غرف بويدن أو حلقات الاستبعاد، والتي يمكن أن تقلل من توافر هذه المقايسات لبعض الباحثين. واحدة من أكثر فعالية من حيث التكلفة المقايسات هو الخدش المقايسة، والذي يستخدم عادة لتقييم التئام الجروح والتغيرات العامة في هجرة الخلايا^14،17. وفي حين أن معظم المختبرات مجهزة لإجراء فحص الخدش، فإن المعدات المستخدمة لتتبع هجرة الخلايا تميل إلى أن تكون إما غير متوفرة أو مكلفة للغاية لا يمكن شراؤها. وهذا يشمل المجهر الفاصل الزمني، الذي يتطلب مجهر مقلوب ونظام تصوير حي. هذه القطع باهظة الثمن من المعدات ليست متاحة عادة لكل مختبر. ولذلك، تبرز هذه الملاحظة الحاجة إلى بروتوكول جديد يسمح بتقييم هجرة الخلايا بمعدات أكثر سهولة.

البروتوكول المعروض هنا يوفر طريقة جديدة وبأسعار معقولة لتقييم ترحيل الخلايا. ويتبع هذا الأسلوب نفس الإجراء المرتبط بمجرّدات الخدش ولكنه يختلف في تحليل فحص هجرة الخلايا باستخدام معدات أكثر شيوعًا متوفرة في بيئة مختبرية للعلوم الأساسية. يسمح هذا البروتوكول باستخدام المعدات الشائعة بتحديد أكثر دقة لترحيل الخلايا دون استخدام المجهر الفاصل الزمني. بالإضافة إلى تحديد الترحيل، هذه الطريقة أيضاً مسؤولة عن عوامل متغيرة في منطقة الخدش التي تم ملاحظتها إلى تأثير كبير على ترحيل الخلايا. وعموما، فإن هذا البروتوكول الجديد لتحليل هجرة الخلايا يتيح فرصة لمزيد من المختبرات لاستكشاف مجال هجرة الخلايا والمساهمة في هذا المجال.

Protocol

1- ثقافة الخلايا العامة

1. الخلايا الليفية القلبية في دولبيككو النسور المعدلة المتوسطة (DMEM) التي تحتوي على 1 غرام / لتر الجلوكوز، بيروفات الصوديوم، L-الجلوتامين، ومكملة مع 14.2 mM NaHCO₃، 14.9 mM HEPES، 15٪ تنشيط الحرارة مصل الأبقار الجنين (FBS)، 2٪ L-الجلوتامين، و 0.02٪ كاشف مضاد للميكروبات (انظر جدول المواد)والحفاظ عليها في CO₂ حاضنة في 37 درجة مئوية.
2. يتم الوصول إلى الخلايا الليفية القلبية حتى 90-95٪ التقاء عند مرور 0 (P0). عند هذه النقطة الخلايا الليفية على استعداد لتقسيمها إلى لوحة 48-جيدا، والذي يستخدم لمجرحة الهجرة.

2 - إعداد لوحة الهجرة

1. إعداد لوحة ثقافة خلية 48-well عن طريق رسم خط، وذلك باستخدام علامة دائمة صفراء أو فاتحة اللون، أسفل مركز البئر. ثم، رسم ثلاث علامات التجزئة تقسيم البئر إلى ثلاثة مجالات منفصلة من الاهتمام. سيتم استخدام هذه الأقسام للتصوير.
   ملاحظة: إن استخدام علامة لون فاتح دائم يسمح بسهولة تصوير الخلايا المهاجرة. ستمنع العلامات الداكنة مثل الأسود أو الأزرق من عرض مرئي للخلايا المهاجرة.
2. إذا كان تقييم الهجرة على ركيزة (مثل الكولاجين)، معطف البئر في هذا الوقت اتباع التعليمات والتركيزات المستخدمة للركيزة محددة.
3. لوحة ~ 15،000-20،000 الخلايا الليفية القلبية، P1، في كل بئر والخلايا الثقافة، في ظل ظروف الزرع العادية (الظروف المذكورة في القسم السابق)، حتى تصل إلى 90-95٪ التقاء. وينبغي الوصول إلى التقاء بين 24-48 ساعة.
   ملاحظة: عند إعداد لوحة الترحيل تأكد من تضمين عنصر تحكم موجب (خلية مهاجرة معروفة، مثل خلايا 3T3^18)،عنصر تحكم سالب (خلايا غير مُنصفة) و كذلك فارغ.

3. خدش الهجرة المقايسة والتشطيب

1. مرة واحدة الخلايا تصل إلى 90-95٪ التقاء، وإزالة وسائل الإعلام والخدش على طول خط رسم باستخدام تلميح P200 ماصة عقيمة.
   ملاحظة: A P200 ماصة تلميح هو تلميح ماصة مشتركة الحجم المستخدمة مع المقايسة الصفر^10،14،19. أيضاً، جعل تمريرة واحدة فقط مع تلميح P200 كما قد ينتج عن أكثر من محاولة واحدة خطوط الصفر متعددة.
2. شطف جيدا مع وسائل الاعلام المصل منخفضة (1.5٪ FBS) لإزالة أي الخلايا الليفية القلبية غير المرتبطة.
3. إضافة 500 μL من وسائل الاعلام المصل منخفضة لكل بئر. إذا كان استخدام أي عوامل دوائية، إضافتها في هذا الوقت.
   ملاحظة: يتم استخدام وسائط المصل المنخفضة لأنه يسمح / يعزز الهجرة الخلية أن يحدث ويمنع الخلايا الليفية من الانتشار الذي يمكن أن ينحرف نتائج الهجرة²⁰. لهذا البروتوكول، تم استخدام 1.5٪ FBS.
4. التقاط 0 ح الصور قبل احتضان الخلايا الليفية في 5٪ CO₂ حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   1. التقاط صور 0 ح باستخدام مجهر مقلوب مع هدف 20x. اتخاذ اثنين من الصور 0 ح في البئر. وسيتيح ذلك تغطية أكثر اكتمالا لخط الهجرة.
   2. باستخدام علامات (خط وشرطات)، وضع البئر لالتقاط النصف العلوي من خط الصفر. تجنب تصوير شرطة الأوسط للتأكد من أن نفس المنطقة من الهجرة لا يتم تصويرها مرتين، مما قد يؤدي إلى انحراف النتائج.
   3. استخدام برامج التصوير (جدول المواد) لالتقاط 0 ح صورة #1. ثم نقل لوحة لوضع النصف السفلي من بئر / خط الصفر في ضوء الكاميرا. مرة أخرى، تجنب التقاط شرطة الأوسط. مرة واحدة في مكان، والتقاط 0 ح صورة #2 (الشكل 1).
      ملاحظة: يؤدي تجنب اندفاعة الأوسط في كل من الصور 0 h إلى منع التقاط مناطق الترحيل مرتين والتي إذا تم ذلك يمكن أن تؤدي إلى تكرار النتائج وحرف البيانات.
5. بعد احتضان لمدة 24 ساعة ، وإزالة وسائل الإعلام من البئر ، وغسل البئر مع 1x غير الهستيري PBS (من الآن فصاعدا كل 1X برنامج تلفزيوني المستخدمة غير الهستيري).
6. في غطاء الدخان، إضافة 500 μL من 4٪ شبهformaldehyde إلى البئر واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
7. إزالة paraformaldehyde وغسل 3x مع 1X PBS لمدة 5 دقائق كل في RT.
8. مرة واحدة يتم غسلها الخلايا، والمضي قدما في التقاط الصور 24 ح أو إضافة 1X برنامج تلفزيوني لكل بئر ومكان في 4 درجة مئوية حتى وقت لاحق. يمكن أن تبقى الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع حتى تصبح جاهزة للصورة.
   1. Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من حل permeabilizing (1X برنامج تلفزيوني و 0.01٪ تريتون X-100) إلى كل بئر. احتضان الخلايا / لوحة مع لطيف، هزاز المستمر لمدة 30 دقيقة في RT.
   2. إزالة حل permeabilizing وإضافة 1٪ Coomassie وصمة عار الأزرق الرائعة (3٪ Coomassie الأزرق الرائعة، 10٪ حمض الخليك، 45٪ الميثانول، و 45٪ dH₂O) لمدة 10 دقيقة مع لطيف، وهزاز مستمر في RT.
      ملاحظة: إذا كانت اللوحات مغلفة بركيزة مصفوفة خارج الخلية تأكد من اختبار لوحة مغلفة مع تلطيخ Coomassie قبل إجراء اختبار الترحيل. ويبين الشكل 2 أنه يمكن استخدام الركيزة مصفوفة مع هذا الفحص وليس تأثير التصور من الخلايا.
   3. غسل الآبار 3x مع 1X برنامج تلفزيوني في RT مع هزاز مستمر لمدة 5 دقائق لكل من.
   4. بعد يغسل، وأضاف 300 μL من 1X برنامج تلفزيوني والتقاط 24 صور ح.
   5. التقاط الصور 24 ح عن طريق محاذاة البئر في نفس الموقف الذي كان يستخدم لالتقاط الصور 0 ح. من أجل تحقيق ذلك، فتح الصور 0 ح التي تم التقاطها سابقا واستخدام علامات مصنوعة من علامة دائمة، محاذاة البئر في نفس الموقف. الخط أسفل الأوسط وعلامات اندفاعة إضافية ينبغي أن تسمح محاذاة وثيقة بين صورة 24 ح وصورة 0 ح(الشكل 1).

4. إعداد 0 ح و 24 ح الصور

1. فتح 0 ح و 24 ح الصور التي اتخذت من نفس جيدا والموقف في برامج التصوير (جدول المواد).
2. إنشاء طبقة جديدة على صورة 0 h. ثم انقر فوق الطبقة الجديدة وقم بتغيير اسم الطبقة إلى "طبقة الخط" بالنقر المزدوج على النص.
   ملاحظة: هذه الطبقة سوف يشار إليها على أنها طبقة خط من هذه النقطة فصاعدا.
3. انقر على أداة الفرشاة (رمز الفرشاة) ثم قم بتعيين الحجم في 10 بكسل واللون إلى الأحمر.
4. مع طبقة الخط المحدد، رسم اثنين، خطوط منفصلة التي تحدد مساحة نقطة الصفر. يجب ألا تلمس الخطوط أي خلايا بسبب هذه الخطوط التي تشير إلى منطقة الهجرة.
5. انقر على أداة النقل (رمز السهم) ثم اضغط لأسفل Ctrl زر وانقر على كل من طبقات الخط والخلفية.
6. انقر في منتصف صورة 0 h واسحب كلتا هاتين الطبقتين إلى منتصف الصورة 24 h.
7. الآن باستخدام 24 ح الصورة، انقر على طبقة خلفية 0 ح وتغيير التعتيم إلى 50٪.
8. عقد على زر Ctrl، انقر على كل من 0 h الخلفية وطبقة الخط ثم تحويل الحرة الطبقات(تحرير> تحويل الحرة). باستخدام التحول الحر، محاذاة 0 ح الخلفية وصورة خط إلى 24 ح صورة الخلفية. هذه الخطوة ينتج عنه تراكب 0 h و 24 h الصورة، وهو أمر ضروري لوضع الخطوط التي تميز منطقة الهجرة في الموضع الصحيح على صورة 24 h.
9. بعد تراكب ناجح لطبقات الخلفية وخط 0 h على صورة خلفية 24 h، احذف طبقة الخلفية 0 h. حذف عن طريق النقر على طبقة خلفية 0 ح، ثم انقر بزر الماوس الأيمن، وانقر على حذف طبقة.
10. حذف 0 ح صورة خلفية سيترك فقط الخط و طبقة خلفية 24 ح (يشار إليها الآن باسم صورة الهجرة). وستشير طبقة الخط إلى مساحة الترحيل/الخدش على صورة 24 ساعة ويمكن استخدامها لتحديد عدد الخلايا المهاجرة.
11. حفظ صورة الترحيل الجديد كملف Photoshop و TIFF / JPEG. ملاحظة: يتم عرض شخصية تمثيلية تصور هذه العملية في الشكل 3.

5. عد عدد الخلايا المهاجرة

1. افتح صورة الترحيل. يمكن القيام بذلك في برنامج يقبل ملفات TIFF/JPEG(جدول المواد).
2. حساب عدد الخلايا التي تقع في بين وكذلك لمس الخطين الأحمرين.
3. تسجيل عدد الخلايا التي يتم ترحيلها لكل صورة. سيكون هناك صورتان مُنهجتان في البئر، ولا ينبغي دمج هذه القيم إلا بعد تصحيح القيم لمنطقة الترحيل (مفصلة في القسم التالي).

6- تحديد منطقة الهجرة

1. فتح صورة 24 ح التي تحتوي على خطوط الهجرة في برنامج التصوير في قسم 5 (جدول المواد).
2. حفظ كـ هذه الصورة كـ "صورة منطقة الترحيل".
3. بعد الحفظ، انقر فوق طبقة الخلفية، وانقر بزر الماوس الأيمن، وانقر على حذف الطبقة. هذا ينبغي ترك فقط خطوط الصفر على الصورة (الشكل 3).
4. باستخدام أداة فرشاة (رمز فرشاة) ملء في المنطقة بين خطوط الصفر. قم بطابق لون الفرشاة مع اللون المستخدم لرسم خطوط الترحيل.
5. تغيير الصورة إلى تدرج الرمادي لإنشاء صورة بالأسود والأبيض(صورة> وضع> الرمادي)ثم حفظ الصورة (الشكل 4).
6. بدء برنامج التحليل (جدول المواد) ثم افتح ملف "منطقة الهجرة" ضمن برنامج التحليل.
7. لتحديد مساحة بند الترحيل، انقر فوق Image>Adjust>Threshold. سيتم تحويل منطقة الترحيل السوداء إلى اللون الأحمر وسيتم الإشارة إلى النسبة المئوية في المربع Threshold. سيتم الإبلاغ عن المنطقة على أنها النسبة المئوية للمنطقة التي يغطيها خط الهجرة مقارنة بالمنطقة بأكملها التي تم التقاطها في الصورة.
8. قم بتسجيل ناحية النسبة المئوية لخط الترحيل وتأكد من أن هذه القيمة مقترنة بعدد الخلايا التي يتم ترحيلها لنفس الصورة.

7 - تحليل البيانات

1. تطبيع عدد الخلايا التي يتم ترحيلها إلى منطقة النسبة المئوية للخدش. تقسيم عدد الخلايا المُهاجرة على مساحة النسبة المئوية لخط الترحيل (# الخلايا التي تم ترحيلها ٪ منطقة الترحيل). القيام بذلك لكل صورة وليس متوسط على أساس الهجرة في البئر.
2. بعد تطبيع القيم لكل صورة، أضف قيم الصورتين، التي تمثل بشكل جيد فردي. سيتم استخدام هذه القيمة للتحليل الرسومي والإحصائي. إذا احتوى التصميم التجريبي على نسخ متماثلة متعددة. متوسط القيم المتماثلة قبل التحليل الإحصائي.

النتائج

يوثق هذا الإجراء نهجًا جديدًا لدراسة ترحيل الخلايا، وهو نهج فعال من حيث التكلفة وقابل للتكيف بسهولة بالنسبة لمعظم المختبرات. وقد استخدمت العديد من الدراسات مجهرية الفاصل الزمني لتقييم هجرة الخلايا، ولكن المعدات اللازمة لهذه الطريقة ليست متاحة بسهولة للعديد من المختبرات. في حين أن استخد?...

Discussion

هذا النهج الجديد لاختبار الهجرة الصفر يوفر وسيلة أكثر سهولة للباحثين لدراسة التغيرات في هجرة الخلايا. في حين أن هذا الفحص يتبع نفس الإجراء لإدارة خدش مشابه لتشاتد الخدوش الأخرى ، فإنه يوفر طريقة جديدة للتصوير والتحليل الدقيق لهجرة الخلايا¹⁰. بدلاً من استخدام أساليب مكثفة الم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase